СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОЙ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2013 года по МПК A61K33/00 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения острой лучевой болезни.

Легкоизотопная вода (ЛВ) - вода, частично очищенная от дейтерия и тяжелых изотопов кислорода, относительно недавно упоминается в качестве биологически активного вещества [1]. Очистка воды от изотопов дейтерия, а также ¹⁷O и ¹⁸O достигается методом ректификации или воду синтезируют сжиганием очищенных изотопов протия ¹Н и ¹⁶О. При этом концентрация дейтерия снижается со 145-150 ppm в обычной водопроводной воде до 30-35 ppm.

При пониженном содержании дейтерия в питьевой воде отмечают стимулирующее действие на жизненные процессы. При длительном наблюдении за растениями и животными, потреблявшими воду, в которой содержалось дейтерия на 25% ниже естественного содержания, оказалось, что свиньи, крысы и мыши дали потомство, гораздо многочисленнее и крупнее обычного, вдвое увеличилась яйценоскость кур, ускорялось созревание и урожайность пшеницы [2].

По данным [3, 4], вода с содержанием дейтерия на уровне 130-135 ppm увеличивает как всхожесть, так и скорость развития проростков семян бобовых, подсолнечника и пшеницы.

Показано, что совокупная семенная продукция при культивировании растения Arabidopsis Thaliana и Brassica в воде с пониженным содержанием дейтерия существенно больше в сравнении с тяжелоизотопной водой. В эксперименте тестировалась вода с различным соотношением легких и тяжелых изотопов [5].

В работе [6] было определено оптимальное соотношение D/H - 75-125 ppm, при котором выживаемость инфузорий максимальна.

В экспериментах, выполненных на аутбредных (сток CD-I) и инбредных мышах-самцах гибридах (CBA·C57B1)F1, установлено, что под влиянием приема «легкой» воды происходит временное, на протяжении 7-14 дней, ускорение роста массы тела животных, на 7-е - 8-е сутки эксперимента отмечено увеличение числа лейкоцитов в периферической крови и клеточности костного мозга необлученных животных [7].

Имеются сообщения о радиопротекторном (введение до облучения) действии ЛВ перед облучением в летальных [8] и нелетальных [9] дозах ионизирующего излучения.

Поскольку предсказать время казуистического облучения человека маловероятно, практическое значение имеет средство, оказывающее действие при введении после облучения.

Целью настоящего изобретения является исследование и доказательство возможности лечебного (введение после облучения) использования ЛВ, полученной ректификационным методом, при лучевом поражении организма, вызывающем острую лучевую болезнь.

Технический результат заключается в повышении выживаемости облученных животных, сохранении их массы тела, ускорении восстановления нарушенного облучением кроветворения.

Для достижения поставленной цели изучено влияние ЛВ на выживаемость, гемопоэз и восстановление массы тела облученных мышей и крыс. В ходе исследования установлено, что ЛВ при использовании после облучения способна существенно увеличивать выживаемость, ускорять восстановление гемопоэза и массы тела облученных животных.

В эксперименте использовали ЛВ, полученную ректификационным методом из московской водопроводной воды [10]. Содержание дейтерия в ЛВ составило 35-90 ppm, судя по результатам лазерной спектрометрии [11].

Установка для получения легкой воды [10] включает ректификационную колонну, которая содержит контактное устройство для увеличения поверхности при взаимодействии пар - жидкость, при этом содержание ¹Н₂ ¹⁶О в легкой воде составляет не менее 997,13 г/кг от общего количества Н₂O, а суммарное содержание ¹H₂, ¹⁷О, ¹H₂, ¹⁸O, ¹HD¹⁷О, ¹HD¹⁸O, D₂, ¹⁶О, D₂ ¹⁷О, D₂ ¹⁸O в легкой воде составляет не более 2,87 г/кг от общего количества Н₂О

Использованный нами метод получения воды позволяет получить воду, очищенную от дейтерия, до концентрации 0 ррm, хотя в проводимых исследованиях мы использовали воду с ррm 35 и 90. Также полученная нами вода максимально очищена от солей и других примесей и поэтому наиболее адекватным контролем в этом случае является дистиллированная вода, тоже очищенная от солей.

Легкоизотопная вода в настоящем изобретении представляет собой высокочистую воду с большим содержанием легких молекул ¹Н₂ ¹⁶О, при этом содержание легких молекул ¹Н₂ ¹⁶О в полученной легкой воде составляет не менее 99,734% от общего количества Н₂O.

Также легкоизотопная вода в настоящем изобретении отличается тем, что содержание легких молекул ¹Н₂ ¹⁶О в полученной легкой воде составляет не менее 997,08 г/кг от общего количества Н₂О; концентрация D составляет не более 138 ppm; концентрация ¹⁷O составляет не более 372 ppm; концентрация ¹⁸О составляет не более 1960 ppm; значение δD находится в диапазоне от $$-994\raisebox{1ex}{$0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$00$}\right.$$ до $$-114\raisebox{1ex}{$0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$00$}\right.$$ , значение δ¹⁸О находится в диапазоне от $$-500\raisebox{1ex}{$0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$00$}\right.$$ до -22.

Лечебная эффективность ЛВ была изучена в опытах на 80 аутбредных мышах CD-I, самцах и самках, с исходной массой тела 31-34 г и 40 крысах-самцах породы Вистар с исходной средней массой тела 280-360 г. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляли по полу и массе тела.

Животных облучали тотально γ-квантами ⁶⁰Со на установке Рокус-М (мощность дозы 0,21-1 Гр/мин) в дозах 5 Гр и 6,5 Гр. В результате облучения у животных развивалась костномозговая форма острой лучевой болезни.

Подопытным животным сразу после облучения в качестве питьевой воды давали в свободном доступе ЛВ с ppm 35 и 90, которую они получали до конца эксперимента. Контрольные нелеченые облученные животные получали дистиллированную воду (ДВ) с ppm 144. Необлученные животные, биоконтроль (БК), получали также ДВ.

Влияние ЛВ на статус облученных животных оценивали по их выживаемости в течение 30 суток после облучения, а также по динамике массы тела. Состояние гемопоэза определяли на 8 сутки после облучения мышей дозой 5 Гр по числу ядросодержащих клеток в костном мозге бедренной кости, числу эндогенных колониеобразующих единиц в селезенке, выявляемых по Буэну, и числу лейкоцитов в периферической крови.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованем программного комплекса Microsoft Office Excel 2007.

При статистической обработке экспериментальных данных рассчитывали среднее арифметическое значение показателей и их стандартные ошибки. О статистической значимости показателей у животных сравниваемых групп судили по критерию Стьюдента. Для оценки суммарного эффекта по выживаемости использовали критерий χ².

Программа экспериментов была одобрена Комиссий по биоэтике ГНЦ РФИМБПРАН.

Острая лучевая болезнь является полиорганным заболеванием. Ведущим симптомом при костномозговой форме заболевания является снижение числа клеток в костном мозге и числа лейкоцитов в периферической крови. Появление фокусов кроветворения (эндогенных колоний) в селезенке характерно для начала восстановительных процессов. Течение острой лучевой болезни зависит от дозы облучения: чем она выше, тем тяжелее течение болезни, тем меньше выживаемость, тем меньше клеток в костном мозге и в периферической крови, тем меньше число фокусов кроветворения в селезенке, тем больше снижение массы тела. Применение различных лечебных средств снижает тяжесть течения острой лучевой болезни и повышает вероятность выживания организма.

В наших исследованиях на мышах было установлено, что нелеченые животные контрольной группы в большинстве погибли, выживаемость составила 10% и 16,6%. Лечебное применение ЛВ с ppm 35 и 90 повышало выживаемость облученных мышей до 40-55,5% (Табл. 1).

При наблюдении за клиническим течением острой лучевой болезни у крыс определяли динамику массы тела животных. Результаты обследования представлены на таблице 2.

На таблице 2 видно, что снижение массы тела леченых животных в разгар острой лучевой болезни не происходило, в то время как на 3 - 10 сутки после облучения отмечено снижение массы тела в группе контрольных облученных животных.

Помимо наблюдения за клиническим течением острой лучевой болезни подопытных мышей обследовали на предмет состояния кроветворения на 8 сутки после облучения в сублетальной дозе γ-квантов ⁶⁰Со 5 Гр (Табл.3).

На таблице 3 видно, что число ядросодержащих клеток в костном мозге, число эндогенных колониеобразующих единиц в селезенке и число лейкоцитов в периферической крови леченых животных (ЛВ с 35 ppm) существенно выше, чем у контрольных облученных животных. Увеличение как числа костномозговых клеток (t=3,6, р≤0,01), так и эндогенных колоний в селезенке (t=2,6, р≤0,05) было статистически достоверно по критерию Стьюдента.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что лечение острой лучевой болезни ЛВ повышает выживаемость животных и стимулирует восстановление гемопоэза, судя по показателям костномозгового кроветворения и числу эндогенных колоний в селезенке.

Пример 1

Лечебную противолучевую эффективность ЛВ (ррm 35) изучают в опыте на 56 аутбредных мышах-самцах CD-I с исходной массой тела 31-34 г (28 голов леченых и 28 контрольных), находящихся на обычном рационе питания. Рандомизация животных по группам осуществляется по массе.

Для моделирования острого радиационного воздействия используют облучение γ-квантами ⁶⁰Со в дозе 6,5 Гр на установке Рокус-М (средняя мощность дозы 1 Гр/мин). Животных облучают группами по 10-18 голов в пластмассовых коробках. После облучения животных делят на две равноценные группы, одна из которых получает ЛВ, а другая - ДВ на протяжении всего срока наблюдения, в течение 30 суток.

Развитие острой лучевой болезни сопровождается падением массы тела, снижением двигательной активности, отказом от корма, потерей опрятности. Все эти признаки, более существенно выражены в группе нелеченых контрольных животных.

Интегральной оценкой влияния ЛВ на течение острой лучевой болезни у мышей является определение их выживаемости в течение 30 суток после облучения. В группе леченых животных при наблюдении в течение 30 суток из 28 животных выжило 13, тогда как в группе контрольных нелеченых - только 4 из 28. Таким образом, лечебное действие ЛВ выражалось в повышении выживаемости леченых животных до 46,4% по сравнению с 14,3% выживаемостью животных контрольной группы. Разница между показателями статистически значима (χ²=5,4, р≤0,02).

Пример 2

Лечебную противолучевую эффективность ЛВ (90 ppm) изучают в опыте на 36 аутбредных мышах-самцах CD-I с исходной массой тела 31-34 г.Облучают группами по 18 голов. Рандомизация животных по группам осуществляется по массе.

Для моделирования острого радиационного воздействия используют облучение γ-квантами ⁶⁰Со в дозе 6,5 Гр на установке Рокус-М (средняя мощность дозы 1 Гр/мин). Животных облучают группами по 10-18 голов в пластмассовых коробках. После облучения животных делят на две равноценные группы, одна из которых получает ЛВ, а другая - ДВ на протяжении всего срока наблюдения, в течение 30 суток.

Развитие острой лучевой болезни сопровождается падением массы тела, снижением двигательной активности, отказом от корма, потерей опрятности. Все эти признаки более существенно выражены в группе нелеченых контрольных животных.

Интегральной оценкой влияния ЛВ на течение острой лучевой болезни у мышей является определение их выживаемости в течение 30 суток после облучения.

В группе леченых животных при наблюдении в течение 30 суток после облучения из 18 животных выжило 10, тогда как в группе контрольных - только 3 из 18. Таким образом, лечебное действие ЛВ (90 ppm) выразилось в повышении выживаемости леченых животных до 55,5% по сравнению с 16,6% выживаемостью контрольной группы. Разница между показателями статистически достоверна (χ²=5,9, р≤0,025).

Пример 3

Влияние ЛВ (ppm 35) на пострадиационное подавление кроветворения изучают в опыте на 24 аутбредных CD-I мышах-самках с исходной массой тела 31-34 г (8 облученных леченых, 8 облученных контрольных и 8 необлученных контрольных), находящихся на обычном виварном рационе.

Для моделирования острого радиационного воздействия используют облучение γ-квантами ⁶⁰Со в дозе 5 Гр на установке Рокус-М (средняя мощность дозы 1 Гр/мин). Животных облучали группами по 8 голов в пластмассовых коробках. После облучения животных делят на две рандомизированные группы, одна из которых получает в качестве питьевой воды ЛВ (ad libitum) (ppm 35), а другая - ДВ.

На 8 сутки после облучения животных умерщвляют методом цервикальной дислокации и стандартными методами определяют число ядросодержащих клеток в бедренной кости и число эндогенных колоний в селезенке. Содержание ядросодержащих клеток в костном мозге в леченой группе составляет 20,7±3,04·10⁶ /бeдpo, в контрольной облученной - 12,55±3,98·10⁶ /бeдpo, а в необлученном биоконтроле - 47,l±4,8·10⁶ /бeдpo. Разница между показателями леченой и контрольной облученными группами статистически значима по критерию Стьюдента (t=3,6, р≤0,01).

Уровень эндогенных колоний в селезенке леченых облученных животных составляет 4,5±2,9, что существенно выше, чем в контрольной нелеченой облученной группе 0,88±0,88. Разница статистически значима по критерию Стьюдента (t=2,6, р≤0,05).

Таким образом, ЛВ повышает выживаемость облученных животных, способствует сохранению их массы тела, ускоряет восстановление нарушенного облучением кроветворения.

Это дает основание считать ЛВ эффективным средством лечения костно-мозговой формы лучевой болезни.

Источники информации:

1. Синяк Ю.Е., Григорьев А.И., Гайдадымов З.Н., Медникова Е.И., Лебедева З.Н., Гуськова Е.И. Метод получения бездейтериевой воды и исследование ее влияния на физиологический статус японского перепела // Космическая биология и авиакосмическая медицина. Материалы XI конференции, Москва. 1998. Т. II. С.201;

2. Бердышев Г.Д., Варнавский И.Н., Прилипенко В.Д. Целебная реликтовая вода-открытие третьего тысячелетия // Вопросы химии и химической технологии. 2002. №5. С.168-174;

3. Бердышев Е.Д., Варнавский И.Н., Прилипенко В.Д. Аквабиотика - наука о роли воды в жизненных процессах. // ЗАТ "ЗТНВФ "Коло". 2003. С.22-28;

4. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах // М.: Наука. 1978. С.215;

5. Синяк Ю.Е., Левинских М.А., Гайдадымов В.В. и др. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на культивирование высших растений: Arabidopsis thaliana и Brassica // Матер. Рос. Конф. «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (26-29 сентября, 2000). М., 2000. Т. 2. С.90-92;

6. Цисанова Е.С., Сыроешкин А.В., Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Плетенева Т.В., Климова Э.В. Изучение биологической активности и соотношения протий/дейтерий (D/H) в воде с помощью клеточного биосенсора S. ambiguum // Электронный научный Журнал "Исследовано в России". 2010. Т. 56. С.588-593;

7. Иванов А.А. и др. Нужен ли дейтерий в питьевой воде?! // Рос. научн. Конф. с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». С-Пб. 2011. С.132;

8. Bild W, Stefanescu I, Haulica I, Lupusom C, Titescu G, Iliescu R, Nastasa V. Research concerning the radioprotective and immunostimulating effects of deuterium-depleted water // Rom. J. Physiol. - 1999. - V.36. №3-4. P.205-21;

9. Раков Д.В. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия и кислорода ¹⁸О на развитие лучевых повреждений в организме мелких лабораторных животных при низких дозах облучения // Автореферат диссертационной работы на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. ГНЦ РФ ИМБП РАН. 2007;

10. Соловьев С.П. Способ и установка для производства легкой воды // Патент РФ №2295493, Бюллетень №8 от 20.03.2007;

11. Van Trigh R. Lazer spectrometry for Stable Isotope Analysis of Water // Biomedical and Paleoclimatological Applications. Groningen: University Library Groningen. 2002. P.50.

Таблица 1 Влияние потребления легкоизотопной воды на выживаемость к 30 суткам после облучения аутбредных CD-I мышей-самцов γ-квантами ⁶⁰Со в дозе 6,5 Гр № п/п Группа N Выживаемость χ ,p Абс % 1 ДВ 10 1 10   ЛВ, ppm=35 10 4 40 χ²=2,4, p<0,2 2 ДВ 18 3 16,6   ЛВ, ppm=35 18 9 50 χ²=4,5, p<0,05 ЛВ, ppm=90 18 10 55,5 χ²=5,9, p<0,025

Таблица 2 Динамика средней массы тела крыс, облученных γ-квантами ⁶⁰Со в дозе 6,5 Гр и леченых ЛВ, в % по отношению к исходному значению Группа Время после облучения (сут) 0 3 7 10 14 17 21 24 28 31 ЛВ 100% 107,40% 110,30% 117% 114,30% 118,70% 120,20% 120,90% 122% 122% ДВ 100% 99,10% 95,60% 99,95% 109,60% 96,30% 108,10% 108,60% 108,90% 109,20% БК 100% 102,30% 106,70% 111,10% 112,50% 115,80% 113,40% 116,90% 117,90% 118,20%

Таблица 3 Гематологический статус аутбредных CD-I мышей-самок на 8 сутки после облучения γ-квантами ⁶⁰Со в дозе 5 Гр и леченых легкоизотопной водой (M±µ) Группа N Клеточность костного мозга, n·10⁶/бедро Число колониеобразующих единиц на селезенку Число лейкоцитов в периферической крови, n·10⁹/л ЛВ 8 20,7±3,04^∗∗ 4,5±2,9^∗ 0,99±0,51 ДВ 12,55±3,98 0,875±0,88 0,94±0,24 БК 47,1±4,8 0 3,68±1,46 Примечание: ∗ - статистически значимое различие по критерию Стьюдента между группами ЛВ и ДВ, р≤0,05, ∗∗ - статистически значимое различие по критерию Стьюдента между группами ЛВ и ДВ, р≤0,01.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения острой лучевой болезни. В качестве лечебного средства при костномозговой форме острой лучевой болезни используют легкоизотопную воду. Использование заявленного изобретения повышает выживаемость, ускоряет восстановление гемопоэза и массы тела. 3 табл., 3 пр.

Применение легкоизотопной воды, полученной ректификационным методом, в качестве лечебного средства при костномозговой форме острой лучевой болезни.