СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ РОДА Coccidioides poasadasii 36 S И Coccidioides immitis C-5 Российский патент 2014 года по МПК C12N1/14 C12Q1/02 

Изобретение относится к медицине, касается лабораторной диагностики возбудителей кокцидиоидомикоза.

Кокцидиоидомикоз (болезнь Вернике-Посады) - неконтагиозный системный микоз, проявляющийся как первичная легочная инфекция, либо как прогрессирующие гранулематозные поражения кожи, суставов, костей, внутренних органов и мозговых оболочек. Возбудители кокцидиоидомикоза, Coccidioides spp. - до недавнего времени были представлены единым видом С.immitis. Углубленные исследования генома грибов позволили разделить штаммы на две группы - калифорнийскую и некалифорнийскую. В соответствии с этими данными, начиная с 2004 г., грибы рода Coccidioides подразделяются на два вида: С.immitis и С.posadasii. Тем не менее до настоящего времени морфологических различий у культур различной видовой принадлежности не установлено.

Проблема идентификации микромицетов (микроскопических грибов), имеющих значение в развитии патологических состояний, весьма актуальна, так как определяет в дальнейшем тактику лечения больного и подбор эффективных лекарственных средств. В микологической практике наиболее часто используются методы, направленные на изучение макро- и микроморфологии культур. Данная концепция диагностики получила название морфологической или фенотипической, когда для определения единицы вида проводится определение морфологических характеристик изучаемого штамма и сравнительный анализ путем установления различий с родственными видами. Этот методологический подход реализуется путем культивирования микроскопических грибов в условиях, позволяющих получить культуры микромицетов с характерной морфологией.

Возбудители кокцидиоидомикоза относятся к диморфным грибам, отличающимся способностью существовать в двух физиологических фазах и соответственно в двух морфологических формах. Сапрофитическая фаза представлена мицелиальной формой, в которой возбудители кокцидиоидомикоза обитают в окружающей среде, а также растут на питательных средах, применяемых для культивирования микроскопических грибов. Штаммы Coccidioides spp. в течение 3-5 дней инкубации при 28°С на поверхности плотного питательного агара образуют сероватые плесневые колонии. При микроскопическом изучении культур, находящихся в мицелиальной форме, выявляются гифы, состоящие из бочонкообразных артроспор, чередующиеся с более мелкими стерильными разделительными клетками. По мере развития и созревания мицелия происходит его распад на более короткие фрагменты и отдельно лежащие артроконидии (4-6 мкм длиной) с «обрывками» клеток разделителей в виде усиков, расположенных по углам. Однако образование артроконидий свойственно не только Coccidioides spp., но и некоторым дрожжеподобным грибам и дерматофитам, имеющим сходное строение: Auxarthron spp., Oidiodendron spp., Gymnoascus spp., следовательно морфология мицелиальной формы Coccidioides spp, не является строго специфичной.

При ингаляции артроконидии Coccidioides spp. в тканях легких происходит развитие тканевой или паразитарной фазы. Она представлена сферулами - округлыми образованиями от 10 до 200 мкм в диаметре, заполненными эндоспорами (от единичных до нескольких сотен). Эндоспоры имеют овальную или неправильную форму. Двойная стенка сферул достигает 2 мкм в поперечнике. Окончательным установлением диагноза кокцидиоидомикоза служит выявление морфологических элементов микроскопического гриба, характерных для паразитарной фазы, а именно сферул. Следует учитывать, что незрелые сферулы, то есть недифференцированные образования, не могут приниматься во внимание в связи с отсутствием типичных признаков, таких как двойная оболочка и наличие эндоспор.

Культивирование грибов в тканевой (паразитарной) фазе на питательных средах, т.е. iv vitro достаточно сложно. Известен способ культивирования 3-4-х месячных культур Coccidioides spp. на среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки, 2,835 mg Na₂PO₄×7H₂O на литр, 0,8 mg N-Tamol, 40 ед. пенициллина и 40 mg стрептомицина на миллилитр, в атмосфере 5% CO₂ при 35°С. Через 48 ч после первичного посева грибная взвесь фильтруется и вновь засевается в свежую порцию питательной среды того же состава. Полноценные сферулы формируются в течение 84 суток, обязательным является пересев культуры в свежие порции питательной среды через каждые 48 ч культивирования (Alan F. Petkus, Linda L. Baum, Robert B. Ellis, Malvin Stern and David L. Danley «Pure Spherules of Coccidioides immitis in continuous culture», Journal of Clinical Microbaiology, Aug., 1985, p.165-167). Представленный способ является трудоемким, дорогостоящим и весьма продолжительным по времени, что делает нецелесообразным его использование для обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides spp.

Наиболее близким аналогом является способ обнаружения возбудителей кокцидиоидомикоза in vivo. Он предусматривает заражение белых мышей взвесями 2-х недельных культур Coccidioides spp., и наблюдения за ними в течение 7 суток. После этого мышей умерщвляют, извлекают печень у трех животных и добавляют 10 мл 10%-ного раствора КОН, прогревают на кипящей водяной бане 15 мин и после растворения биопробного материала обеззараживают формалином. Затем обеззараженную суспензию в объеме 1,5 мл центрифугируют при 5000 об/мин, супернатант удаляют, а из осадка готовят мазки для световой микроскопии без окрашивания и при обнаружении сферул судят о наличии возбудителя кокцидиоидомикоза. (Т.А. Гришкина, B.C. Лесовой, Е.В. Тимофеева, В.А. Спиридонов «Способ обнаружения возбудителя кокцидиоидомикоза». Патент РФ №2265844, C1 G01N 33/48, 2004). Существенным недостатком данного способа является то, что для его исполнения необходимо проводить работу с зараженными биопробными животными, а также более длительное время исследования по сравнению с предлагаемым способом.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка простого и эффективного способа обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides spp. in vitro.

Техническим результатом является сокращение сроков исследования и упрощение способа, за счет того, что исследование не требует многократных пересевов, выполняется in vitro без использования биопробных животных.

Поставленный технический результат достигается тем, что проводят предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, конверсию культуры в тканевую фазу и обнаружение сферул в виде округлых двухконтурных образований, заполненных эндоспорами. Способ отличается тем, что культуру выращивают в течение 3-х сут и приготовленной из нее взвесью заражают суточную культуру клеток мышиных спленоцитов, культивируют в течение 5 сут при температуре 37°C, с содержанием в атмосфере 5% CO₂. затем отбирают пробу в объеме 0,1 мл, обеззараживают формалином и исследуют методом световой микроскопии в препарате «раздавленная» капля при увеличении ×600.

Пример 1 (оптимальный):

Штаммы Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 культивируют на среде Сабуро при 28°С в течение 3 сут. Затем культуры смывают 0,15 М раствором хлорида натрия, рН 6,8, готовят взвесь, соответствующую 5 ЕД отраслевого стандартного образца мутности ГИСК им. Тарасовича (ОСО) и 0,5 мл взвеси вносят в планшеты с культурами клеток спленоцитов.

Культуру клеток мышиных спленоцитов в виде монослоя подготавливают за сутки до этапа заражения грибными культурами. В качестве доноров спленоцитов используют инбредных мышей BALB/c. Выделяют селезенку с соблюдением правил асептики, гомогенизируют ее в бессывороточной среде RPMI-1640 с помощью стеклянного дезинтегратора, затем дважды отмывают клеточную взвесь центрифугированием 1000 об/мин в течение 10 мин, ресуспендируют осадок в 5-10 мл той же среды. Подсчет спленоцитов проводят в камере Горяева, оценивают их концентрацию и жизнеспособность с помощью 0,4% раствора трипанового синего. Высев спленоцитов на планшеты производят из расчета 5,0-8,0×10⁴ кл/см². Культивирование мышиных спленоцитов осуществляют в среде RPMI-1640, pH 7,2 в присутствии 2 mM бикарбоната натрия, 20 mM Hepes, 10% ЭТС («Биолот»), без добавления антибиотиков, в CO₂ инкубаторе (Hereus) при 37 С, в атмосфере с содержанием 5% CO₂ в течение 24 час, затем инфицируют полученную в виде монослоя культуру мышиных спленоцитов взвесями грибов и дополнительно культивируют при тех же условиях в течение 5 сут. Пробы обеззараживают добавлением формалина в количестве 10% от объема пробы в течение 24 ч, готовят нативные препараты «раздавленная» капля и исследуют методом световой микроскопии (увеличение ×600). В результате во всех полях зрения наблюдаются сферулы различной степени зрелости, от юных форм, имеющих размеры 5-10 мкм, до зрелых, размером 60-80 мкм, с выраженной двухконтурной оболочкой и сформированными эндоспорами.

Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro включает предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул, заполненных эндоспорами. Культуру в мицелиальной фазе выращивают в течение 3-х суток. Обеспечение возможности формирования сферул осуществляют путем заражения суточной культуры клеток мышиных спленоцитов, полученной на среде RPMI-1640, и последующего культивирования в течение 5 суток при температуре 37°C, с содержанием в атмосфере 5% CO₂. Для обнаружения сферул в виде округлых двухконтурных образований, заполненных эндоспорами, отбирают пробу, обеззараживают формалином и исследуют образец методом световой микроскопии. Изобретение позволяет упростить способ и сократить сроки исследования. 1 пр.

Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro, включающий предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул в виде округлых двухконтурных образований, заполненных эндоспорами, отличающийся тем, что культуру в мицелиальной фазе выращивают в течение 3-х суток, причем обеспечение возможности формирования сферул осуществляют путем заражения суточной культуры клеток мышиных спленоцитов, полученной на среде RPMI-1640, и последующего культивирования в течение 5 суток при температуре 37°C, с содержанием в атмосфере 5% CO₂, а для обнаружения сферул в виде округлых двухконтурных образований, заполненных эндоспорами, отбирают пробу, обеззараживают формалином и исследуют образец методом световой микроскопии.