СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОЙ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/40 A61P7/06 A61P37/02 A61N5/10 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лактоферрину, и может быть использовано для лечения острой лучевой болезни.

Лактоферрин (ЛФ) - компонент молока млекопитающих был открыт более 50 лет назад. Он является природным гликопротеином с молекулярной массой ˜80 кДа. ЛФ относится к классу железосодержащих белков трансферринов и существует в двух формах: свободной и связанной с ионами железа. Молекула ЛФ содержит два активных центра фиксирующих железо (Fe³⁺), которые располагаются на двух функциональных доменах белка [1, 2]. ЛФ присутствует в наружных секретах млекопитающих, в слюне, в гранулах полиморфно-ядерных нейтрофилов. В крови его концентрация составляет 1 мкг/мл, увеличиваясь при остром воспалении до 20 мкг/л. Наибольшая концентрация ЛФ наблюдается в молоке животных на ранней стадии лактации (до 7-10 г/литр) [1, 2, 3]. В настоящее время продолжается изучение особенностей действия ЛФ в организме, что объясняется его полифункциональностью [1]. Наиболее важной биологической функцией ЛФ является противоинфекционная [4, 5, 6]. ЛФ входит в схему комплексного лечения кандидозов противогрибковыми препаратами, что значительно повышает эффективность их терапевтического применения [7, 8, 9]. Установлено, что ЛФ индуцирует в организме синтез интерлейкина-18 и интерферона-γ, которые являются противовоспалительными цитокинами [10, 11]. ЛФ усиливает иммунную защиту организма [11, 12, 13]. ЛФ успешно применяется для лечения бронхиальной астмы [11] и лечения язвы желудка [14]. Известно применение человеческого ЛФ для стимуляции миелопоэза, восстановления содержания нейтрофилов, лечения анемии, угнетения воспаления, подавления роста солидных опухолей и активации NK-киллеров [15]. ЛФ применяют при лечении онкологических заболеваний желудка, кишечника, легких, мочевого пузыря, матки, лимфосаркомы (внутривенные, внутриполостные инъекции или местные аппликации) [16], для профилактики формирования метастазов при аденоме и карциноме легких, мочевого пузыря, пищевода и прямой кишки [17, 18, 19]. Его используют также в виде аппликаций для лечения местных воспалительных процессов после химиолучевой терапии опухолей орофарингеальной зоны и пищевода [20].

Целью настоящего изобретения является исследование и доказательство возможности лечебного использования ЛФ при лучевом поражении организма, вызывающем острую лучевую болезнь. Для достижения поставленной цели изучено влияние ЛФ на выживаемость и гемопоэз облученных морских свинок. В ходе исследований установлено, что ЛФ способен существенно увеличивать выживаемость облученных животных и ослаблять постлучевую цитопению.

В экспериментах использовали ЛФ, полученный биотехнологическим методом из молозива млекопитающих (методика ТУ/TR 9380-001-424118073-04). ЛФ был насыщен на 15-20% ионами железа (Fe³⁺) и растворен в биологически совмещенном буфере. Гомогенность ЛФ составляла 95% судя по результатам хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Гель-фильтрационная хроматография не выявила наличия олигомеров белка в ЛФ.

Лечебная эффективность ЛФ была изучена в опытах на 27 морских свинках массой около 350 г. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляли по массе тела и числу лейкоцитов периферической крови. Показатели крови соответствовали нормальным значениям. Животных облучали γ-квантами ¹³⁷Cs в дозе 2,5 Гр на установке "ИГУР" (мощность дозы 2,045 рад/сек). В результате облучения у животных развивалась костно-мозговая форма острой лучевой болезни.

Подопытным животным после облучения ежедневно подкожно вводили раствор ЛФ в физиологическом растворе в количестве 65 или 300 мкг/кг, в объеме 0,2 мл на 1-е - 14-е сутки лучевой болезни. В эти же сроки контрольные нелеченые животные получали физиологический раствор хлорида натрия в объеме 0,2 мл.

Влияние ЛФ на статус облученных животных оценивали по их выживаемости в течение 30 суток после облучения, а также по количеству лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови. Обследование проводили за 3-4 дня до и на 7-е, 12-е, 16-е, 18-е, 21-е и 32-е сутки после облучения.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили при использовании стандартных методик вариационной статистики.

При статистической обработке экспериментальных данных рассчитывали средние арифметические показатели и их стандартные ошибки во все сроки обследования. О статистической значимости разницы показателей в отдельные сроки после облучения у животных сравниваемых групп судили по критерию Стьюдента. Для оценки суммарного эффекта ЛФ на содержание лимфоцитов во все сроки обследования применили критерий знаков.

Острая лучевая болезнь является иммунодефицитом вторичного типа. Ее развитие сопровождается снижением числа клеток в костном мозге, в периферической крови. Течение острой лучевой болезни зависит от дозы облучения. Чем она выше, тем тяжелее течение болезни. Применение различных лечебно-профилактических средств снижает тяжесть течение острой лучевой болезни и повышает вероятность выживания организма.

В наших исследованиях было установлено, что нелеченые животные контрольной группы выживали в 53,8% случаев. Лечебное применение ЛФ повышало выживаемость облученных морских свинок до 85,7% (65 мкг/кг) и 100% (300 мкг/кг) (табл.1).

Таблица 1
Выживаемость морских свинок, облученных γ-квантами ¹³⁷Cs в дозе 2,5 Гр и леченных ЛФ№ п/пЛФ, мкг/кгЧисло свинок в группеИз них% выживаемостивыжилопало1-137553,826576185,73300770100,0

Помимо наблюдения за клиническим течением острой лучевой болезни подопытных групп животных обследовали и определяли содержание лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови. Результаты гематологического обследования животных представлены в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что содержание лимфоцитов в периферической крови всех леченных ЛФ групп было выше по сравнению с контрольными нелечеными животными. Наиболее значимый эффект зафиксирован при обследовании в разгар цитопении на 12-е сутки после облучения.

Таблица 2
Содержание лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови морских свинок облученных γ-квантами ¹³⁷Cs в дозе 2,5 Гр и леченных ЛФПоказательЛФ, мкг/кгВремя после облучения, сут.071216182132Лимфоциты (×10⁹/л, М±m)-5,3±0,41,7±0,11,4±0,15,6±0,56,8±1,14,1±0,53,8±0,2656,9±0,91,9±0,22,5±0,2^*5,9±0,88,0±0,54,7±0,35,2±0,43005,2±0,42,2±0,42,5±0,3^*6,0±0,77,2±0,74,6±0,65,0±0,8Нейтрофилы (×10⁹/л M±m)-3,6±0,20,3±0,10,006±0,0050,8±0,22,9±0,55,4±0,93,3±0,8653,6±0,40,2±0,10,06±0,0042,0±0,3^*5,9±0,6^*6,2±0,74,0±0,33003,2±0,40,2±0,040,1±0,063,5±0,9^*4,6±1,04,1±0,75,2±0,7Примечание: 1) ^* статистически значимое превышение показателей по сравнению с контрольной группой по критерию Стьюдента р<0,05.

В это время содержание лимфоцитов в леченой группе составило 2,5±0,2, а в контрольной нелеченой группе - 1,4±0,1 (×10⁹/л). Разница между показателями статистически значима (критерий Стьюдента t=4,7; p<0,01).

Содержание лимфоцитов в леченых группах во все сроки наблюдения было выше, чем в контрольной группе морских свинок, не получавших ЛФ. Критерий знаков свидетельствует о том, что этот эффект ЛФ носит статистически значимый характер (р=0,05).

Выраженный стимулирующий эффект на гемопоэз отмечен при определении числа нейтрофилов в периферической крови. На 16-е сутки после облучения после введения ЛФ в ежедневной дозе 65 или 300 мкг/кг содержание нейтрофилов было равно 2,0±0,3 (×10⁹/л) и 3,5±0,9 (×10⁹/л) в леченых группах и 0,8±0,2 (×10⁹/л) в контрольной группе. Критерий Стьюдента был равен соответственно t=3,3 и 2,9; р<0,01. На 18-е сутки после облучения в группе леченых животных (65 мкг/кг) также было отмечено превышение показателей над контрольной группой. В леченой группе - 5,9±0,6 (×10⁹/л), в контрольной группе - 2,9±0,5 (×10⁹/л). Отмеченная разница между показателями носит статистически значимый характер (критерий Стьюдента t=3,8; p<0,01).

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что лечение острой лучевой болезни ЛФ повышает выживаемость животных и снижает выраженность постлучевой цитопении судя по содержанию лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови.

Пример

Лечебную эффективность ЛФ изучают в опыте на 20 морских свинках (7 леченых и 13 контрольных) массой около 350 г, находящихся на обычном рационе вивария. Рандомизация животных по группам осуществляется по массе тела и числу лейкоцитов периферической крови.

Для моделирования острого радиационного воздействия используются γ-кванты ¹³⁷Cs в дозе 2,5 Гр, установка "ИГУР" (мощность дозы 2,045 рад/сек). Животных облучают группами по 6 голов в специальных пластмассовых коробках, разделенных перегородками на 6 (3+3) секций. В результате радиационного воздействия у животных развивается костно-мозговая форма острой лучевой болезни.

Подопытным животным после облучения ежедневно подкожно вводят раствор ЛФ в физиологическом растворе в количестве 300 мкг/кг, в объеме 0,2 мл на 1-е - 14-е сутки лучевой болезни. В эти же сроки контрольные нелеченые животные получают физиологический раствор хлорида натрия в объеме 0,2 мл.

Развитие острой лучевой болезни закономерно сопровождается снижением содержания клеток в периферической крови. Развитие острой лучевой болезни у контрольных животных сопровождается падением массы тела, снижением двигательной активности, отказом от корма, взъерошенностью шерсти, которая теряет свой блеск и загрязняется фекалиями.

В группе леченых животных (ЛФ, 300 мкг/кг) из клинических проявлений острой лучевой отмечается только снижение массы тела. Другие симптомы отсутствуют. Животные активны, опрятны, поедают корм в обычных количествах.

Максимально выраженное снижение клеток в периферической крови морских свинок отмечается на 12 сутки лучевой болезни. В это время содержание лимфоцитов в периферической крови леченых ЛФ животных выше по сравнению с контрольными нелечеными животными. Содержание лимфоцитов в леченой группе составляет 2,5±0,2, а в контрольной группе - 1,4±0,1 (×10⁹/л). Разница между показателями статистически значима (критерий Стьюдента t=4,9; р<0,01).

Число нейтрофилов в периферической крови на 16-е сутки после облучения равно 3,5±0,9 (×10⁹/л) в леченой группе и 0,8±0,2 (×10⁹/л) в контрольной группе. Критерий Стьюдента t=2,9; р<0,01.

Интегральной оценкой влияния ЛФ на течение острой лучевой болезни у морских свинок является определение их выживаемости в течение 30 суток после облучения. Снижение тяжести клинических симптомов острой лучевой болезни и менее выраженная цитопения обусловили повышенную по сравнению с контрольной группой (53,8%) выживаемость леченых животных (100%).

Таким образом, ЛФ повышает выживаемость облученных животных и снижает выраженность постлучевой цитопении. Это дает основание считать его эффективным средством лечения острой лучевой болезни.

Источники информации

1. Канышева Т.Г., Бунева В. Н., Невинский Г.А. // Биохимия, 2001, Т.66, №1, С.5-13.

2. Brigens Y. // Scand. J. Haematolog., 1985, V.34, №4, P.326-331.

3. Shimazaki К., Tazume Т., Tanaka M. // Journal of Dairy Science, V.81, №11, P.2841-2849.

4. Отт В.Д., Дюкарева С.В., Мельников О.Р. // Вопр. питания, 1993, №1, С.6-13.

5. Arnoid R, Brever M., Gauthier J. // Infect. Immun., 1980, V.28, №8, P.893-898.

6. Ajello M., Greco R., Doimaramma G. // Igiene Moderna, 1998, V.110, №6, P.671-682.

7. Hanson L., Lonnroth I., Bjersing J. // Nutrition Reviews, 2000, V.58, (2, Part 2), P.931-937.

8. Ikeda M., Nozaki A. Sgiyama К. // Virus Research, 2000, V.66, №1, P.51-53.

9. Ikeda M., Sugiyama K., Tonaka Т. // Biochem. Biophys. Res. Com., 1998, V.245, P.549-553.

10. Debbabi Н., Dubarry M., Rautureau M. // Journal of Dairy Research, 1998, V.65, №2, P.283-293.

11. Lygren В., Sveir Н., Hjeltes В. // Fish and Shellfish Immunology, 1999, V.9, 2, P.95-107.

12. Kakuka J., Kurokura Н. // Fish Pathology, 1995, V.30, №2, P.289-290.

13. Miyauchi Н., Kaino A., Shinoda I. // Journal of Dairy Science, 1997, V.80, №10, P.2330-2339.

14. Miyauchi Н., Hashimoto S., Nakajima V. // Cellular Immunology, 1998, V.187, №1, P.34-37.

15. Nuioens J., van Berkel Н. Useful properties of human laktoferrin and variants thereof. Патент США №6333311. December 25, 2001.

16. Чиссов В.И., Якубовская Р.И., Бойко А.В., Немцова Е.Р., Сергеева Т.В., Осипова НА. Антибактериальный, антиоксидантный, иммуномодулирующий и антиканцерогенный препарат и способ его применения. Патент РФ №2165769, 2001 г.

17. Ligo M., Kuhara Т., Ushida Y. // Clinical and Experimental Metastasis, 1999, V.17, №1, P.43-49.

18. Norrby К., Mattsby-Baltzer I., Innocenti M. // International Journal of Cancer, 2001, V.91, №1, Р.236-240.

19. Tsuda H., Sekine К., Ushida Y. // Research/Reviews in Mutation Research, 2000, V.462, №2, P.227-233.

20. Чиссов В.И., Борисов В.И., Якубовская Р.И., Бойко А.В., Немцова Е.Р., Демидова Л.В., Сергеева Т.В., Телеус Т.А. Препарат для лечения местных осложнений консервативного противоопухолевого лечения в орофаренгеальной зоне и способ лечения осложнений консервативного противоопухолевого лечения в орофарингеальной зоне. Патент РФ №2099065, 1997 г.

Изобретение относится к медицине, в частности к радиационной медицине, и касается лечения лучевой болезни. Предлагают использовать лактоферрин в качестве лечебного средства при острой лучевой болезни. Лактоферрин применяют в экспертименте при воспроизведении костно-мозговой формы острой лучевой болезни. Подкожное введение лактоферрина в физиологическом растворе в дозе 300 мкг/кг сопровождается статистически достоверным увеличением лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови и обеспечивает стопроцентную выживаемость облученных животных в опытной группе. 2 табл.

Применение лактоферрина в качестве лечебного средства при острой лучевой болезни.