Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих Российский патент 2017 года по МПК C12N5/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Область биотехнологии, сфера питательных сред, суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21).

Уровень техники

Из литературных данных известны прописи питательных сред для суспензионного культивирования клеток:

- среда Купера (Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами / Под ред. А.А.Сомниной. - Ленинград. - 1975. - С.38-40),

- специальная среда для культивирования клеток ВНК-21 (Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976. С.19),

- среда Мак-Коя для суспензионного культивирования RPMI-1640 (Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. - М.: Компания Спутник, 2000. С.53-55).

В состав перечисленных питательных сред входят: неорганические соли, аминокислоты, витамины, углеводы. Из указанных аналогов наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является среда RPMI-1640 (табл.1).

Состав и количество ингредиентов основных питательных сред, используемых для суспензионного культивирования перевиваемой линии клеток почки сирийского хомячка в сравнении с патентуемой питательной средой

Табл.1 Ингредиенты гр/л Состав сред для суспензионного культивирования клеток патентуемая среда среда Купера среда по Голубеву Д.Б. RPMI-1640 1 2 3 4 5 Соли Натрий хлористый - (NaCl) 8,0 5,48 6,4 6,0 Калий хлористый - (КСl) 0,4 0,5 0,4 0,4 Магний сернокислый -(MgSO₄⋅7H₂O) 0,2 - 0,2 0,1 Магний хлористый (MgCl₂⋅6H₂O) - 0,2 - - Натрий фосфорнокислый двузамещенный - (Na₂HPO₄⋅12H₂O) 0,15 - 0,12 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный - (КН₂РO₄) 0,06 - - - Кальций хлористый - (СаСl₂) 0,14 0,2 0,2 - Натрий двууглекислый - (NаHCO₃) 0,35 2,5 2,75 2,0 Нитрат железа (Fe(NO₃)₃⋅7H₂O) - - 0,0001 - Хлорид аммония (NH₄Cl) - 0,05 - - Аминокислоты 1-аргинин НСl - 0,25 - - 1-аргинин 0,042 - 0,42 0,2 1-цистин 0,032 - 0,024 - 1-цистин 2НСl - - - 0,065 1-глютамин 0,584 0,1 0,292 0,3 глицин - - - 0,01 1-гистидин - - 0,016 - 1-изолейцин - - 0,052 0,05 1-лейцин - - 0,052 0,05 1-лизин НСl - - 0,074 0,04 1-метионин - 0,1 0,015 0,015 1-фенилаланин - - 0,033 0,015 1-серин - - - 0,03 1-треонин - - 0,048 0,02 1-тирозин 0,02 - 0,036 0,02 1-триптофан 0,015 - 0,008 0,005 1-валин - - 0,047 0,02 аспарагиновая кислота - - - 0,02 глютаминовая кислота - 063 - 0,02 1-гидроксипролин - - - 0,02 1-пролин - - 0,02 1-аспарагин Н₂O - - - 0,0568 глютацин - - - 0,001 Витамины холин-хлорид - 0,001 0,002 0,003 пантотенат кальция (В₃) 0,0034 0,001 0,002 0,00025 пиридоксаль⋅НСl 0,0034 - 0,002 - пиридоксаль 5 фосфат - 0,001 - тиамин (B₁) 0,0034 0,001 0,002 0,001 мезо-инозит 0,0068 0,01 0,0036 0,035 никотинамид (B₅) 0,0034 0,001 - 0,001 рибофлавин (B₂) 0,00034 0,0001 0,0002 0,0002 фолиевая кислота (В₉) 0,0034 0,001 0,002 0,001 D-биотин - 0,001 - 0,0002 дрожжевой экстракт Дифко - 0,001 - - Витамин В - - - 0,000005 Антибиотики бензилпенициллина натриевая соль (ед.) 1⋅10⁵ - - - канамицина сульфат (ед.) 1⋅10⁵ - - - амфотерицин (ед.) 2⋅10³ - - - глюкоза 3,6 6,0 4,5 2,2 гидролизат мышечных белков ферментативный сухой ТУ 46. 12.20-80 1,25 - - - гидролизат лактальбумина ферментативный N L 0375 по кат.Sigma- Aldridh Chemie CMBH 1,25 5,0 - - сыворотка кр. рог. скота 70,0 100,0 - - феноловый красный - 0,01 0,015 0,053 дистиллированная вода остальн. остальн. остальн. остальн.

В представленной таблице к существенным отличительным признакам патентуемой питательной среды относится то, что среда дополнительно содержит гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный и только пять аминокислот вместо 20 аминокислот в прототипе.

Раскрытие изобретения

(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения

(1.1) Сущность изобретения: подобран состав компонентов питательной среды, включающий: гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный; аминокислоты - аргинин, глутамин, тирозин, триптофан и цистин, обеспечивающий накопление клеток при суспензионном культивировании перевиваемой линии ВНК-21 до 3,5⋅10⁶ кл./см³.

(1.2.) Техническим результатом заявляемого изобретения является создание экономически выгодной питательной среды для суспензионного культивирования клеток ВНК-21 в условиях массового биопроизводства при изготовлении культуральных вакцин.

Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в таблице 2.

Состав и количество ингредиентов питательной среды для суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21) (патентуемая)

Табл.2 N п/п Наименование компонентов Количество (гр/л) Фирма, N серии Соли 1 Натрий хлористый - (NaCl) 8,0 Россия 1 2 Калий хлористый - (КСl) 0,4 -“- 23 3 Магний сернокислый -
(MgSO₄⋅7H₂O) 0,2 -“- 9 4 Натрий фосфорнокислый
двузамещенный -
(Na₂HPO₄⋅12Н₂О) 0,15 -“- 43 5 Калий фосфорнокислый
однозамещенный - (КН₂РO₄) 0,06 -“- 8 6 Кальций хлористый - (СаСl₂) 0,14 7 Натрий двууглекислый -
(NaHCO₃) 0,35 -“- 7 Аминокислоты 8 1-аргинин 0,042 Sigma 102K0070 9 1-глютамин 0,584 -“- 42K0889 10 1-тирозин 0,02 -“- 78H06822 11 1-триптофан 0,015 -“- 77H13631 12 1-цистин 0,032 -“- 39H1091 Витамины 13 пантотенат кальция (В₃) 0,0034 -“- 57H11053 14 пиридоксаль⋅НСl 0,0034 -“- 22K16425 15 тиамин (B₁) 0,0034 -“- 20K09406 16 мезо-инозит 0,0068 -“- 12K0110 17 никотинамид (B₅) 0,0034 -“- 119H8057 18 рибофлавин (В₂) 0,00034 -“- 97H0433 19 фолиевая кислота (В₉) 0,0034 Индия Антибиотики 20 Бензилпенициллина натриевая
соль (ед) 1⋅10⁵ Россия 318 21 Канамицина сульфат (ед.) 1⋅10⁵ -“- 01-02 22 Амфотерицин (ед.) 2⋅10³ -“- 140601 23 глюкоза 3,6 Франция 24 гидролизат мышечных белков
ферментативный сухой
ТУ 46. 12.20-80 1,25 ФГУП ЩБК 2-02 25 гидролизат лактальбумина
ферментативный 1,25 Sigma 11K1259 26 сыворотка крупного рогатого
скота (мл) 70,0 ФГУП ЩБК 2-04 27 дистиллированная вода остальное

Осуществление изобретения

Изобретение относится к композиции, в которую входят ингредиенты в соотношениях количества граммов на 1 литр дистиллированной воды, указанных в таблице 2.

Способ получения композиции следующий: навески отдельных компонентов берут, соблюдая правила взвешивания для весов соответствующего класса. Учитывая объем приготавливаемой смеси, допускается взвешивание солей, гидролизатов, глюкозы на весах 3-го класса; навески отдельных аминокислот, витаминов и антибиотиков - на аналитических весах 2-го класса с соблюдением точности до второго знака после запятой.

Процесс приготовления питательной среды заключается в приготовлении солевой основы среды, которой является раствор Хенкса, и растворении в нем антибиотиков, солей, глюкозы, гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного по 1,25 г/л с конечной концентрацией суммы гидролизатов в питательной среде, равной 0,25%, пяти аминокислот, сыворотки, витаминов, бикарбоната натрия.

Растворение компонентов питательной среды ведут в дистиллированной воде, имеющей температуру 35-40°С, при непрерывном перемешивании. В начале растворяют антибиотики и навески солей поочередно NaCl, KCl, MgSO₄ 7H₂O, Na₂HPO₄ 12H₂O (развести в горячей воде), KH₂PO₄ до полного растворения предыдущей навески, вносят навеску глюкозы 3,6 гр/л среды. Дополнительно к механическому перемешиванию осуществляют перемешивание сжатым воздухом, т.е. барботированием в течение 10 минут. После растворения навесок убирают барботирование. В глюкозо-солевой раствор осторожно тонкой струйкой при механическом перемешивании вносят хлористый кальций (CaCl₂) в виде 40%-ного раствора и вновь барботируют. Из указанного в табл.2 количества гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного готовят 10%-ный раствор и вносят его в полученный глюкозо-солевой раствор и растворяют в течение 10 минут перемешиванием и барботированием.

Отдельно растворяют аминокислоты. Растворение навесок проводят последовательно согласно прописи питательной среды в таблице 2. L-цистин и l-тирозин растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты (d=1,19) до полного просветления раствора. Сначала растворяют l-цистин, затем l-тирозин. Если при внесении l-тирозина раствор помутнел, необходимо вновь вносить по каплям концентрированную НСl, до полного растворения навески. Вместо l-цистина можно использовать l-цистин НСl и растворять l-цистин НСl просто в кипящей воде.

Все витамины, кроме рибофлавина и фолиевой кислоты, последовательно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры. При этом каждую последующую навеску растворяют только после полного растворения предыдущей. Рибофлавин и фолиевую кислоту растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры с добавлением по каплям 20%-ного раствора NaOH до полного растворения навесок. Сначала растворяют рибофлавин, затем фолиевую кислоту, при растворении которой необходимо вновь по каплям вносить 20%-ный р-р NaOH до полного просветления раствора.

В глюкозо-солевой раствор вносят растворы аминокислот, витаминов, сыворотку, натрий двууглекислый и перемешивают. После внесения в среду всех необходимых компонентов добавляют дистиллированную воду до необходимого объема, перемешивают, стерилизуют фильтрацией в реактор для культивирования клеток.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток. Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих содержит натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль НСl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет получить качественную и экономически выгодную питательную среду. 2 табл.

Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащая натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль НСl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л:

натрий хлористый 8,0 калий хлористый 0,4 магний сернокислый 0,2 натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,15 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,06 кальций хлористый 0,14 натрий двууглекислый 0,35 L-аргинин 0,042 L-глутамин 0,584 L-тирозин 0,02 L-триптофан 0,015 L-цистин 0,032 пантотенат кальция 0,0034 пиридоксаль НСl 0,0034 тиамин 0,0034 мезо-инозит 0,0068 никотинамид 0,0034 рибофлавин 0,00034 фолиевая кислота 0,0034 глюкоза 3,6 ферментативный гидролизат мышечных белков 1,25 ферментативный гидролизат лактальбумина 1,25 сыворотка крупного рогатого скота 70,0 мл амфотерицин 2⋅10³ ед. бензилпеницилина натриевая соль 1⋅10⁵ ед. канамицина сульфат 1⋅10⁵ ед. дистиллированная вода остальное