СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛАКТОБАЦИЛЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОБИОТИКОВ И КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2017 года по МПК A61K35/741 A61K35/747 G01N33/569 

Область применения

Производство медицинских и ветеринарных пробиотиков, производство кисломолочных продуктов.

Способ повышения адгезивной активности разных видов лактобацилл, составляющих основу коммерческих биопрепаратов медицинского и ветеринарного назначения или входящих в состав кисломолочных продуктов, заключается в селективном отборе из популяции лактобацилл бактерий с повышенными адгезивными свойствами. В качестве субстрата, адгезирующего на себе микробные клетки, используются эритроциты человека или животных. При этом для повышения адгезивных свойств культур лактобацилл, входящих в состав биопрепаратов медицинского назначения и кисломолочных продуктов, целесообразно использовать эритроциты человека 0(I)Rh⁺ группы крови, а для микроорганизмов, составляющих основу ветеринарных пробиотиков, - эритроциты того же вида животных, для которых предназначен данный биопрепарат.

Адгезированные на эритроцитах бактерии, которые остаются на поверхности фильтра, высевают на плотную питательную среду и подращивают. Адгезивные свойства культуры из прикрепившихся к эритроцитам лактобацилл значительно улучшаются. При использовании данного способа адгезивная активность культур лактобацилл повышается до 80%.

Уровень техники

Известно, что при длительном поддержании культур лактобацилл на искусственных питательных средах в условиях отсутствия природной селекции высокоадгезивных бактерий, которая происходит в естественных местах их обитания (желудочно-кишечный тракт, слизистые оболочки мочеполовой системы), свойство микроорганизмов адгезироваться на поверхности эукариотических клеток значительно снижается и они утрачивают способность колонизировать слизистые кишечника, мочеполового тракта и длительно персистировать в организме млекопитающих, следовательно, снижается эффективность приготовленных на их основе пробиотических препаратов.

В настоящее время отсутствуют сведения о способах повышения адгезивной активности микробных культур, утративших это свойство в результате многочисленных пересевов или длительного поддержания на искусственных питательных средах.

При разработке способа повышения адгезивной активности пробиотических микроорганизмов была использована методика определения бактериофиксирующей активности эритроцитов, сущность которой заключается в том, что смесь взвесей микробов и эритроцитов инкубируют при температуре 36…38°С на шуттель-аппарате в течение 30 мин, центрифугируют до осаждения эритроцитов, а затем с помощью фотоэлектроколориметра определяют оптическую плотность надосадочной жидкости. Данная методика позволяет определять адгезивную активность микроорганизмов на поверхности эукариотических клеток [Романов В.Е. Ивонин, А.Г., Бондаренко, А.Л., Оборин, В.А. Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов // Патент России №2360969. 2007. Бюл. №19].

С помощью данного метода определяли уровень адгезии культур разных видов лактобацилл до и после их обогащения высокоадгезивными бактериями.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1

Для приготовления бактериальной суспензии культуру пробиотических лактобацилл подращивают на плотной питательной среде MRS, трижды отмывают в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия 7,2…7,4 ед. рН. Измерение оптической концентрации бактериальной суспензии проводят на колориметре фотоэлектрическом КФК-2 (Россия) при длине волны 540 нм, толщине кюветы 5 мм. Концентрация бактериальной суспензии доводится до 1,0 OD (оптической плотности).

Эритроциты крови (свежая цитратная кровь или эритроцитарная масса) трижды отмывают в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия 7,2…7,4 ед. рН, концентрация эритроцитов в физиологическом растворе доводится до 10¹² кл/л. Для повышения адгезивных свойств лактобацилл, входящих в состав медицинских биопрепаратов или кисломолочных продуктов, используются эритроциты человека 0(I)Rh⁺ группы крови, а для лактобацилл, составляющих основу ветеринарных пробиотических препаратов, - эритроциты крови того вида животного, которым выпаивается данный биопрепарат.

Для достижения адгезии бактериальных клеток на поверхности эритроцитов смесь суспензий бактерий 2,5 мл и эритроцитов 1 мл инкубируют в течение 30 мин при 36…38°С в шейкер-инкубаторе.

Бактерии, на поверхности которых имеются адгезины, адсорбируются на эритроцитах и образуют конгломераты, которые после центрифугирования оседают на дно центрифужной пробирки. Бактерии, утратившие способность адгезироваться, остаются в надосадочной жидкости. Отбор бактериальных клеток, адгезированных на эритроцитах, из суспензии свободных клеток осуществляют в два этапа.

1. Центрифугирование (в течение 5 минут при 1000 об/мин), при котором исследуемая суспензия эритроцитов и бактерий разделяется на две фракции - надосадочную жидкость, содержащую свободные бактериальные клетки, и осадок, состоящий из эритроцитов с адгезированными на них бактериальными клетками и свободных эритроцитов и бактериальных клеток. Надосадочную жидкость декантируют, измеряют ее оптическую концентрацию на колориметре фотоэлектрическом КФК-2 (Россия) при длине волны 540 нм, толщине кюветы 5 мм и вычисляют уровень адгезии бактериальной культуры (Пример вычисления см. в методике В.А. Оборина [Романов В.Е. Ивонин, А.Г., Бондаренко, А.Л., Оборин, В.А. Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов // Патент России №2360969. 2007. Бюл. №19]).

Осадок, состоящий из эритроцитов с адгезированными на них бактериальными клетками и свободных эритроцитов и бактериальных клеток, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия 7,2…7,4 ед. рН.

2. Фильтрация ресуспендированного осадка через мембранный фильтр с диаметром пор 1,2 мкм для освобождения от неприкрепившихся к эритроцитам бактерий: микроорганизмы, адгезированные на поверхности эритроцитов, образуют конгломераты и остаются на поверхности фильтра, а неприкрепившиеся бактерии свободно проходят через поры.

С поверхности фильтра адгезированные на эритроцитах бактерии пересевают на плотную питательную среду, выращивают при температуре 36…38°С в течение 24…48 часов, повторно измеряют уровень адгезии данной культуры и сравнивают с начальным значением адгезивной активности.

Пример 2. Повышение адгезивной активности культуры Lactobacillus plantarum 8Р-А3, входящей в состав пробиотического препарата «Лактобактерин»

Культуру бактерий L. plantarum 8Р-А3, выделенную из препарата «Лактобактерин», выращивают на плотной питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре 36…38°С, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия. Для адгезии клеток L. plantarum 8Р-А3 на поверхности эритроцитов смесь суспензий бактерий 2,5 мл и эритроцитов человека 0(I)Rh⁺ группы крови 1 мл инкубируют в течение 30 мин при температуре 36…38°С на шейкер-инкубаторе. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, измеряют ее оптическую плотность для определения начального уровня адгезии. Осадок, полученный в результате центрифугирования, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия и фильтруют через мембрану с диаметром пор 1,2 мкм.

С поверхности фильтра адгезированные на эритроцитах бактерии пересевают на плотную питательную среду, выращивают при температуре 36…38°С в течение 24 часов, повторно измеряют уровень адгезии /данной культуры и сравнивают с начальным значением адгезивной активности. Полученные результаты: начальный уровень адгезии культуры L. plantarum 8Р-А3 составил 17,6±8,3%, после обогащения популяции высокоадгезивными бактериями уровень адгезии культуры составил 73,7±15,7%, что на 56% выше начального значения.

Пример 3. Повышение адгезивной активности культуры Lactobacillus acidophilus LA-5, входящей в состав пробиотического препарата «Нормобакт»

Культуру L. acidophilus LA-5, выделенную из пробиотического препарата «Нормобакт», выращивают на плотной питательной среде MRS в течение 48 часов при температуре 36…38°С, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия. Для адгезии клеток L. acidophilus LA-5 на поверхности эритроцитов смесь суспензий бактерий 2,5 мл и эритроцитов человека 0(I)Rh⁺ группы крови 1 мл инкубируют в течение 30 мин при температуре 36…38°С на шейкер-инкубаторе. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об./мин. Надосадочную жидкость декантируют, измеряют ее оптическую плотность для определения начального уровня адгезии. Осадок, полученный в результате центрифугирования, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия и фильтруют через мембрану с диаметром пор 1,2 мкм.

С поверхности фильтра адгезированные на эритроцитах бактерии пересевают на плотную питательную среду, выращивают при температуре 36…38°С в течение 24 часов, повторно измеряют уровень адгезии данной культуры и сравнивают с начальным значением адгезивной активности. Полученные результаты: начальный уровень адгезии культуры L. acidophilus LА-5 составил 13,0±5,1%, после обогащения популяции высокоадгезивными бактериями уровень адгезии культуры составил 42,8±5,9%, что на 30% выше начального значения.

Пример 4. Повышение адгезивной активности культуры Lactobacillus rhamnosus, входящей в состав кисломолочного продукта «Имунеле»

Культуру L. rhamnosus, выделенную из кисломолочного продукта «Имунеле», выращивают на плотной питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре 36…38°С, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия. Для адгезии клеток L. rhamnosus на поверхности эритроцитов смесь суспензий бактерий (2,5 мл) и эритроцитов человека 0(I)Rh⁺ группы крови (1 мл) инкубируют в течение 30 мин при 36…38°С на шейкер-инкубаторе. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, измеряют ее оптическую плотность для определения начального уровня адгезии. Осадок, полученный в результате центрифугирования, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия и фильтруют через мембрану с диаметром пор 1,2 мкм.

С поверхности фильтра адгезированные на эритроцитах бактерии пересевают на плотную питательную среду, выращивают при температуре 36…38°С в течение 24 часов, повторно измеряют уровень адгезии данной культуры и сравнивают с начальным значением адгезивной активности. Полученные результаты: начальный уровень адгезии культуры L. rhamnosus составил (2,1±0,8)%, после обогащения популяции высокоадгезивными бактериями уровень адгезии культуры составил (20,3±5,0)%, что на 18% выше начального значения.

Пример 5. Повышение адгезивной активности культуры Lactobacillus paracasei В-11821, перспективной для создания ветеринарного пробиотического препарата

Штамм лактобактерий L. paracasei В-11821 (депонирован в ВКПМ ГосНИИГенетики (г. Москва) 14 октября 2014 г. под номером В-11821), который обладает выраженными пробиотическими свойствами и является перспективным для создания на его основе ветеринарного пробиотического препарата, выращивают на плотной питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре 36…38°С, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия (7,2…7,4 ед. рН). Для адгезии клеток L. paracasei В-11821 на поверхности эритроцитов смесь суспензий бактерий (2,5 мл) и эритроцитов человека 0(I)Rh⁺ группы крови (1 мл) инкубируют в течение 30 мин при 36…38°С на шейкер-инкубаторе. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, измеряют ее оптическую плотность для определения начального уровня адгезии. Осадок, полученный в результате центрифугирования, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия и фильтруют через мембрану с диаметром пор 1,2 мкм. С поверхности фильтра адгезированные на эритроцитах бактерии пересевают на плотную питательную среду, выращивают при температуре 36…38°С в течение 24 часов. Повторно измеряют уровень адгезии культуры.

Полученные результаты: начальный уровень адгезии культуры L. paracasei В-11821 составил (50,7±3,4)%, что соответствует высокой адгезивной активности. Однако при длительном поддержании культуры in vitro на искусственных питательных средах в условиях отсутствия селекции высокоадгезивных бактерий, которая происходит в естественных местах их обитания, уровень адгезии культуры может значительно снижаться.

Для имитации процесса длительного поддержания штамма в условиях in vitro на искусственных питательных средах культуру L. paracasei В-11821 подвергали последовательным пересевам в жидкой питательной среде MRS. Уже после 15 пересевов уровень адгезии лактобактерий понизился в два раза и составил (25,1±10,0)%. После обогащения искусственно состаренной культуры L. paracasei В-11821 высокоадгезивными бактериями ее уровень адгезии повысился и составил (40,38±6,2)%.

Пример 6. Влияние адгезивных свойств Lactobacillus paracasei В-11821 на эффективность пробиотика на его основе

Берут две культуры L. paracasei В-11821: первая - с высоким уровнем адгезии (50,7±3,4)%, вторая - со средним уровнем адгезии (25,1±10,0)%. Каждую из них выращивают в жидкой питательной среде MRS на капустном отваре до конечной концентрации живых клеток (4,1±0,5)⋅10⁹ КОЕ/мл. Затем в каждую культуру в качестве стабилизатора вносят сахарозу до конечной концентрации 10% [Позолотина Н.В. Технология приготовления жидкой формы ветеринарного пробиотического препарата на основе штамма Lactobacillus paracasei / Н.В. Позолотина, И.В. Дармов, И.В. Маракулин, И.П. Погорельский // Фундаментальные исследования. - 2015. - №2.ч 10. - С. 2164-2169].

Полученные пробиотические добавки выпаивают поросятам-отъемышам сразу после отъема от свиноматки. Для этого формируют три равноценные группы поросят по 30 голов в каждой группе. Первой группе поросят-отъемышей выпаивают пробиотик на основе высокоадгезивной культуры L. paracasei В-11821, второй - пробиотик на основе среднеадгезивной культуры, третья группа является контрольной и не получает пробиотический препарат. Рацион питания и условия содержания поросят всех групп одинаковый. Пробиотические добавки выпаивают один раз в сутки по следующей курсовой схеме, представленной в таблице 1.

В ходе эксперимента оценивали живую массу поросят-отъемышей, среднесуточные привесы и сохранность поголовья. Результаты научно-производственного опыта представлены в таблице 2.

Как видно из данных таблицы 2, показатели опытных групп поросят выше по сравнению с данными показателями контрольной группы. Пробиотик на основе высокоадгезивной культуры L. paracasei В-11821 обеспечивает достоверное увеличение привесов на 8,2%, живой массы - на 8,0% и сохранности поголовья на 6,7% по сравнению с животными второй группы, получающих пробиотик на основе среднеадгезивной культуры. Из полученных результатов следует, что адгезивные свойства пробиотических микроорганизмов значительно влияют на эффективность пробиотического препарата на их основе.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к способу повышения адгезивной активности культур лактобацилл. Способ повышения адгезивной активности культур лактобацилл, включающий в себя выращивание на плотной питательной среде MRS лактобактерий при температуре 36-38°C в течение 24-48 ч, подготовку суспензии лактобактерий до концентрации 1 OD и суспензии эритроцитов до концентрации 10¹² кл./мл в физиологическом растворе хлорида натрия при рН, равном 7,2-7,4, инкубирование смеси суспензий бактерий 2,5 мл и эритроцитов 1 мл в шейкер-инкубаторе в течение 30 мин при 36-38°C, центрифугирование смеси в течение 5 мин при 1000 об./мин, декантирование надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка в физиологическом растворе хлорида натрия при рН равном 7,2-7,4, фильтрацию ресуспендированного осадка через мембранный фильтр с диаметром пор 1,2 мкм для освобождения от неприкрепившихся к эритроцитам бактерий, пересев лактобактерий с поверхности фильтра на плотную питательную среду MRS и выращивание культуры при температуре 36-38°C в течение 24-48 часов. Вышеописанный способ позволяет эффективно повысить адгезивную активность культур лактобацилл по сравнению с исходными значениями. 2 табл., 6 пр.

Способ повышения адгезивной активности культур лактобацилл, включающий в себя выращивание на плотной питательной среде MRS лактобактерий при температуре 36…38°C в течение 24…48 ч, подготовку суспензии лактобактерий до концентрации 1 OD и суспензии эритроцитов до концентрации 10¹² кл./мл в физиологическом растворе хлорида натрия при рН, равном 7,2…7,4, инкубирование смеси суспензий бактерий 2,5 мл и эритроцитов 1 мл в шейкер-инкубаторе в течение 30 мин при 36…38°C, центрифугирование смеси в течение 5 мин при 1000 об/мин, декантирование надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка в физиологическом растворе хлорида натрия при рН, равном 7,2…7,4, фильтрацию ресуспендированного осадка через мембранный фильтр с диаметром пор 1,2 мкм для освобождения от неприкрепившихся к эритроцитам бактерий, пересев лактобактерий с поверхности фильтра на плотную питательную среду MRS и выращивание культуры при температуре 36…38°C в течение 24…48 часов.