СПОСОБ ВИТАЛЬНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/76 A61P15/08 A61D19/02 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к андрологии и репродуктологии и к ветеринарии, а именно к способам для размножения или оплодотворения животных. Изобретение также применимо в научных исследованиях.

Из существующего уровня техники известен способ иммобилизации (обездвиживания) сперматозоидов путем механического переламывания или перетирания хвоста сперматозоида микроинъекционной иглой о дно чашки Петри непосредственно перед процедурой ICSI (intracytoplasmic sperm injection - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида). Данный методический прием является неотъемлемой частью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия (в рамках процедуры ICSI), широко используется и стал классическим (In vitro fertilization: a practial approach / edited by David K, Gardner. Informa Healthcare USA. Inc: ISBN-13: 978-0-8493-3335-4; p.167-169). Аналогично, данный подход к иммобилизации сперматозоидов используется при ICSI яйцеклеток домашних и лабораторных животных (Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52:709-720).

Недостатком данного технического решения является тот факт, что иммобилизованные таким образом сперматозоиды нежизнеспособны в связи с нарушением целостности цитоплазматической мембраны клетки и аппарата передвижения - хвоста и должны быть немедленно использованы в процедуре ICSI. То есть данный методический прием иммобилизации является мортальным (смертельным) для сперматозоида, и по истечении короткого промежутка времени такой сперматозоид становится непригодным для искусственного оплодотворения яйцеклетки методом ICSI.

Наиболее близким по принципу действия (но не по целям и задачам) к заявленному техническому решению является Hypo Osmotic Swelling Test (HOS-Test), основанный на способности хвостов живых сперматозоидов набухать в гипоосмолярной среде, который используется для оценки целостности цитоплазматической мембраны сперматозоида и определения, таким образом, его жизнеспособности. Принцип действия HOS-Test основан на гидратировании цитоплазмы сперматозоидов с неповрежденной цитоплазматической мембраной в гипоосмотической среде, что приводит к видимым морфологическим изменениям в его хвосте. Таким образом, принцип действия HOS-Test (эффект воздействия гипоосмотической среды на сперматозоиды) аналогичен принципу действия, заложенному в патентуемом способе, однако служит для решения совершенно иных целей и задач. Непосредственно HOS-Test не предназначен и не пригоден для витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является осуществление витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных для использования их в дальнейшем в диагностических либо лечебных целях.

Данная задача решается за счет того, что заявленный способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных характеризуется тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы или центрифугируют эякулят в градиенте плотности, или сперматозоиды отбирают в результате флотации и переносят в среду для иммобилизации на время от 1 мин до 4 часов и характеризующейся пониженной осмоляльностью (100-170 mOsmol/kg), значением рН, находящимся в диапазоне от 7,0 до 8,0, газовой средой, содержащей от 0,1 до 8% углекислого газа, температурой среды от 0 до 39°C для поддержания жизнеспособности иммобилизованных сперматозоидов.

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для создания необходимой осмоляльности 100-170 mOsmol/kg содержит химические соединения, преимущественно соли: натрия хлорид (NaCl) - 41-70 mmol/l, калия хлорид (KCl) - 1,25-4,8 mmol/l, калий фосфорнокислый однозамещенный (КН₂РО₄) - 0-0,8 mmol/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na₂HPO₄) - 0-0,3 mmol/l, сульфат магния семиводный (MgSO₄×7H₂O) - 0-0,8 mmol/l, хлорид кальция двуводный (CaCl₂×2Н₂О) - 0,3-1,2 mmol/l, бикарбонат натрия (NaHCO₃) - 0-27,0 mmol/l, натрия пируват - 0-0,25 mmol/l, L-натрия лактат - 0-7,0 mmol/l.

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе HEPES (0-15,0 mM/l), бикарбоната натрия (0-27,0 mM/l), фосфатного буфера (калий фосфорнокислый однозамещенный - 0-0,8 mM/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0-0,3 mM/l), цитратного буфера (цитрат натрия - 0-70,0 mM/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват (0-0,25 mmol/l), L-натрия лактат (0-7,0 mmol/l), глюкозу (0-5,0 mmol/l), фруктозу (0-5,0 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин (0-0,05 mmol/l), аспарагиновую кислоту (0-0,05 mmol/l), аспарагин (0-0,05 mmol/l), аргинин (0-0,5 mmol/l), цистин (0-0,07 mmol/l), глутамин (0-0,5 mmol/l), аланил-глутамин (0-1,0 mmol/l), глицин (0-0,05 mmol/l), гистидин (0-0,06 mmol/l), изолейцин (0-0,01 mmol/l), лейцин (0-0,05 mmol/l), лизин (0-0,08 mmol/l), метионин (0-0,02 mmol/l), фенилаланин (0-0,02 mmol/l), пролин (0-0,05 mmol/l), серин (0-0,05 mmol/l), таурин (0-0,05 mmol/l), треонин (0-0,02 mmol/l), триптофан (0-0,002 mmol/l), тирозин (0-0,005 mmol/l), валин (0-0,02 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид (0-0,003 mmol/l), фолиевую кислоту (0-0,002 mmol/l), инозитол (0-0,003 mmol/l), никотинамид (0-0,003 mmol/l), пантотенат (0-0,001 mmol/l), пиридоксаль (0-0,0005 mmol/l), рибофлавин (0-0,0005 mmol/l), тиамин (0-0,002 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в белках или макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), бычий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), заменитель белков сыворотки (0-20,0 mg/ml), поливинилпирролидон (0-10,0 mg/ml), поливинилалкоголь (0-10,0 mg/ml).

Результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является гипоосмотический шок сперматозоидов, находящихся в среде иммобилизации, обусловленный притоком воды из внеклеточного пространства через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму сперматозоида и характеризующийся выключением аппарата передвижения - то есть иммобилизацией сперматозоида без потери последним жизнеспособности в течение от 1 мин до 2 часов.

Изобретение поясняется рецептами сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных (Табл.1), которые не охватывают и тем более не ограничивают весь объем притязаний данного методического решения, а являются лишь поясняющими материалами частного случая исполнения.

Способ иммобилизации сперматозоидов реализуется следующим образом.

Сперматозоиды концентрируют центрифугированием при 400-600 g в среде для культивирования сперматозоидов (например, М2, ТН, TL-HEPES, SOF или DPBS), супернатант удаляют, а 100-200 µl осадка, содержащего сперматозоиды, ресуспендируют в 1-2 ml среды для иммобилизации. Полученную взвесь сперматозоидов вновь осаждают центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок, содержащий иммобилизованные сперматозоиды, разбавляют средой для иммобилизации до необходимой концентрации.

Иммобилизованные таким образом сперматозоиды могут быть использованы для процедуры ICSI. оценки и отбору по ультаморфологическим признакам с последующим использованием в процедурах ВРТ.

Таблица 1 Примеры рецептов сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных Состав: Рецепт №: 1 2 3 4 5 NaCl, mmol/l 56,8 68,4 64,6 63,3 68,4 KCl, mmol/l 2,86 1,89 4,30 1,90 1,34 KH₂PO₄, mmol/l 0,71 - 0,71 0,30 0,74 MgSO₄×7H₂O, mmol/l 0,71 - - 0,32 - L-натрия лактат, mmol/l 2,0 6 2,0 - - Глюкоза, mmol/l 3,0 3,0 - 3,0 - NaHCO₃, mmol/l 2,4 1,2 15,4 7,1 - Натрия пируват, mmol/l 0,2 - 0,2 0,5 - CaCl₂×2H₂O, mmol/l 1,02 1,2 1,02 0,30 0,50 HEPES, mmol/l 12,6 6 - - - Na₂HPO₄×H₂O, mmol/l - 0,21 - - - NaH₂PO₄, mmol/l - - - 0,54 4,05 MgCl₂×6H₂O, mmol/l - - 0,3 - 0,25 Бычий сывороточный альбумин, mg/ml - 3 19 5 - Поливинилпирролидон, mg/ml - - - - 1,0 Аланин, mmol/l - - - 0,05 - Аспарагиновая кислота, mmol/l - - - 0,05 - Аспарагин, mmol/l - - - 0,05 - Аргинин, mmol/l - - - 0,5 - Цистин, mmol/l - - - 0,07 - Глутамин, mmol/l - - - 0,5 - Аланил-глутамин, mmol/l - - - 1,0 - Глицин, mmol/l - - - 0,05 - Гистидин, mmol/l - - - 0,06 - Изолейцин, mmol/l - - - 0,01 - Лейцин, mmol/l - - - 0,05 - Лизин, mmol/l - - - 0,08 - Метионин, mmol/l - - - 0,02 - Фенилаланин, mmol/l - - - 0,02 - Пролин, mmol/l - - - 0,05 - Серин, mmol/l - - - 0,05 - Таурин, mmol/l - - - 0,05 - Треонин, mmol/l - - - 0,02 - Триптофан, mmol/l - - - 0,002 - Тирозин, mmol/l - - - 0,005 - Валин, mmol/l - - - 0,02 - Холина хлорид, mmol/l - - - 0,003 - Фолиевая кислота, mmol/l - - - 0,002 - Инозитол, mmol/l - - - 0,003 - Никотинамид, mmol/l - - - 0,003 - Пантотенат, mmol/l - - - 0,001 - Пиридоксаль, mmol/l - - - 0,0005 - Рибофлавин, mmol/l - - - 0,0005 - Тиамин, mmol/l - - - 0,002 -

Изобретение относится к медицине, андрологии, репродуктологии, ветеринарии. Предложены среда и способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, где сперматозоиды из нативной или размороженной спермы, полученные путем центрифугирования эякулята в градиенте плотности или отобранные в результате флотации, переносятся в среду для иммобилизации с пониженным осмотическим давлением 100-170 мОсм/кг на время от 1 мин до 2 часов при составе газовой среды от 0,1 до 8% углекислого газа и температуре среды от 0 до 39°C. Изобретение может быть использовано для диагностических и лечебных целей для размножения или оплодотворения животных. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных, отличающаяся тем, что для создания необходимой осмоляльности 100-170 мОсм/кг содержит следующие химические соединения: натрия хлорид NaCl 56,8-68,4 ммоль/л, калия хлорид KCl 1,89-4,30 ммоль/л, калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄ 0-0,71 ммоль/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный одноводный Na₂HPO₄×H₂O 0-0,21 ммоль/л, сульфат магния семиводный MgSO₄×7H₂O - 0-0,71 ммоль/л, хлорид кальция двуводный CaCl₂×2H₂O 1,02-1,2 ммоль/л, бикарбонат натрия NaHCO₃ 1,2-15,4 ммоль/л, натрия пируват 0-0,2 ммоль/л, L-натрия лактат 2-6,0 ммоль/л, магния хлорид шестиводный MgCl₂×6H₂O 0-0,3 ммоль/л, бычий сывороточный альбумин BSA 0-19 мг/мл, буфер HEPES 0-15,0 мМ/л, глюкоза 0-3 мМ/л.

2. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе бикарбоната натрия 1,2-15,4 мМ/л, фосфатного буфера - калий фосфорнокислый однозамещенный 0-0,71 мМ/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0-0,21 мМ/л.

3. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват 0-0,25 мМ/л, L-натрия лактат 2,0-6,0 мМ/л, глюкозу 0-3,0 мМ/л.

4. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, аргинин, цистин, глутамин, аланил-глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, таурин, треонин, триптофан, тирозин, валин.

5. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид, фолиевую кислоту, инозитол, никотинамид, пантотенат, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин.

6. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в белках и макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, заменитель белков сыворотки, поливинилпирролидон, поливинилалкоголь.

7. Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, отличающийся тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы, центрифугируют эякулят в градиенте плотности или сперматозоиды отбирают в результате флотации, переносят в среду для иммобилизации по п.1 на время от 1 мин до 2 часов, причем состав газовой среды при культивировании на среде для иммобилизации представляет собой 0,1-8% углекислого газа, а температура - 0-39°C.