Способ получения пептидов, индуцирующих собственные стволовые клетки Российский патент 2023 года по МПК C07K1/36 A61K35/57 C12N5/73 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению пептидов индуцирующих собственные стволовые клетки IPSC.

Известно средство для заживления ран «Целльгель» (см. RU 2481115 C1, опубл.10.05.2013, МПК А61К 35/48), содержащее основу в виде геля и компоненты на основе развивающихся эмбрионов, птиц, в частности, оно содержит продукты жизнедеятельности клеток куриного эмбриона 3-8 дней гестации в концентрации от 0,75х10⁶ до 1,25х10⁶ клеток фенотипа CD34⁺ CD45 ^dim в 1мл основы в виде геля, в качестве которого используют гель полиэтиленоксида ТУ 9154-004-11821987-93, при этом средство для заживления ран, полученное на основе гомогената развивающихся эмбрионов птицы, в котором используется куриный эмбрион, полученная тканевая суспензия гомогенизируется и выделяются клетки из тканевой суспензии, определяя фенотип клеток, отслеживая, жизнеспособность клеток с фенотипом CD34⁺ CD45 ^dim не ниже 80%,

Известно средство средство для регенерации тканей (патент РФ 2707186 C1 от 25.11.19), в виде лекарственных форм, содержащих вспомогательные вещества и клеточную массу тканей эмбрионов птиц и/или других животных, несущих на себе рецептор, определяемый специфическими моноклональными антителами, как клетки фенотипа CD 34 + за исключением CD 34+ 45 dim

В отличие от прототипа основным преимуществом предлагаемого способа получения пептидов индуцирующих собственные стволовые клетки IPSC, является то, что в конечном результате отсутствуют любые цельные клетки. И впервые получена фракция, содержащая пептиды, способные индуцировать собственные стволовые плюрипотентные клетки, в культуре МНК определяемые тест системами как клетки фенотипа CD34, А также индуцирующие омнипотентные стволовые клетки в культуре стандартых фибробластов определяемые тест системами как клетки фенотипа Oct 4.

Задачей изобретения является создание простого, быстрого, удобного и экономически эффективного способа получения пептидов.

Техническим результатом способа является возможность получения пептидов, которые могут найти свое применение в косметологии как средство антивозрастной терапии, в медицине как средство для лечения травматических и дегенеративных процессов, а также как средство позволяющее получить омнипотентные клетки, что в перспективе позволит проводить работы по выращиванию органов и может, одновременно, являться субстратом, для получения лекарственных средств, может использоваться, как средство ускоряющее заживление ран различного генеза, а также обеспечить лечение внутренних органов и тканей, благодаря повышению регенерирующей и репаративной активности, то есть способ обеспечивает получение лекарственных средств.

Технический результат достигается способом получения пептидов индуцирующих собственные стволовые клетки, к котором используют клеточную массу эмбрионов кур до момента появления антигена гистосовместимости, гомогенизацию ткани проводится механическим путем при температуре + 23-25°С, гомогенат ступенчато фильтруют, при этом размер пор 40-1000 мкм для отделения стромы, затем гомогенат ступенчато центрифугируют для выделения из массы эмбриональных клеток плюрипотентных стволовых, затем раствором 0,9% хлорида натрия концентрацию клеток доводят до 1,0х106±0,6х106 клеток в 1 мл раствора, полученную суспензию инкубируют в течение суток при температуре 27- 37°С с содержанием 0 - 5% СО2 в атмосфере, через сутки, надосадок, содержащий продукты жизнедеятельности эмбриональных клеток отбирают и центрифугируют 10 -120 мин на скорости свыше 1,5 тысячи оборотов в мин, после чего проводят ступенчатую фильтрацию синтетическими фильтрами, из полученного очищенного раствора при помощи полиблочной препаративной системы высоко-эффективной жидкостной хроматографии выделяют пептидную фракцию, полученный раствор сушится при отрицательном давлении, до получения кристаллического порошка.

Сущность заявляемого изобретения поясняется описанием и примером конкретного выполнения, а также лабораторными подтверждениями индукции стволовых клеток.

Пример конкретного выполнения

Способ получения пептидов индуцирующих собственные стволовые клетки IPSC.:

Использовалась клеточная масса эмбрионов кур до момента появления антигена гистосовместимости (МНС), мроверенный на стерильность материал находящийся в 2±0,3 мл 0,9 % водного раствора хлорида натрия помещали в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США). Гомогенизацию ткани проводили в течение 30 секунд при температуре + 23-25°С. Далее гомогенат извлекался при помощи стерильного шприца, рабочую камеру гомогенизатора трижды промывали 0,9% водным раствором хлорида натрия объемом 1 мл. После гомогенат фильтровали через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 40 мкм. Для удаления надосадочной жидкости гомогенат центрифугировали при 400 g в течение 5 минут при 3 раза по 1 мл. NaCl 0.9%. Профильтровали суспензию через фильтр Filcons (Becton Dickinson, USA), диаметр пор 50 мкм. Концентрация клеток при этом составляла 1×10⁶ кл/мл. температуре + 25°С. Жизнеспособность клеток определяли при помощи витального красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США) используя проточный цитофлюориметр Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: объема и светорассеяния в боковом направлении (SSLin) и регистрацией флуорисценции (7-AAD), фенотип клеток определяли с помощью спецефических моноклональных антител (Beckman Coulter, США) предназначающихся для диагностики in vitro с целью идентификации клеток, экспрессирующих антиген CD34. Жизнеспособность клеток с фенотипом CD34+ должна была составлять не ниже 85±5 %. В случае более низкого показателя образец отбраковывался. При помощи 0,9% хлорида натрия концентрация клеток в образце доводилась до 1,0х10⁶±0,1х10⁶ клеток в 1 мл раствора. Полученную суспензию инкубировали в культуральных флаконах (PP Techno Plastic Products AG, Швейцария) с поверхностью роста 150 см2 и барьером внутри флакона, создающим поверхность роста 115 см2, в течение суток в СО2 инкубаторе при изменяемой температуре 27- 37°С с изменяемым содержанием 0 - 5% СО2 в атмосфере. Через сутки, надосадок, содержащий продукты жизнедеятельности эмбриональных клеток отбирали и центрифугировали 120 мин на скорости 3,5 тысячи оборотов в мин, после чего проводили ступенчатую фильтрацию синтетическими фильтрами с диаметром пор 40, 20, 5 мкм. Из полученного очищенного раствора при помощи полиблочной препаративной системы высоко-эффективной жидкостной хроматографии фирмы Shimadzu LC-20 Prominence (Япония), оборудованной насосом LC-AP, автодозатором SIL-10a, спектрофотометрическим детектором SPD-20A, колонкой TSKgel Amide-80 (10 мкм, 21,5 mm ID x 30 cm L (0014460)) и коллектором фракций FRC-10A, выделялась содержащая пептиды фракция. Объем образца составил 5 мл. Подвижная фаза состояла из дистиллированной воды в объемном соотношении со скоростью потока 20 мл/мин. Программное обеспечение LabSolution использовалось для настройки сбора необходимой пептид-содержащей фракции.

Подтверждение наличия пептидов:

Последующий анализ С с помощью добавления 80% спирта мы избавлялись от высокомолекулярных пептидных молекул сохраняя в растворе олигопептиды и относительно короткие полипептиды при этом раствор выдерживали в холодильнике при минус 20 градусах Цельсия после чего центрифугировали 1,5 минуты при 14,5 тыс. оборотах, все конденсированные крупные молекулы и иные не растворенные компоненты осаждались, жидкая фаза анализировалась. После центрифугирования фракция, содержащая в себе растворенные олигопептиды анализировалась стандартным методом определение протеинов спектрофотометре Эппендорф. Последовательное измерение показало, что в образце имеется наличие пептидов. В ходе анализа получены следующие результаты Sample Dilution μL A280 Result 0,257 mg/mL.

Примеры индукции IPSC клеток инвитро

Полученная пептидная фракция эмбриональных стволовых клеток собиралась, лиофилизировалась, растворялась в дистиллированной воде в различных концентрациях мкг/мл и использовалась для тестирования индукции ISPC, и определения изменения жизнеспособности клеток.

Эксперимент по воздействию субстанцции SiRoP(Signal Regenerative oligoptides) на индукцию собственных стволовых клеток фенотипа CD34 в культуре МНК (мононуклеаров) крови человека.

Субстанция SiRoP (Signal Regenerative oligoptides) содержит сигнальные пептиды, получаемые из супернатанта культуры стволовых клеток куриного эмбриона.

Предположительный механизм индукции: сигнальным пептидом активируются митохондрии собственных стволовых клеток , увеличение интенсивности тканевого дыхания индуцирует деление собственных стволовых клеток по асимметричному типу.

Дизайн эксперимента:

Инструкции по тестированию

Цель: определить, как исследуемое вещество влияет на продолжительность жизни клеточной культуры и ее пролиферативную активность.

Шаг 1

Отбор и подготовка клеточных культур.

Для получения культуры МНК (мононуклеарной фракции лимфоцитов человека) в ходе предложенного пилотного эксперимента была выбрана донорская венозная кровь, девяти относительно здоровых добровольцев в возрасте 30-70 лет 4 мужчины 5 женщин.

Затем мы применили среду для разделения клеток с градиентом плотности (, Diacoll-1,077) для отделения мононуклеарной культуры лимфоцитов от венозной крови.

Шаг 2

было проведено исследование, включающее культивирование клеточной культуры в экспериментальной группе Субстанция SiRoP и контрольной группе без компонента Субстанция SiRoP. Культивирование клеток включало 1 миллион клеток в 1 мл культуральной среды (Dulbecco modified Eagles medium) для клеточных культур. Субстанцию SiRoP добавляли в экспериментальную группу с 75 мкг, 150 мкг и 300 мкг, разведенных в 1 мл.

Шаг 3

Клеточные культуры контролировали и ежедневно количественно определяли клетки методом проточной цитометрии .

Ежедневный зондовый отбор проб помог нам определить жизнеспособность клеток, количество клеток в 1 мл и количество клеток фенотипа CD34+.

Шаг 4

Сравнили результаты, полученные в экспериментальной и контрольной группах. Тестирование завершилось, как только количество живых клеток уменьшилось до нуля. (Примерно 25 дней)

Требования к оборудованию: проточный цитометр

CytoFLEX Beckman Coulter для подсчета клеток фенотипа CD34 используются моноклональные антитела. Автоматизированный счетчик Клеток TC 20 Bio rad

инкубатор для культивирования СО2-клеток, центрифуга.

Материалы: донорская кровь (20 мл),.

Реагенты: Diacoll-1077,

RPMI 1640, полная питательная среда (Модифицированная среда Dulbecco Eagles medium)

Результаты, см. таблицу 1.

Тестирование проведено на общепринятой стандартной культуре фибробластов человека 7 пассажа методом прямого контакта для тестирования препаратов.

Все работы с культурой проводили в ламинарных боксах. Культивирование проводили в СО2 инкубаторе. Поставлена серия экспериментов: индукция клеток фенотипа Okt 4 в культуре фибробластов в присутствии исследуемых пептидов (SiRoP).

Определение наличия клеток фенотипа Okt 4 определяли при помощи проточного цитометра по методу исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа клеток по сигналам светорассеяния и флуоресценции при помощи моноклональных антител.

Результаты, см. таблицу 2.

Из приведенных примеров видно, что заявляемое изобретение, являющееся новым средством позволяющим реализовать широкое применение вещества при лечении дегенеративно - дистрофических процессов, травматических и нейротрофических повреждений. В косметологии может быть использовано как средство для омоложения клеток кожи, защиты от морщин, повышения сопротивляемости кожи и замедления старения тканей, а также для ускорения заживления

Основным преимуществом предлагаемого средства является высокая эффективность, широкий спектр показаний использования, длительность хранения без утраты лечебных свойств.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пептидов, индуцирующих собственные стволовые клетки. Клеточную массу эмбрионов кур до момента появления антигена гистосовместимости гомогенизируют механическим путем. Для выделения из массы эмбриональных клеток плюрипотентных стволовых клеток гомогенат фильтруют, центрифугируют, затем снова фильтруют. Раствором хлорида натрия концентрацию клеток доводят до 1,0×10⁶±0,6×10⁶ клеток в 1 мл раствора, полученную суспензию инкубируют в течение суток. Через сутки надосадок, содержащий продукты жизнедеятельности эмбриональных клеток, отбирают и центрифугируют, после чего проводят ступенчатую фильтрацию. Из полученного очищенного раствора при помощи полиблочной препаративной системы высокоэффективной жидкостной хроматографии выделяют пептидную фракцию. Полученный раствор сушат при отрицательном давлении до получения кристаллического порошка. Изобретение позволяет получить пептиды, индуцирующие собственные стволовые клетки. 2 табл., 1 пр.

Способ получения пептидов, индуцирующих собственные стволовые клетки, отличающийся тем, что используют клеточную массу эмбрионов кур до момента появления антигена гистосовместимости, гомогенизацию ткани проводят механическим путем при температуре +23-25°С, гомогенат фильтруют, при этом размер пор фильтра составляет 40 мкм, для отделения стромы, затем гомогенат центрифугируют для удаления надосадочной жидкости, затем суспензию фильтруют, при этом размер пор фильтра составляет 50 мкм, для выделения из массы эмбриональных клеток плюрипотентных стволовых клеток, затем раствором 0,9% хлорида натрия концентрацию клеток доводят до 1,0×10⁶±0,6×10⁶ клеток в 1 мл раствора, полученную суспензию инкубируют в течение суток при температуре 27-37°С с содержанием 0-5% СО₂ в атмосфере, через сутки надосадок, содержащий продукты жизнедеятельности эмбриональных клеток, отбирают и центрифугируют 120 мин на скорости 3,5 тысячи оборотов в мин, после чего проводят ступенчатую фильтрацию синтетическими фильтрами с диаметром пор 40, 20, 5 мкм, из полученного очищенного раствора при помощи полиблочной препаративной системы высокоэффективной жидкостной хроматографии выделяют пептидную фракцию, полученный раствор сушат при отрицательном давлении до получения кристаллического порошка.