КОМПОЗИЦИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ, ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Escherichia coli, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКОЙ КОМПОЗИЦИИ. Российский патент 2014 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 A61K39/295 A61P31/04 

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии и может быть использовано в производстве биологически активных добавок и добавок к пище.

Распространение антибиотикоустойчивых бактерий, а также открытие роли биопленок, устойчивых к антибиотикам, в развитии хронических инфекций, возродило интерес к использованию бактериофагов. В настоящее время проводится интенсивная разработка «пищевых» бактериофагов. Ведутся исследования в отношении возможности применения фагов в виде биологически активных добавок к пище (БАД) для санации потенциальных бактериовыделителей (Протокол заседания Ученого совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 21.06.2011 №18. - URL: http://rospotrebnadzor.ru/c/document_library/get_file?uuid=786c5589-е19с-4550-9a7e-c4675d621cca&groupId=37752).

Известно использование бактериофагов в качестве пищевых добавок - ингредиентов - для предотвращения размножения в пищевых продуктах патогенных бактерий: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Enterobacter sakazakii, Pseudomonas spp. (Hagens S., Loessner M.J. Bacteriophage for biocontrol of foodborne pathogens: calculations and considerations. - Current Pharmaceutical Biotechnology. - 2010. - Vol.11, №1. - P.58-68; Walker К. Use of bacteriophages as novel food additives. - URL: http://biocontrolfood.esr.cri.nz/Phage%201aw%20downloads/Phages%20and%20food%20regulation%20in%20the%20US%20by%20Kathy%20Walker.pdf).

Основным недостатком известных аналогов применения бактериофагов в качестве пищевых ингредиентов является необходимость включения в состав добавок достаточно большого числа бактериофагов для расширения спектра специфической активности в связи с отсутствием использования бактериофагов, обладающих литический активностью по отношению к нескольким бактериям (далее по тексту описания, формулы и реферата изобретения такие бактериофаги называются поливалентными бактериофагами), и целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию поливалентной и индуцированной активности бактериофагов.

Известны бактериофаги, обладающие литический активностью по отношению к нескольким бактериям (поливалентные бактериофаги), например: бактериофаг ϕmp, вызывающий лизис Escherichia coli, Klebsiella pneumonia и Aerobacter aerogenes (Souza K.A., Ginoza H.S., Haight R.D. Isolation of a polyvalent bacteriophage for Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Aerobacter aerogenes. - Journal of virology. - 1972. - Vol.9, №5 - P.851-856); бактериофаг O-1, вызывающий лизис сальмонелл и Escherichia coli (Welkos S., Schreiber M., Baer H. Identification of Salmonella with the O-1 bacteriophage. - Applied microbiology. - 1974. - Vol.28, №4. - P.618-622).

Основным недостатком данных известных технических решений является то, что они не могут быть использованы в качестве БАД, так как не обладают активностью против необходимого спектра возбудителей и не содержат целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию поливалентной и индуцированной активности бактериофагов.

Наиболее близким аналогом - прототипом - заявляемого технического решения является композиция, которая может быть использована в производстве БАД, содержащая видоспецифические вирулентные бактериофаги и бактериофаги с индуцированной вирулентностью с литической активностью не ниже 10^-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий в фильтрате фаголизата нелизогенных бактерий, и целевые добавки. Данная композиция может содержать бактериофаги, выбранные из ряда: стафилококковый бактериофаг, стрептококковый бактериофаг, коли бактериофаг, протейный бактериофаг, синегнойный бактериофаг, сальмонеллезный бактериофаг, шигеллезный бактериофаг, энтерококковый бактериофаг и клебсиеллезный бактериофаг. Композиция может также содержать целевые добавки в количестве 1,0÷95,0 мас.% от массы композиции, выбранные из ряда: глицин, цистеин, гистидин, хинозол, хитозан, экстракт корня солодки, экстракт шиповника, экстракт душицы, экстракт клюквы и вкусоароматическая добавка, и представлена в виде суспензии (патент RU 2366437 от 10.05.2009, А61К 35/74, А61Р 31/04).

Основным недостатком известного прототипа является необходимость включения в состав добавок большого числа бактериофагов для расширения спектра специфической активности в связи с отсутствием использования поливалентных бактериофагов и подбора состава целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию поливалентной и индуцированной активности бактериофагов.

Главной задачей, решаемой изобретением, является упрощение состава биологически активной добавки к пище на основе бактериофагов при достижении необходимого спектра специфической активности за счет включения поливалентного бактериофага в состав активных ингредиентов и подбора целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию поливалентной и индуцированной активности бактериофагов (далее по тексту описания, формулы и реферата изобретения - целевые добавки).

Поставленная задача реализуется за счет того, что композиция антибактериальная включает комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий с литической активностью не ниже 10^-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий: фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий поливалентный бактериофаг, обладающий литический активностью по отношению к патогенным бактериям не менее двух разных родов семейства Enterobacteriaceae, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки. Фильтрат фаголизата Escherichia coli в качестве вирулентного поливалентного бактериофага может содержать штамм бактериофага Escherichia coli ECD7, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64. Фильтрат фаголизата Escherichia coli может содержать вирулентный коли бактериофаг и/или коли бактериофаг с индуцированной вирулентностью. Фильтрат стафилококкового фаголизата может содержать вирулентный стафилококковый бактериофаг и/или стафилококковый бактериофаг с индуцированной вирулентностью. Композиция в качестве фильтрата сальмонеллезного фаголизата может включать фильтрат фаголизата Salmonella enteritidis, фильтрат фаголизата Salmonella infantis и фильтрат фаголизата Salmonella typhimurium. Фильтраты фаголизатов Salmonella enteritidis, Salmonella infantis и Salmonella typhimurium могут содержать вирулентный сальмонеллезный бактериофаг и/или сальмонеллезный бактериофаг с индуцированной вирулентностью. Фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes может содержать вирулентный листериозный бактериофаг и/или листериозный бактериофаг с индуцированной вирулентностью. Композиция может включать целевые добавки в количестве 1,0÷95,0 мас.% от массы композиции в виде их смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки, пектин яблочный, глицин. Данная композиция в связи с достаточным спектром стабильной специфической активности может быть использована при профилактике и лечении инфекционного заболевания в виде БАД.

Штамм бактериофага Escherichia coli ECD7 выделен из фекалий бройлерных кур на культуре бактерий штамма Escherichia coli O104:H4 №112027 и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64.

Штамм бактериофага Escherichia coli ECD7 характеризуется следующими свойствами:

- обладает литической поливалентной активностью по отношению к энтерогеморрагическим штаммам Escherichia coli серотипов O104:H4, O157:Н7, Escherichia coli некоторых других клинически значимых серогрупп, указанных в таблице 1, кроме того, лизирует бактерии некоторых штаммов возбудителей дизентерии человека - Shigella sonnei и Shigella flexneri;

- не подавляет рост бактерий непатогенного для человека штамма Escherichia coli М-17;

- на чувствительном бактериальном штамме формирует мутные негативные колонии диаметром 1-2 мм.

В качестве коли бактериофага, стафилококкового бактериофага, сальмонеллезного бактериофага и листериозного бактериофага композиция может содержать любые бактериофаги с соответствующей специфической активностью, используемые в виде фаголизатов (фильтратов фаголизатов), пригодные для получения медицинских иммунобиологических препаратов, пищевых добавок или биологически активных добавок к пище (например: Бактерийные, вирусные и сывороточные лечебно-профилактические препараты Аллергены. Дезинфекционно-стерилизационные режимы поликлиник. - СПб.: Фолиант, 1998. - С.180-244; патент SU 538025 от 05.12.1976, С12К 1/04, А61В 10/00; патент WO 2008/100273 от 21.08.2008, C12N 7/00, 7/01, 7/02; патент RU 2425877 от 26.02.2010, C12N 7/00, C12R 1/19).

В качестве коли бактериофага в композиции может использоваться бактериофаг, специфичный для всех изолятов Escherichia coli O157:H7, который может быть не активен для других эшерихий, шигелл и иерсиний.

В качестве стафилококкового бактериофага в композиции может использоваться бактериофаг, вирулентный для клинических штаммов Staphylococcus aureus, в том числе штаммов MRSA - метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus aureus.

В качестве сальмонеллезного бактериофага в композиции могут использоваться бактериофаги против Salmonella enteritidis (в том числе штаммов SE6, SE19 и/или SE40), против Salmonella typhimurium и/или против Salmonella infantis.

В качестве листериозного бактериофага в композиции может использоваться бактериофаг, лизирующий штаммы Listeria monocytogenes (например, штаммы 2, 6, 660, 944, 4908, 4909, 4910, 4913, 4944, 7973, 10522, 766ГИСК, 4ИП, 12ИП, 16ИП, 20ИП, 46ИП, 53ИП, 61ИП, 766ИП, Аисх., С20/10357, C-52, C-212, EGD, EGDe, Gim03, M-5, M-6).

Перечень тест-штаммов, в отношении которых фильтраты фаголизатов композиции антибактериальной обладают литической активностью:

Escherichia coli штамм К-12 C600F, Escherichia coli серотип O157:H7 штамм 1330, Escherichia coli серотип O157:H7 штамм АТСС 51658, Escherichia coli серотип O157:H7 штамм 4, Escherichia coli серотип O157:H7 штамм Т 5133, Escherichia coli серотип O78 штамм 3001; Staphylococcus aureus штаммы 2075, FRI-722, 1789 WOOD, 209-P; Salmonella enteritidis штаммы М4, 1540, 9, 10, 14, 29, 31, 37, 47, 48, 53, 60, 85, 89, 92, 93, 109, 111, 114 m-, 121, 124, 126, 127, 128, 132, 137, 139, 140 g-, 141; Salmonella typhimurium штамм ТГ1; Salmonella infantis штамм 1271; Listeria monocytogenes штаммы EGDe, Gim03, 7973, C20/10357, C-52, Аисх., EGD, M-6, 12ИП, 20ИП, 4908, 4944, 944, C-212, 6, M-3, 2, 16ИП, 660, 4909, 4913, 766ГИСК, 61ИП, 53ИП, М-5, 766ИП, 46ИП, 10522, 4ИП, 4910, WSLC 1001.

В основу заявляемого изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: впервые предложено использование поливалентного бактериофага, обладающего литический активностью по отношению к патогенным бактериям не менее двух родов семейства Enterobacteriaceae, как основы композиции в виде БАД при оригинальном сочетании поливалентного бактериофага с моновалентными, дополняющими необходимый спектр специфической активности, вирулентными бактериофагами и бактериофагами с индуцированной вирулентностью при впервые подобранной смеси целевых добавок, обеспечивающих стабилизацию как поливалентной, так и индуцированной активности бактериофагов.

Из патентно-технической литературы и практики производства биологически активных добавок, добавок к пище и медицинских иммунобиологических препаратов неизвестно об антибактериальной композиции, включающей комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий, которая были бы идентична заявляемой.

Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - упрощения состава биологически активной добавки к пище на основе бактериофагов при достижении необходимого спектра специфической активности за счет включения поливалентного бактериофага в состав активных ингредиентов и подбора целевых добавок. Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ может быть реализован многократно, а, значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Предлагаемый способ апробирован в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора).

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, полученных при апробации предлагаемого способа, показывающих упрощение состава биологически активной добавки к пище на основе бактериофагов при достижении необходимого спектра специфической активности за счет включения поливалентного бактериофага в состав активных ингредиентов и подбора целевых добавок. При этом приведенные примеры вариантов композиции антибактериальной, получения фаголизата Escherichia coli, содержащего поливалентный бактериофаг штамма Escherichia coli ECD7, проверки спектра антибактериального действия штамма бактериофага ECD7, проверки взаимодействия бактериофагов композиции антибактериальной с производственными штаммами лактобацилл и бифидобактерий и с нормальной микрофлорой кишечника показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения.

Пример 1. Получение фильтрата фаголизата Escherichia coli, содержащего поливалентный бактериофаг штамма Escherichia coli ECD7. К 1 мл

ночной бульонной культуры Escherichia coli К-12 C600F добавляли 4 мл бульона LB (содержащего на 1 л среды 10 г триптона Bacto, 5 г дрожжевого экстракта Bacto, 10 г натрия хлорида) и 10 мкл суспензии штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 с концентрацией 10⁹ БОЕ/мл. Смесь инкубировали на качалке при температуре 37°С до наступления просветления бактериальной культуры, добавляют 0,5 мл хлороформа и интенсивно перемешивали в течение 20 мин. Низкоскоростным центрифугированием (10000 g, 15 мин) с последующей микрофильтрацией (размер пор фильтра 0,22 мкм) удаляли обломки бактериальных клеток и титровали фильтрат фаголизата методом двойных агаровых слоев. Концентрацию бактериофага выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл фаголизата. В полученном фаголизате концентрация бактериофага составляла 10⁹ БОЕ/мл.

Пример 2. Проверка спектра антибактериального действия штамма бактериофага ECD7. Спектр антибактериального действия штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 проверяли методом спот-тестов. Для этого по 0,5 мл ночных бульонных бактериальных культур, указанных в таблице 1, смешивали с 4 мл полужидкого агара (бульона LB, содержащего 0,7% агара) при температуре 47°С и распределяли по поверхности питательного агара (например, Nutrient Agar, HIMEDIA) в чашке Петри. Через 20 мин на поверхность наносили каплю штамма бактериофага ECD7 (10⁷ БОЕ/мл) и инкубировали при температуре 37°С в течение ночи. При визуальном осмотре на чашках с чувствительными культурами бактерий рост бактериального газона отсутствовал в местах внесения штамма бактериофага (прозрачное пятно лизиса). Во всех остальных случаях таких зон не обнаруживалось.

Таблица 1 Литический спектр штамма бактериофага ECD7 (спот-тесты) Бактериальные штаммы Литическая активность Escherichia coli O104:H4 №112027 + Escherichia coli O157:Н7 (8)^∗ + Escherichia coli М-17 - Escherichia coli других серогрупп:   O104:H12 + O1, O4, O79, O111, O115, O138, O139, O141, O147 - O6, O26, O126 +   +(2) O25 (4) -(2)   +(3) O78 (7) -(4) Escherichia coli K-12 C600F + Shigella sonnei + Shigella flexneri (17) +(13) -(4) Shigella dysenteriae - Примечания: * - в скобках - количество штаммов, используемых при проверке; «+» - наличие лизиса; «-» - отсутствие лизиса.

Пример 3. Получена композиция антибактериальная с литической активностью не ниже 10^-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий поливалентный бактериофаг Escherichia coli ECD7, обладающий литический активностью по отношению к патогенным бактериям двух родов семейства Enterobacteriaceae (Escherichia и Shigella), депонированный в коллекции музея микроорганизмов (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, фильтрат стафилококкового фаголизата, содержащий стафилококковый бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, фильтрат фаголизата Salmonella enteritidis, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella enteritidis, фильтрат фаголизата Salmonella infantis, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella infantis, фильтрат фаголизата Salmonella typhimurium, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella typhimurium, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes, содержащий листериозный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью. Композиция также включала целевые добавки в количестве 1,0 мас.% от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки, пектин яблочный и глицин. Проведены исследования стабильности поливалентной активности штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 в образцах композиции, хранящихся в течение года, и тестирование всех бактериофагов композиции на лизогению. Литическая активность поливалентного штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 по отношению к чувствительным к нему штаммам Escherichia coli серотипов O104:Н4, O157:Н7, O104:Н12, O6, O26, O126, O25, O78 и К-12 C600F, чувствительным к нему штаммам Shigella sonnei, Shigella flexneri составляла не ниже 10^-4 по Аппельману. Литическая активность других штаммов бактериофагов композиции также составляла не ниже 10^-4 по Аппельману. Тесты на лизогению были отрицательные. Для испытания биодоступности полученной композиции ее образец массой 0,6 г вносился в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование препарата в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример 4. Получена композиция антибактериальная с литической активностью не ниже 10^-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий поливалентный бактериофаг Escherichia coli ECD7, обладающий литический активностью по отношению к патогенным бактериям двух родов семейства Enterobacteriaceae (Escherichia и Shigella), депонированный в коллекции музея микроорганизмов (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг в виде бактериофага с индуцированной вирулентностью, фильтрат стафилококкового фаголизата, содержащий стафилококковый бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, фильтрат фаголизата Salmonella enteritidis, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella enteritidis, фильтрат фаголизата Salmonella infantis, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella infantis, фильтрат фаголизата Salmonella typhimurium, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella typhimurium, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes, содержащий листериозный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью. Композиция также включала целевые добавки в количестве 1,0 мас.% от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки и глицин. Проведены исследования стабильности поливалентной активности штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 в образцах композиции, хранящихся в течение года, и тестирование всех бактериофагов композиции на лизогению. Литическая активность поливалентного штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 по отношению к чувствительным к нему штаммам Escherichia coli серотипов O104:Н4, O157:Н7, O104:Н12, O6, O26, O126, O25, O78 и К-12 C600F, чувствительным к нему штаммам Shigella sonnet, Shigella flexneri составляла не ниже 10^-4 по Аппельману. Литическая активность других штаммов бактериофагов композиции также составляла не ниже 10^-4 по Аппельману. Тесты на лизогению были отрицательные. Для испытания биодоступности полученной композиции ее образец массой 0,6 г вносился в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование препарата в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример 5. Получена композиция антибактериальная с литической активностью не ниже 10^-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий поливалентный бактериофаг Escherichia coli ECD7, обладающий литический активностью по отношению к патогенным бактериям двух родов семейства Enterobacteriaceae (Escherichia и Shigella), депонированный в коллекции музея микроорганизмов (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг в виде вирулентного бактериофага, фильтрат стафилококкового фаголизата, содержащий стафилококковый бактериофаг в виде вирулентного бактериофага, фильтрат фаголизата Salmonella enteritidis, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella enteritidis, фильтрат фаголизата Salmonella infantis, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella infantis, фильтрат фаголизата Salmonella typhimurium, содержащий сальмонеллезный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью, обладающие литической активностью по отношению к Salmonella typhimurium, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes, содержащий листериозный бактериофаг в виде вирулентного бактериофага и бактериофага с индуцированной вирулентностью. Композиция также включала целевые добавки в количестве 1,0 мас.% от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки, пектин яблочный и глицин. Проведены исследования стабильности поливалентной активности штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 в образцах композиции, хранящихся в течение года, и тестирование всех бактериофагов композиции на лизогению. Литическая активность поливалентного штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 по отношению к чувствительным к нему штаммам Escherichia coli серотипов O104:Н4, O157:Н7, O104:Н12, O6, O26, O126, O25, O78 и К-12 C600F, чувствительным к нему штаммам Shigella sonnet, Shigella flexneri составляла не ниже 10^-4 по Аппельману. Литическая активность других штаммов бактериофагов композиции также составляла не ниже 10^-4 по Аппельману. Тесты на лизогению были отрицательные. Для испытания биодоступности полученной композиции ее образец массой 0,6 г вносился в среду 199. Отмечалось равномерное диспергирование препарата в водной среде и сохранение в растворе не менее 99% литической активности композиции.

Пример. 6. Проверка взаимодействия бактериофагов композиции антибактериальной с производственными штаммами лактобацилл и бифидобактерий. В 4 пробирки с 9 мл бифидум-среды (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) вносили по 1 мл суточной культуры (также выращенной на бифидум-среде при 38°С) одного из производственных штаммов лактобацилл или бифидобактерий (Lactobacillus acidophilus NK1, Lactobacillus acidophilus 100аш, Lactobacillus acidophilus K3III24, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Bifidobacterium adolescentis MC-42, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium bifidum ЛВА-3, Bifidobacterium longum Я-3, Bifidobacterium breve 79-119, Bifidobacterium infantis 73-15) в концентрации 10³ КОЕ/мл. Одна пробирка была контрольная (в среду добавляли только производственный штамм). В две другие опытные пробирки вносили по 1 мл композиции антибактериальной. В четвертую пробирку сравнения вносили 1 мл интести-бактериофага (ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России). Содержимое пробирок перемешивали пипетированием и инкубировали в течение 17 часов при температуре 38°С. Оценку роста производственных штаммов проводили путем визуального сравнения оптической плотности содержимого пробирок. Сомнительные случаи проверяли титрованием. Оптическая плотность содержимого каждого ряда из четырех пробирок была одинаковая. Все штаммы лактобацилл и бифидобактерий вырастали в каждом из четырех рядов пробирок одинаково.

Пример 7. Проверка взаимодействия бактериофагов композиции антибактериальной с нормальной микрофлорой кишечника, выделенной от 50 пациентов. Фекалии, полученные от пациентов, суспендировали в физиологическом растворе из расчета 1 г фекалий на 9 мл физиологического раствора. Далее из основного разведения суспензий делали ряд последующих разведении в физиологическом растворе. Для проверки взаимодействия бактериофагов композиции антибактериальной с бифидобактериями по 1 мл суспензии из каждой пробирки полученного ряда разведении суспензий вносили в опытные пробирки, содержащие 9 мл бифидум-среды (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора), и 1 мл испытуемой композиции антибактериальной. В контрольные пробирки композицию антибактериальную не добавляли. В пробирку сравнения вместо композиции антибактериальной вносили 1 мл интести-бактериофага (ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России). Все образцы культивировали при 37°С двое суток, после чего сравнивали темпы роста и морфологию бифидобактерий. Угнетение роста бифидобактерий не происходило. Для проверки взаимодействия бактериофагов композиции антибактериальной с лактобациллами по 1 мл суспензии из каждой пробирки полученного ряда разведении суспензий вносили в опытные пробирки, содержащие 4,5 мл среды МРС-4 (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова), и 0,5 мл испытуемой композиции антибактериальной. В контрольные пробирки композицию антибактериальную не добавляли. В пробирку сравнения вместо композиции антибактериальной вносили 1 мл интести-бактериофага (ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России). Все образцы культивировали при 37°С двое суток, после чего сравнивали темпы роста и морфологию лактобацилл. Угнетение роста лактобацилл не происходило. Для проверки взаимодействия бактериофагов композиции антибактериальной с изолятами нормальной кишечной палочки использовали среду Эндо (НПО «Питательные среды», г.Махачкала). Через 24 часа инкубации в термостате при 37°С выделяли характерные для кишечной палочки колонии и идентифицировали их. Из типичных колоний готовили микробную взвесь, соответствующую по плотности 10 ед. ОСО - 0,93×10⁹ клеток/мл. Каплю взвеси наносили на чашку Петри с плотной питательной средой на основе кровяного агара и растирали шпателем до полного высыхания по всей поверхности чашки равномерно. Делили чашку на три сектора. Через 30 мин на засеянную поверхность в первый сектор наносили каплю композиции антибактериальной, каплю интести-бактериофага - во второй сектор, а третий сектор оставляли интактным. Затем посевы термостатировали сутки при температуре 37°С. Результаты исследования оценивали визуально по наличию или отсутствию пятна лизиса в секторе. Композиция антибактериальная ни в одном случае не лизировала нормальную кишечную палочку. В 30% случаев (15 образцов штаммов нормальной кишечной палочки, выделенной от пациентов) интести-бактериофаг лизировал нормальную кишечную палочку.

Пример 8. Пациент П., 53 года. Диагноз: Энтероколит. При микробиологическом исследовании в фекалиях была выявлена Escherichia coli серотипа O104:Н4. Затем пациенту перорально в количестве 40 мл 3 раза в сутки в течение 7 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 1,0 мас.% от массы композиции. После прохождения курса терапии с использованием композиции антибактериальной клинические проявления энтероколита разрешились, Escherichia coli серотипа O104:Н4 микробиологическим методом в фекалиях не обнаруживалась.

Пример 9. Пациентка А., 45 лет. Диагноз: Сальмонеллез. При микробиологическом исследовании в фекалиях была выявлена Salmonella typhimurium. Затем пациентке перорально в количестве 30 мл 3 раза в сутки в течение 7 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 45,0 мас.% от массы композиции. После прохождения курса терапии с использованием композиции антибактериальной клинические проявления сальмонеллеза разрешились, Salmonella typhimurium микробиологическим методом в фекалиях не обнаруживалась.

Пример 10. Пациент С., 32 года. Диагноз: Энтероколит. При микробиологическом исследовании в фекалиях была выявлена Escherichia coli серотипа O157:Н7. Затем пациенту перорально в количестве 40 мл 3 раза в сутки в течение 5 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 95,0 мас.% от массы композиции. После прохождения курса терапии с использованием композиции антибактериальной клинические проявления энтероколита разрешились, Escherichia coli серотипа O157:Н7 микробиологическим методом в фекалиях не обнаруживалась.

Пример 11. Проверка профилактического действия композиции антибактериальной. В стационарах лечебно-профилактического учреждения города N наблюдались случаи нозокомиальной инфекции, вызванной Salmonella typhimurium. Каждому второму пациенту, поступающему в стационар, в количестве 40 мл 3 раза в сутки в течение 6 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 1,0 мас.% от массы композиции. Среди пациентов, не получавших композицию антибактериальную, наблюдались случаи нозокомиальной инфекции, вызванной Salmonella typhimurium. Среди пациентов, получавших композицию антибактериальную, случаи нозокомиальной инфекции, вызванной Salmonella typhimurium, не наблюдались.

Пример 12. Проверка профилактического действия композиции антибактериальной. В городе N в летний период среди туристов наблюдались случаи инфекции, вызванной Salmonella enteritidis. Группе туристов в количестве 100 человек, приехавших в город N, в количестве 40 мл 3 раза в сутки в течение 6 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 55,0 мас.% от массы композиции. Среди туристов, не получавших композицию антибактериальную, наблюдались случаи инфекции, вызванной Salmonella enteritidis. Среди туристов, получавших композицию антибактериальную, случаи инфекции, вызванной Salmonella enteritidis, не наблюдались.

Пример 13. Проверка профилактического действия композиции антибактериальной. На предприятии общественного питания города N среди клиентов наблюдались случаи пищевой инфекции, вызванной Escherichia coli серотипа O157:Н7. Каждому второму клиенту, посещающему предприятие общественного питания, в количестве 40 мл 3 раза в сутки в течение 5 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 95,0 мас.% от массы композиции. Среди клиентов, не получавших композицию антибактериальную, наблюдались случаи кишечной инфекции, вызванной Escherichia coli серотипа O157:Н7. Среди клиентов, получавших композицию антибактериальную, случаи кишечной инфекции, вызванной Escherichia coli серотипа O157:Н7, не наблюдались. С целью дальнейшего предотвращения распространения кишечной инфекции, вызванной Escherichia coli серотипа O157:Н7, деятельность предприятия была приостановлена на 5 дней и персоналу предприятия количестве 40 мл 3 раза в сутки в течение 5 дней вводилась композиция антибактериальная, включающая фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий штамм бактериофага Escherichia coli, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером РП 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 95,0 мас.% от массы композиции. После этого случаи кишечной инфекции, вызванной Escherichia coli серотипа O157:Н7, на предприятии общественного питания среди клиентов прекратились.

Изобретение относится к области пищевой промышленности, биотехнологии и касается композиции антибактериальной и штамма бактериофага Escherichia coli, используемого для получения такой композиции. Охарактеризованная композиция антибактериальная включает фильтрат фаголизата Escherichia coli, полученный с использованием штамма бактериофага Escherichia coli, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 1,0÷95,0 мас.% от массы композиции. Представленная композиция имеет необходимый спектр специфической активности за счет включения поливалентного бактериофага и может быть использована в производстве биологически активных добавок и добавок к пище. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл., 13 пр.

1. Композиция антибактериальная, включающая комбинацию фильтратов фаголизатов бактерий, отличающаяся тем, что она обладает литической активностью не ниже 10^-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий и включает фильтрат фаголизата Escherichia coli, полученный с использованием штамма бактериофага Escherichia coli, депонированного в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64, фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий коли бактериофаг, фильтрат стафилококкового фаголизата, фильтрат сальмонеллезного фаголизата, фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes и целевые добавки в количестве 1,0÷95,0 мас.% от массы композиции.

2. Композиция антибактериальная по п.1, отличающаяся тем, что она включает фильтрат фаголизата Escherichia coli, содержащий вирулентный коли бактериофаг и/или коли бактериофаг с индуцированной вирулентностью.

3. Композиция антибактериальная по п.1, отличающаяся тем, что она включает фильтрат стафилококкового фаголизата, содержащий вирулентный стафилококковый бактериофаг и/или стафилококковый бактериофаг с индуцированной вирулентностью.

4. Композиция антибактериальная по п.1, отличающаяся тем, что она в качестве фильтрата сальмонеллезного фаголизата включает фильтрат фаголизата Salmonella enteritidis, фильтрат фаголизата Salmonella infantis и фильтрат фаголизата Salmonella typhimurium.

5. Композиция антибактериальная по п.4, отличающаяся тем, что фильтрат фаголизата Salmonella enteritidis содержит вирулентный сальмонеллезный бактериофаг и/или сальмонеллезный бактериофаг с индуцированной вирулентностью.

6. Композиция антибактериальная по п.4, отличающаяся тем, что фильтрат фаголизата Salmonella infantis содержит вирулентный сальмонеллезный бактериофаг и/или сальмонеллезный бактериофаг с индуцированной вирулентностью.

7. Композиция антибактериальная по п.4, отличающаяся тем, что фильтрат фаголизата Salmonella typhimurium содержит вирулентный сальмонеллезный бактериофаг и/или сальмонеллезный бактериофаг с индуцированной вирулентностью.

8. Композиция антибактериальная по п.1, отличающаяся тем, что она включает фильтрат фаголизата Listeria monocyctogenes, содержащий вирулентный листериозный бактериофаг и/или листериозный бактериофаг с индуцированной вирулентностью.

9. Композиция антибактериальная по п.1, отличающаяся тем, что она включает целевые добавки в виде смеси ингредиентов, выбранных из ряда: сироп корня солодки, пектин яблочный и глицин.

10. Композиция антибактериальная по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что она может быть использована при профилактике и лечении инфекционного заболевания.

11. Штамм бактериофага Escherichia coli, используемый для получения композиции антибактериальной по п.1, депонированный в коллекции музея микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под номером Ph 64.