СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА ВИРУСА ГЕПАТИТА Е И РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА Е Российский патент 2013 года по МПК C07K14/02 C12P21/00 C12N15/51 C12N1/19 A61K39/29 C12R1/78 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для получения капсидного белка вируса гепатита E (HEV) рекомбинантным путем и создания на его основе рекомбинантной вакцины для профилактики вирусного гепатита E.

Гепатит E - вирусная инфекция, относящаяся к условной группе фекально-оральных гепатитов, характеризуется поражением печени, острым циклическим течением, часто с высокой температурой, артралгией, а также тяжелым проявлением у беременных женщин. Резервуар и источник инфекции - человек, больной или носитель. Вирусная этиология гепатита E продемонстрирована на волонтерах путем заражения фекальными изолятами. Вирус обнаружен в фекалиях больных. Механизм передачи вируса гепатита E, также называемого non-A, non-B (NANB), фекально-оральный, путь передачи водный, однако наблюдаются случаи передачи вируса от человека к человеку. Вирус гепатита E эндемичен на территории с крайне плохим водоснабжением населения, неудовлетворительным качеством воды в эпидемическом отношении. Гепатит E распространен в Азии, Африке, Европе, Мексике, Индии как в эпидемической, так и спорадической формах. Принято считать, что гепатитом Е болеют ежегодно около 1 млн. человек, причем в странах Азии на его долю приходится более половины случаев острого гепатита. Эпидемиологическая особенность этого заболевания связана с высокой смертностью беременных женщин, которая, как показывают многочисленные исследования, может достигать 10-20%. В последние годы выявлено устойчивое увеличение числа лиц с наличием антител к HEV в регионах с умеренным климатом, в экономически развитых странах. В этих случаях часто инфицирование было обусловлено распространенным в Европе и США вирусом с генотипом 3, который также был обнаружен у диких и домашних свиней, что позволяет рассматривать зоонозный резервуар в качестве источника заражения большинства людей. Немногочисленные исследования, проведенные в РФ, также продемонстрировали наличие антител к вирусу гепатита E у лиц, не выезжающих в эндемичные районы, что свидетельствует о контакте населения с вирусом. Одним из возможных объяснений высокой частоты выявления антител у таких лиц является заражение от животных, поскольку известно, что в естественных условиях вирус может инфицировать таких диких и домашних животных как кабаны, олени, свиньи, овцы, куры и др.

Вирус гепатита E относится к семейству Hepeviridae рода Hepevirus. Частицы вируса представляют собой сферические образования диаметром 27-34 нм, построенные из идентичных структурных элементов, и лишенные наружной оболочки. Вирусные частицы реагируют с антителами сыворотки инфицированных индивидуумов из географически различных регионов, что говорит о повсеместной распространенности HEV. Серологически и молекулярно-генетически HEV отличается от других типов вирусов гепатита. Последовательность генома HEV впервые была определена в 1991 г. (Tam A.W. et.al., 1991 Virology, 185, 120-131). Геном вируса гепатита E представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности. Анализ последовательности генома показал, что его размер 7.2 kb, и он содержит 3 открытые рамки считывания (ORF), каждая из которых кодирует синтез определенного белка или группы белков. ORF1 кодирует неструктурные белки вируса, ответственные за репликацию вируса, ORF2 кодирует структурный белок капсида вируса (ORF2-белок), ORF3 кодирует вспомогательный белок, функция которого еще не определена. С помощью картирования установлено, что линейные антигенные эпитопы локализованы в полипептидах, кодируемых ORF2 и ORF3 (Khydyakov Y.E. et al., Virology 1993, 194, 89-96). Рекомбинантный белок ORF2 способен к самосборке в вирусоподобные частицы (VLP), подобные по антигенным свойствам капсидному белку инфекционного вируса.

Филогенетический анализ, базирующийся на полной длине последовательности генома некоторых изолятов HEV, указывает на существование 4 различных генотипов, каждый из которых доминирует в определенной географической области. Генотип 1 включает штаммы из Азии и Африки, генотип 2 - мексиканский штамм и несколько вариантов из Африки, генотипы 3 и 4 включают HEV штаммы человека и свиньи из индустриальных стран и Азии. Генотипы 1 и 2 обнаружены только у человека, тогда как генотипы 3 и 4 у человека, а также свиней и других животных. Генотип 3 распространен повсеместно, генотип 4 чаще встречается в Китае и Японии. Открытие вирусов, подобных HEV, у свиней (свиной HEV) и кур (птичий HEV) предполагает, что вирус относится к зоонозу. Несмотря на существование различных генотипов, идентифицирован один серотип HEV. Все субтипы вируса имеют основные перекрестно реагирующие эпитопы, позволяющие создать рекомбинантную вакцину, основанную на капсидном белке, эффективную против многих штаммов HEV.

В настоящее время создание рекомбинантных вакцин, наряду с мониторингом и определением носителей HEV, является перспективным направлением в борьбе против инфекции, вызванной HEV. Затруднения, препятствующие созданию эффективных вакцин против вируса гепатита E, прежде всего, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продуцирования рекомбинантных белков, обладающих иммуногенными свойствами природных белков.

В научной и патентной литературе представлены примеры использования для получения рекомбинантных белков HEV бактериальной системы экспрессии на основе E.coli. Так, известно получение рекомбинантного химерного белка trpE-C2, содержащего 439 C-концевых аминокислот ORF2-белка HEV генотипа 1, слитого с N-концевой областью триптофансинтетазы, в бактериальной системе экспрессии в E.coli (Kamili S., Virus Research 2011, 161(1):93-100). Экспрессируемый в E.coli белок обладает высокой иммунореактивностью и содержит перекрестно реактивные эпитопы, узнаваемые антителами к HEV. В результате вакцинирования обезьян белком trpE-C2, сорбированным на гидроокиси алюминия, обнаружено индуцирование гуморального иммунного ответа.

Описано получение иммунореактивного полипептида рЕ2, происходящего из карбокситерминального района белка, кодируемого ORF2 генома китайского штамма D11092. Этот полипептид, благодаря присутствию конформационной антигенной детерминанты, способен из мономеров образовывать активные гомодимеры (US 7,204,989, 17.04.2007). Полипептид рЕ2 экспрессировали в клетках E.coli с использованием вектора pGEX. При клонировании в этом векторе последовательность кодирующая рЕ2, была соединена в рамке с геном глютатион-S-трансферазы (GST). В результате был получен гибридный ген, кодирующий полипептид, на N-концевой части которого находилась GST, а на C-концевой - рЕ2. Такой составной белок, полученный в результате экспрессии гибридного гена в клетках Е.coli, был растворим и мог быть выделен из лизата клеток путем связывания с глютатион-агарозой. Полипептид рЕ2 отделяли от GST при помощи специфической протеазы. Экспрессируемый в бактериальных системах полипептид рЕ2 рассматривается в качестве потенциального кандидата для вакцин против HEV. Предлагаемая вакцина для иммунизации против HEV содержит иммунологически эффективное количество рЕ2, фармакологически приемлемый носитель и адъювант. Вакцина может применяться орально или парентерально.

Несмотря на то что бактериальная система экспрессии применяется для получения рекомбинантных белков довольно широко, отмечены недостатки ее использования связанные с проблемой растворимости белков, продуцируемых в E.coli, а также с трудностями, возникающими при проведении серологических иммуноанализов. Кроме того, рекомбинантные фрагменты капсидного белка HEV, экспрессируемые в клетках бактерий, отличаются значительно укороченной аминокислотной последовательностью что может негативно отражаться на их антигенных свойствах. В связи с этим, более предпочтительно использование эукариотической системы экспрессии для получения рекомбинантных белков HEV, в частности бакуловирусной или дрожжевой.

Известно использование в качестве антигена HEV C-концевого фрагмента длиной 549 аминокислотных остатка ORF2-белка мексиканского и бирманского штаммов. Этот фрагмент был обозначен как «антиген 62К» (US 6,291,641, 18.09.2001). Антиген продуцировали в бакуловирусной системе экспрессии. Для этого был получен рекомбинантный бакуловирус, которым трансфецировали клетки насекомых SF9. Трансфецированные клетки культивировали либо в суспензии, либо в монослое. Рекомбинантный антиген 62К получался преимущественно в растворимой форме. Выделенный антиген проявлял иммунореактивность с сывороткой индивидуумов, инфицированных HEV, и по электронно-микроскопическим данным был способен образовывать VLP.

В патенте US 6,458,562 (01.10.2002), рассматриваемом в качестве ближайшего аналога, описано получение в эукариотической системе экспрессии различных укороченных вариантов ORF2-белка из пакистанской линии HEV (SAR-55). Полученные белки на N-конце начинаются со 112-ой аминокислоты, а на С-конце заканчиваются в области аминокислот 578-607 или 660 ORF2-белка дикого типа (как в патенте US 6,787,145, 07.09.2004) и способны формировать VLP. Вирусную РНК изолировали из биологической пробы, собранной от приматов, инфицированных SAR-55. Для получения ORF2-белка создавали бакуловирусный вектор путем клонирования нуклеотидной последовательности, кодирующей ORF2-белок, в pBlueBac и трансфецировали им клетки SF9. После культивирования трансфецированных клеток в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного ORF2-белка, белок выделяли и очищали с использованием анионообменной хроматографии и гельфильтрации. С помощью метода ELISA показано, что экспрессируемый в бакуловирусной системе ORF2-белок связывается с антителами, образующимися в ответ на инфицирование различными штаммами HEV, и не связывается с антителами, продуцируемыми в ответ на вирусы гепатита А, В, С, D. ORF2-белок используют в качестве антигена в иммуноанализах, а также как активный антиген в составе вакцины. Эффективная доза рекомбинантного ORF2-белка предпочтительно составляет 10-50 мкг. Вакцина против вируса гепатита E содержит также фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и может содержать стабилизатор (полиэтиленгликоль, сахарозу и пр.). Вакцина предназначена как для иммунизации человека против HEV, так и для использования в ветеринарии.

В настоящее время две кандидатные вакцины против HEV достигли клинических испытаний. Одна из них, обозначенная rHEV (GlaxoSmithKline Biological,) содержит в качестве активного начала рекомбинантный HEV антиген с молекулярной массой 56 кДа, полученный в бакуловирусной системе экспрессии (Kamili S., Virus Research 2011, 161(1):93-100). Используемый в составе вакцины HEV антиген имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 112-607 ORF2-белка дикого типа. В исследовании вакцины принимали участие 2000 анти-HEV-негативных добровольцев Непальской Армии, которые были разделены на опытную (20 мкг rHEV) и контрольную группу (20 мкг плацебо). Вакцинацию проводили по схеме 0, 1 и 6 месяцев. У получавших все 3 дозы вакцины показатель клинически выраженного острого гепатита был заметно ниже по сравнению с получавшими плацебо. Несмотря на продемонстрированную эффективность вакцины, многие вопросы, связанные с использованием вакцины, остаются не ясными. Так, не исследована безопасность и эффективность использования вакцины у женщин, пожилых людей, беременных и пациентов с хроническими заболеваниями печени, не исследована эффективность указанной вакцины, содержащей антиген происхождением из генотипа 1, против инфекций, вызванных штаммами HEV других генотипов.

Другая кандидатная вакцина (HEV239, Китай) содержит в своем составе более укороченный HEV антиген (аминокислотные остатки 376-606 ORF2-белка) генотипа 1, полученный путем экспрессии в E.coli (Kamili S., Virus Research 2011, 161(1):93-100). Вакцина обеспечивала защиту у приматов против гепатита E, вызванного генотипами 1 и 4. Клинические исследования бактериальной рекомбинантной вакцины, проведенные в Южном Китае, районе эндемичном в отношении генотипа 1 и 4, показали безопасность, иммуногенность и эффективность вакцины среди общего населения. Кроме того было выявлено, что вакцина, основанная на генотипе 1, обеспечивает перекрестный иммунитет против генотипа 4 у людей. Однако проведенные клинические испытания нельзя признать полноценными, поскольку многие вопросы остались не ясными. Так, не исследована продолжительность защитного действия вакцины, безопасность вакцинации у беременных женщин и лиц с хроническими заболеваниями печени.

К существенным недостаткам указанных вакцин следует отнести то, что вакцины защищают от клинически выраженной формы гепатита, но не от инфекции HEV. Такие вакцины не могут оказать значимого влияния на эпидемиологию HEV инфекции в эндемических районах.

Таким образом, в связи с отсутствием специфической терапии и лицензированных вакцин против вируса гепатита E, остается актуальной разработка эффективной рекомбинантной вакцины, содержащей в своем составе активный антиген HEV, обладающий иммуногенными свойствами природного белка.

Задачей изобретения является осуществление способа получения укороченного капсидного белка вируса гепатита E повсеместно распространенного генотипа 3, обладающего иммуногенными свойствами природного белка, путем создания эффективного рекомбинантного дрожжевого продуцента, разработка на основе полученного рекомбинантного капсидного белка высокоиммуногенной, нетоксичной, не обладающей побочными эффектами вакцины для профилактики вирусного гепатита E. Под эффективностью рекомбинантного дрожжевого продуцента понимается возможность получения целевого продукта, обладающего необходимыми биологическими свойствами и низкой себестоимостью.

Задача решена тем, что согласно изобретению для получения рекомбинантного укороченного капсидного белка rtHEV-ORF2 (recombinant truncated HEV-ORF2) создают рекомбинантный дрожжевой штамм-продуцент указанного белка, для чего экспрессионную плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим rtHEV-ORF2, под контролем промотора гена МОХ (метанол оксидаза) Hansenula polymorpha и селективным маркером (ген LEU2 Saccharomyces cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма Н.polymorpha DL1-L. В результате отбора клонов, способных синтезировать белок rtHEV-ORF2, был выделен трансформант с наибольшей продуктивностью, обозначенный КБТ-11/pHEV-001. Искусственный ген интегрирован в геном, т.е. находится в составе одной из хромосом Н.polymorpha. Это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок.

Полученный рекомбинантный штамм Н.polymorpha позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка rtHEV-ORF2 при более простых способах получения культур высокой плотности.

Штамм депонирован под номером КБТ-11/pHEV-001, 24.12.2011 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех». Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.

Полученный рекомбинантный штамм-продуцент культивировали в условиях, подходящих для экспрессии белка rtHEV-ORF2. После выделения и очистки рекомбинантный антиген использовали в составе вакцины для профилактики вирусного гепатита E. Рекомбинантная вакцина содержит белок rtHEV-ORF2 в эффективном количестве, адьювант и может содержать мертиолят в качестве консерванта. Под эффективным количеством понимается такое количество активного начала настоящего изобретения, которое достаточно для защиты от инфекции HEV. Точное количество будет зависеть от конкретных обстоятельств и может быть оценено специалистом в данной области с использованием известных методик.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и Hansenula polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue H. et.al., Gene, 1990, 96:23-28. и Bogdanova A.I. et.al., Yeast. 1995, 11(4):343-53, соответственно). Синтез фрагментов ДНК, а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО "Евроген" г.Москва. Был использован синтетический фрагмент двуцепочечной ДНК MOX-rtHEV-ORF2, содержащий промотор МОХ H.polymorpha и открытую рамку считывания, кодирующую полипептид rtHEV-ORF2, соответствующий фрагменту длиной 523 аминокислоты с 86 по 607 позицию аминокислотной последовательности капсидного белка HEV генотипа 3 (SEQ ID NO:1).

Пример 1. Получение экспрессионного вектора pHEV1, содержащего промотор гена МОХ и последовательность, кодирующую полипептид rtHEV-ORF2.

Для получения экспрессионного вектора pHEV1 использовали плазмиду рАМ270, которая содержит ген, кодирующий β-лактамазу, и бактериальный ориджин репликации для поддержания плазмиды в клетках Е.coli, а также ген LEU2 S.cerevisiae в качестве дрожжевого селективного маркера и последовательность, обеспечивающую автономную репликацию плазмиды в клетках Hansenula polymorpha. Синтетический фрагмент MOX-rtHEV-ORF2 (SEQ ID NO:2) и плазмиду рАМ270 гидролизовали рестриктазами BsrGI и BglII. Полученные в результате гидролиза фрагменты ДНК были очищены посредством электрофореза в агарозном геле. Была составлена реакционная смесь для проведения лигазной реакции общим объемом 10 мкл, содержащая 20 нг выделенных фрагментов, однократный лигазный буфер и 1 единицу ДНК лигазы Т4. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего использовали для трансформации штамма DH5alpha Е.coli. Трансформантов селектировали на среде LB (1% Триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl), содержащей ампициллин (100 мг/л). Из нескольких трансформантов были получены препараты плазмидной ДНК. Плазмида, содержащая вставку фрагмента MOX-rtHEV-ORF2 была отобрана на основании рестрикционного анализа. Для подтверждения отсутствия нежелательных мутаций в клонированной вставке была определена ее нуклеотидная последовательность. В результате была получена плазмида pHEV1, содержащая ген, кодирующий rtHEV-ORF2, под контролем промотора МОХ к ген LEU2 S.cerevisiae в качестве селективного маркера.

Пример 2. Получение штамма-продуцента Н.polymorpha, экспрессирующего rtHEV-ORF2.

Штамм Н.polymorpha DL1-L, являющийся ауксотрофом по лейцину, выращивали в течение 15-18 часов в жидкой среде YPD (2% пептон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза) при 37°С. Полученную культуру разводили в 100 раз свежей средой YPD и инкубировали 4 часа в тех же условиях. Клетки из 200 мкл полученной культуры осаждали центрифугированием промывали стерильной дистиллированной водой и суспендировали в 30 мкл буфера Т (10 мМ Трис-HCl, pH 7.4; 100 мМ CH₃COOLi; 0.5 мМ ЭДТА). К суспензии добавляли 1 мкг плазмиды pHEV1, 5 мкг ДНК носителя (фрагментированная и денатурированная ДНК сельди) и 60 мкл 70%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000. Все компоненты перемешивали и инкубировали 30 мин. при 30°С и 18 мин при 45°С. Смесь разводили в 1 мл среды YPD и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Клетки высевали на чашки Петри со средой YNB-D (0.67% Yeast Nitrogen Base [Difco], 2% глюкоза и 2% агар) и инкубировали несколько дней до появления колоний трансформантов. Клетки выросших трансформантов рассевали истощающим штрихом на свежих чашках с YNB-D, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших субклонов были отобраны наиболее быстрорастущие и снова пересеяны истощающим штрихом на чашки со средой YNB-D. Процедура была повторена несколько раз, пока вырастающие при рассеве колонии не стали гомогенными по размеру.

Полученные таким образом субклоны трансформантов были исследованы на способность экспрессировать белок rtHEV-ORF2. Один из трансформантов с наибольшей продуктивностью был обозначен КБТ-11/pHEV-001.

Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой.

Хранение - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 15 или 50%-ном растворе глицерина.

Генетические особенности: штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.

Способ определения активности: в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноблотинга или иммуноферментного анализа. Активность штамма - не менее 100 мг/л культуральной жидкости.

Пример 3. Культивирование рекомбинантного штамма КБТ-11/pHEV-001.

Ферментацию штамма-продуцента дрожжей Н.polymorpha осуществляли в три этапа при температуре 30°С. На первом этапе в режиме периодической ферментации наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бакто-пептона и 4% глицерина. После потребления всего глицерина дрожжами (определяется резким повышением концентрации растворенного кислорода) переходили на периодическую ферментацию с подпиткой глицерином (fed-batch). Когда сырая биомасса достигала плотности 120 г/л (примерно через 28-32 часа ферментации), переходили на стадию индукции, добавляя индуктор порциями по 0.5 объемных % от объема культуральной среды каждые 2 часа. Стадия индукции продолжалась от 2 до 5 суток, в зависимости от уровня аккумуляции антигена в клетках дрожжей, определяемого методом иммуноблотинга.

Пример 4. Выделение и очистка рекомбинантного белка rtHEV-ORF2.

После ферментации клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 15 минут при +6°С. Осажденную биомассу отмывали ресуспендированием и повторным центрифугированием в буфере для экстракции (PBS, pH 7.2, с добавлением 1.7 mM EDTA, 2 mM PMSF, 0.5% [v/v] Tween-20). После отмывки биомассу ресуспендировали в буфере экстракции в концентрации 380 г влажных клеток на литр суспензии и разрушали клетки в мельнице Dyno-Mill типа KDL, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Неразрушенные клетки и дебрис осаждали центрифугированием при 12000 g, 30 минут при +6°С.

К полученному осветленному гомогенату добавляли полиэтилен гликоль (PEG-8000) до 6% [вес/об.] и NaCl до 400 мМ и инкубировали 18 часов при постоянном перемешивании на +4°С. Осажденные белки, включая rtHEV-ORF2, отделяли центрифугированием при 12000 g в течение 30 минут. Осадок растворяли в 5 объемах буфера PBS и доводили pH до 8.0 раствором гидроксида натрия. Нерастворенные белки и агрегаты осаждали 30 минут при 12000 g. При помощи тангенциальной ультрафильтрации на мембране 300 кДа из супернатанта удаляли низкомолекулярные белки и одновременно переводили в буфер для ионно-обменной хроматографии (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl) с последующим нанесением на хроматографическую колонку с сильным анионно-обменным крупнопористым сорбентом MacroCap-Q (GE, USA). Несвязавшиеся белки промывали буфером для ионно-обменной хроматографии, содержащим 50 мМ NaCl. Белок rtHEV-ORF2 элюировали линейным градиентом от 50 до 500 мМ NaCl в 10 колоночных объемах при линейной скорости 100 см/час.

Объединенные фракции, содержащие целевой белок rtHEV-ORF2 (по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией на мембране 300 KDa и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте сахарозы от 10 до 50% вес/вес в буфере PBS (pH 7.2). Фракции, содержащие целевой белок, очищали от агрегатов и переводили в буфер 10 mM NaH₂PO₄, pH 7.2, 0.1% Tween-20 при помощи гельфильтрации на сорбенте Toyopearl HW-65F (ToyoSoda Corp., Japan). Чистоту полученного таким образом рекомбинантного белка определяли методом электрофореза. Выход целевого белка составлял не менее 50 мг белка rtHEV-ORF2 с килограмма сырой биомассы.

Пример 5. Анализ рекомбинантного антигена rtHEV-ORF2.

Чистота рекомбинантного rtHEV-ORF2 определяли при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) путем окрашивания с Coomassie Brilliant Blue R-250. Чистота выделенного рекомбинантного антигена составляла не менее 95%.

Иммуноспецифичность рекомбинантного rtHEV-ORF2, а также уровень экспрессии в процессе ферментации, определяли методом иммуноблотинга. Первичными моноклональными антителами к капсидному белку HEV генотипа 3 (ab1011241, AbCam, UK) окрашивали иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген rtHEV-ORF2 на иммуноблоте представлен в виде белковой полосы размером 50-60 кДа.

Степень агрегации и приблизительный размер вирусоподобных частиц определяли методом эксклюзионной хроматографии на аналитической колонке TSK G5000PW (ToyoSoda Corp., Japan) в буфере 10 mM NaH₂PO₄, pH 7.2, 0.03% Tween-20. Первый острый пик элюируется на ~0.4 колоночных объема и представляет из себя белковые агрегаты. Последующий пологий пик, элюирующийся на ~0.55 колоночных объема, состоит из вирусоподобных частиц rtHEV-ORF2. Пики, соответствующие белкам невысокой молекулярной массы, в том числе мономерам рекомбинантного антигена, элюируются в диапазоне 0.7-0.9 колоночных объема.

Молекулярная масса rtHEV-ORF2 белка, определенная путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS, составляет 56 кДа.

Выделенный антиген rtHEV-ORF2 использовали для создания на его основе вакцины для профилактики вирусного гепатита E. Ниже приведены примеры композиций вакцины, полученных на основе выделенного антигена.

а) Вакцина для профилактики вирусного гепатита E содержит:

20 мкг rtHEV-ORF2, полученного путем культивирования штамма дрожжей H.polymorpha КБТ-11/pHEV-001

0,5 мг геля гидроокиси алюминия,

до 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), представленного 50 mM Na-фосфатаого буфера, pH 6,8 и 0,13 М NaCl.

б) Вакцина для профилактики вирусного гепатита E содержит:

30 мкг rtHEV-ORF2, полученного путем культивирования штамма дрожжей H.polymorpha КБТ-11/pHEV-001, 0,5 мг геля гидроокиси алюминия, до 1 мл ФСБ (50 mM Na-фосфатный буфер, pH 6,8 и 0,13 М NaCl)

в) Вакцина для профилактики вирусного гепатита E содержит:

50 мкг rtHEV-ORF2, полученного путем культивирования штамма дрожжей H.polymorpha КБТ-11/pHEV-001,

0,5 мг геля гидроокиси алюминия,

70 мкг мертиолята, до 1 мл ФСБ (50 mM Na-фосфатный буфер, pH 6,8 и 0,13 М NaCl).

Согласно изобретению вакцину на основе выделенного антигена можно получать как с введением в ее состав консерванта - мертиолята, так и без него. Отсутствие в составе консерванта не сказывается на качестве вакцины.

Иммуногенность рекомбинантной вакцины определяли путем иммунизации мышей Balb/c. Иммуногенность вакцины в тесте на мышах с массой 12-14 г составляет 0,05-0,1 мкг в расчете на ED₅₀ (доза вакцины, вызывающая сероконверсию у 50% мышей).

Токсичность вакцины определяли путем введения белым мышам 1,0 мл (20 мкг) вакцины внутрибрюшинно и 1,0 мл (20 мкг) вакцины морским свинкам подкожно. Наблюдение в течение 7 суток показало, что вакцина не токсична.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложены способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита E (rtHEV-ORF2) и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита E. Капсидный белок получают путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей Hansenula polymorpha КБТ-11/pHEV-001, содержащего интегрированную в геном клетки дрожжей последовательность ДНК, кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности с 86 по 607 позицию капсидного белка вируса гепатита E генотипа 3 (rtHEV-ORF2) под контролем промотора гена МОХ. Способ позволяет получить иммуногенный антиген вируса гепатита E, обладающий свойствами природного белка. На основе полученного антигена создана рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита E. Вакцина содержит эффективное количество rtHEV-ORF2 белка, адъювант и физиологически приемлемый разбавитель. Полученная вакцина является высокоиммуногенной, нетоксичной, не обладающей побочными эффектами. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита E генотипа 3 (rtHEV-ORF2), включающий культивирование штамма-продуцента, содержащего последовательность ДНК, кодирующую белок ORF2, в подходящих для экспрессии указанного белка условиях, выделение и очистку целевого белка, отличающийся тем, что культивируют рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha КБТ-11/pHEV-001, содержащий интегрированную в геном последовательность ДНК, включающую рекомбинантный ген, кодирующий полипептид rtHEV-ORF2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, под контролем промотора гена МОХ Hansenula polymorpha и ген LEU2 S.cerevisiae в качестве селективного маркера, а после выделения и очистки получают белок rtHEV-ORF2 в виде VLP, состоящей из мономеров с молекулярной массой мономера 56 кДа.

2. Рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита E, содержащая эффективное количество капсидного белка вируса гепатита E, адъювант и физиологически приемлемый разбавитель, отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса гепатита E вакцина содержит белок rtHEV-ORF2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, полученный по способу по п.1.

3. Рекомбинантная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что дополнительно содержит мертиолят.