Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 Российский патент 2017 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии бактерий на модели эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта и клеточной линии HEp 2.

Известны способы определения среднего показателя адгезии по методу Брилис В.И. (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ [1]. При постановке опыта на предметное стекло наносили одну каплю буферного раствора (0,1 М раствор фосфата натрия на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3), в котором суспендировали по одной петле взвесь эритроцитов, предварительно дважды отмытых буферным раствором путем центрифугирования (300-1000 об/мин), концентрацией 100 млн/мл и одну петлю густой суточной суспензии культуры микроорганизмов (№6 по Mc Earland), выращенных в оптимальной жидкой питательной среде. На одно стекло наносили 3 капли суспензии разных микроорганизмов. Предметное стекло с эритроцитами и микробами помещали во влажную камеру на 30 минут при температуре 37°C. Затем препарат высушивали при той же температуре, фиксировали в пламени спиртовки и окрашивали по методу Грама. При микроскопии подсчитывали среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту. Подсчитывали не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения, это средний показатель адгезии (СПА).

Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от 1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА свыше 4,0. Вариации результатов при данном методе ±15%.

Недостатком способа является то, что он определяет степень адгезии только к эритроцитам, которые несут определенные адгезины, которые отсутствуют на поверхности других клеток человека и не могут быть показателем адгезии па эпителиальных клетках.

Известен способ определения уровня адгезивной активности штаммов пробиотиков на модели эпителиальных клеток [2]. Забор эпителиальных клеток производят при проведении диагностической гистероскопии и раздельном диагностическом выскабливании стенок шейки матки и цервикального канала при различных неинфекционных заболеваниях тела матки.

В асептических условиях под внутривенной анестезией шейка матки обнажается куско- или ложкообразными зеркалами. После этого производят соскоб эпителия слизистой оболочки боковых стенок влагалища.

После забора материал помещают в транспортный контейнер с жидкой питательной средой 199. Контейнер обкладывают льдом.

Клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (pH 7,2) центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. После определения концентрации клеток с помощью камеры Горяева под световым микроскопом ее разводят до 1,5-2 × 10⁶ кл/мл.

Далее готовят суспензию штамма с концентрацией 2×10⁹ микробных кл/мл, 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток смешивают с 0,5 мл взвеси бактериальной культуры.

Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при 37°C в течение 30 мин, периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от не прилипших микробов при 600 об/мин по 10 мин.

Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1-2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют смесью равных частей медицинского эфира и 96° спирта и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Под световым микроскопом подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 эпителиоцитам.

При оценке адгезии каждого штамма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СПА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Степень адгезии считают:

- неадгезивную (СПА = 0);

- слабоадгезивную (СПА = 1-5);

- среднеадгезивную (СПА = 5-10);

- высокоадгезивную (СПА = выше 10).

Недостатками способа являются специфика рецепторов клеток слизистой оболочки влагалища, особенности забора эпителиальных клеток под внутривенной анестезией, использование холода.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии HEp 2 (клетки рака гортани).

Авторы предлагают способ, характеризующийся простотой, удобством, малыми временными затратами и высокой результативностью.

Способ позволяет изучить адгезивные свойства микроорганизмов непосредственно на эпителиальных клетках, при этом клетки располагаются в виде монослоя, что позволяет определить количество адгезивных бактерий с большой точностью.

Техническим результатом заявленного изобретения является хорошая воспроизводимость результатов с использованием минимального количества биомассы микроорганизмов в микрообъемах, отсутствие необходимости использования опасных химических реагентов и анестезии.

Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом.

Перед забором материала с целью элиминации собственных микроорганизмов полости рта испытуемому дают полоскание, состоящее их смеси пищевого хитозана на Абисибе (экстракт сибирской пихты), в течение 1-2 мин. При этом слизистая оболочка освобождается от собственной микрофлоры.

После этого медицинским стерильным ершиком производится забор эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта и вносится в пробирку с 5 мл среды 199.

Клетки дважды отмывают забуференным физраствором (ЗФР) (0,1 М раствор фосфата натрия, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3) и центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. Все манипуляции производят при комнатной температуре.

Концентрацию клеток определяют на денситометре из расчета 2×10⁶ кл/мл.

Затем смешивают 0,1 мл взвеси эпителиальных клеток с 0,1 мл суспензии бактерий (2×10⁹ кл/мл или №6 по Мс Farland), выращенных в оптимальной жидкой или плотной питательной среде. Далее смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР при 600 об/мин по 10 мин. После удаления супернатанта из осадка делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму.

Под световым микроскопом считают среднее количество бактерий на поверхности не менее 25 эпителиоцитов.

В отношении клеточной линии HEp 2 концентрацию выросших клеток сразу определяют на денситометре исходя из указанного расчета, и далее определение проводится так же, как и с эпителиальными клетками.

При оценке адгезии каждого штамма (ОФС 42 - Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения) опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СНА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Степень адгезии считают: слабоадгезивную (СПА = 0-1,9); среднеадгезивную (СПА = 2-4,9); высокоадгезивную (СПА = выше 5).

Пример 1. У выделенных из полости рта лактобацилл определяли уровень адгезии по методу Брилис В.И. (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ и на клетках эпителия полости рта по предложенному нами методу. Результат СПА представлен в таблице 1. Как видно из таблицы, данные по определению СПА не совпадают и изменяются в основном в большую сторону при определении СПА на эпителиальных клетках полости рта.

Пример 2. Определение СПА у других микроорганизмов полости рта показало несовпадение результатов в сторону увеличения степени адгезии на клетках эпителия полости рта (табл. 2). По-видимому, это связано с наличием большего числа сайтов адгезии на поверхности эпителия полости рта.

Список используемой литературы

1. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лабораторное дело, 1986, №4, с. 210-212.

2. ОФС 42 - Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии. Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 заключается в том, что осуществляют забор материала, получают из указанного материала суспензию клеток с концентрацией 2×10⁶ кл/мл, определенной на денситометре, смешивают 0,1 мл полученной суспензии клеток с 0,1 мл суспензии бактерий с концентрацией 2×10⁹ кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, после инкубирования смесь трехкратно отмывают забуференным физраствором при 600 об/мин по 10 мин, далее удаляют супернатант из осадка и делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму, под микроскопом подсчитывают в 10 полях зрения среднее количество адсорбированных микроорганизмов - средний показатель адгезии, проведя не менее трех опытов, и считают степень адгезии от 0 до 1,9 - низкоадгезивной, от 2 до 4,9 - среднеадгезивной, свыше 5 - высокоадгезивной, при условии, что в случае забора эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта его осуществляют медицинским ершиком после предварительного полоскания раствором антисептика хитозана на Абисибе. 2 пр., 2 табл.

Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2, заключающийся в том, что осуществляют забор материала, получают из указанного материала суспензию клеток с концентрацией 2×10⁶ кл/мл, определенной на денситометре, смешивают 0,1 мл полученной суспензии клеток с 0,1 мл суспензии бактерий с концентрацией 2×10⁹ кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, после инкубирования смесь трехкратно отмывают забуференным физраствором при 600 об/мин по 10 мин, далее удаляют супернатант из осадка и делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму, под микроскопом подсчитывают в 10 полях зрения среднее количество адсорбированных микроорганизмов - средний показатель адгезии, проведя не менее трех опытов, и считают степень адгезии от 0 до 1,9 - низкоадгезивной, от 2 до 4,9 - среднеадгезивной, свыше 5 - высокоадгезивной, при условии, что в случае забора эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта его осуществляют медицинским ершиком после предварительного полоскания раствором антисептика хитозана на Абисибе.