ПРИМЕНЕНИЕ БРОМИДА 1-β-ФЕНИЛЭТИЛ)-4-АМИНО-1,2,4-ТРИАЗОЛИЯ (ГИПЕРТРИЛ) КАК АКТИВНОЙ ОСНОВЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ОРГАНОВ-МИШЕНЕЙ ПРИ ГОМОЦИСТЕИНЕМИИ И ОСТРЫХ НАРУШЕНИЯХ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/4196 A61P9/10 A61P43/00 

Изобретение относится к фармации и медицине и касается лекарственных средств, которые положительно влияют на состояние нитроксидергической системы.

На сегодняшний день патология сердечно-сосудистой системы является одной из основных причин заболеваемости и смертности среди населения во всем мире. Значительная распространенность сосудистых заболеваний головного мозга, острых нарушений мозгового кровообращения в том числе, высокая летальность и инвалидизация больных делает актуальной разработку эффективных средств для предупреждения и лечения таких состояний и для поддержания и возобновления функционирования органов-мишеней, пораженных при таких заболеваниях.

Относительно недавно к потенциальным факторам риска сердечно-сосудистых заболеваний стали относить гомоцистеинемию. Была достоверно установлена взаимосвязь между повышением концентрации гомоцистеина в плазме крови и увеличением риска сердечно-сосудистой патологии в первые 5 лет с момента диагностики заболевания. Обнаружена ассоциация гомоцистеинемии и дисфункции нитроксидергической системы органа-мишени сердца. Так, гомоцистеинемия приводит к ингибированию продукции NO, нарушению дилатации коронарных артерий, которое связано со снижением биодоступности этого трансмиттера, и депривации активности NO-синтазы под воздействием гомоцистеина (Сейсембеков Т.З., Искакова Б.К., Мукаров М.А. Кардиоваскулярная патология и гомоцистеин: обзор, информ. - Астана, 2004. - 34 с.).

На сегодняшний день в лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы, особенно на фоне гомоцистеинемии, перспективным считают использование препаратов, которые корректируют нитроксидергическую систему органа-мишени за счет нормализации синтеза NO и увеличения его биодоступности.

Известно биологически активное соединение бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия, которое обладает кардиопротективным, противоишемическим, антигипертензивным, антиоксидантным, протеинсинтетическим и энерготропным действием (патент Российской Федерации №2404974, C07D 249/08 (2006.01), A61P 9/04 (2006.01), A61P 9/10 (2006.01), A61P 9/12 (2006.01), опубл. 27.11.2010).

Однако в доступной нам литературе не описано свойство указанного вещества корректировать нарушения нитроксидергической системы органов-мишеней, например головного мозга и сердца, при острых нарушениях мозгового кровообращения и гомоцистеинемии, а также не найдено упоминаний об использовании бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия в схеме лечения указанных заболеваний и состояний для улучшения состояния органов-мишеней.

В основу изобретения поставлена задача получения средства, корректирующего нарушения функционирования нитроксидергической системы органов-мишеней при гомоцистеинемии и острых нарушениях мозгового кровообращения, которое имеет большую эффективность по сравнению с уже известными препаратами аналогичного действия и не оказывает побочного эффекта.

Поставленная задача решается тем, что как активную основу лекарственных средств для коррекции нарушений функционирования нитроксидергической системы органов-мишеней при гомоцистеинемии и острых нарушениях мозгового кровообращения используют бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (коммерческое название - Гипертрил).

Согласно данным, которые мы получили при проведении наших исследований, Гипертрил проявляет модулирующее действие в отношении нитроксидергической системы, а именно при нарушениях, которые сопровождаются избытком или недостатком NO. Гипертрил приводит его показатель к нормальным физиологичным значениям, то есть он нормализует работу системы независимо от того, имеет место дефицит или же гиперпродукция NO.

NO-модулирующий эффект позволяет значительно расширить показания к применению Гипертрила с целью защиты органов-мишеней (сердца, головного мозга) при функциональных нарушениях нитроксидергической системы этих органов и систем организма, которые являются звеньями патогенеза нарушений мозгового кровообращения и гомоцистеинемии. Введение Гипертрила в схемы лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы повышает эффективность базовой медикаментозной терапии.

Суть изобретения поясняется примерами с результатами исследований.

Пример 1

В нижеследующей таблице 1 мы предоставляем данные, которые свидетельствуют о позитивном действии Гипертрила на нитроксидергическую систему органа-мишени (мозга) при остром нарушении мозгового кровообращения (ОНМК).

Как эталон сравнения мы взяли L-аргинин, который является модулятором системы оксида азота.

Таблица 1 Влияние Гипертрила на активность общей синтазы оксида азота (NOS), экспрессию индуцибельной (iNOS) и эндотелиальной (eNOS) синтазы оксида азота и содержание нитротирозина в головном мозге крыс на 4 сутки экспериментального ОНМК Группы животных Плотность iNOS-положительных клеток Плотность eNOS-положительных клеток Нитротирозин нм/г белка Активность общей NOS, нм/г/мин Интактная, n=10 137,6±27,11 332,5±18,6 9,86±0,73 23,4±1,73 Контроль (ОНМК), n=10 366,7±21,5 128,5±17,4 37,6±0,41 70,6±3,11 L-аргинин, n=10 360,5±17,0 121,5±7,8 30,6±0,21 64,7±31,55 Гипертрил, n=10 147,8±16,2*¹ 288,0±15,8*¹ 12,6±0,61*¹ 25,4±1,07*¹   -148,1% +125% -66,5% -63,7% * - p≤0,05 по отношению к контролю ^{1 -} p≤0,05 по отношению к группе, которая получала L-аргинин

Исследование проведено на 40 белых крысах линии Вистар обоего пола, массой 160-180 граммов, которые содержались на стандартном рационе вивария. Экспериментальное ОНМК воспроизводили путем необратимой окклюзии общих сонных артерий [Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов / И.С. Чекман, Ю.И. Губский, И.Ф. Беленичев и др. - Методические рекомендации Государственного Фармакологического Центра МОЗ Украины, Киев, 2010. - 81 с.]. Экспериментальные животные были распределены на 4 группы по 10 животных в каждой: I - интактные; II - контрольные - животные с ОНМК; III - ОНМК + L-аргинин в дозе 250 мг/кг; IV-OHMK + Гипертрил в дозе 2,5 мг/кг. Гипертрил и L-аргинин вводили внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 4 дней, начиная с 1 дня после операции. На 4 сутки животных выводили из эксперимента путем декапитации. Функциональное состояние нитроксидергической системы миокарда оценивали по уровню нитротирозина и содержанию эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), активности общей синтазы оксида азота (NOS). Содержание нитротирозина определяли в миокарде методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов теста («HyCult biotechnology»). Концентрацию eNOS и iNOS в головном мозге определяли гистоиммунохимическим методом. Активность общей NOS определяли спектрофотометрически. Как видно из полученных результатов исследования, моделирование ОНМК приводит к стойким нарушениям нитроксидергической системы головного мозга и к формированию нитрозирующего стресса. Так, в головном мозге животных с ОНМК наблюдалось торможение экспрессии «полезной» eNOS на 61,3% и повышение экспрессии «вредной» iNOS на 166,5%, повышение активности общей NOS в 2 раза на фоне повышения маркера нитрозирующего стресса - нитротирозина (в 2,84 раза). Нитротирозин свидетельствует о превращении NO из «полезного» молекулярного мессенджера в цитотоксический продукт - пероксинитрит, который взаимодействует с белковыми структурами ионных каналов, рецепторов нейронов, снижает их функциональную активность и инициирует механизмы апоптоза. Введение Гипертрила животным с ОНМК приводило к достоверному повышению экспрессии eNOS на 125% в головном мозге на фоне снижения экспрессии iNOS на 148,1% и снижению активности общей NOS на 63,7% при снижении маркера нитрозирующего стресса нитротирозина на 66,5%, что подтверждает наличие NO-модулирующего действия Гипертрила, которое направлено на нормализацию продукции NO, что является экспериментальным обоснованием использования Гипертрила для медикаментозной коррекции нарушений нитроксидергической системы, в данном случае органа-мишени - головного мозга при ОНМК.

Пример 2

Для оценки NO-миметической активности Гипертрила моделировали гомоцистеинемию (ГЦ) (с выраженным дефицитом NO) путем ежедневного внутрижелудочного введения метионина белым беспородным крысам массой 180-190 граммов один раз в сутки с помощью металлического зонда в дозе 24,6 г/кг в течение 6 недель [Sanjana D., Steven R. Lentz Murine. Models of hyperhomocysteinemia and their vascular Phenotypes // Arterioscler. thromb. vasc. biol. 2008. - Vol.28. - P.1596-1605]. Препараты, которые исследовались, вводили внутрижелудочно через 30 минут после введения метионина: L-аргинин (EUROBIOPHARM GMGH, Hamburg) в дозе 250 мг/кг в сутки, Гипертрил в дозе 3,5 мг/кг в сутки. На 43 сутки от начала введения метионина крыс выводили из эксперимента и у них для исследований забирали сердце.

В цитозольной фракции гомогената сердца определялись биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции - стабильные метаболиты NO и активность общей NO-синтазы. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) определяли в цитозольной фракции гомогената сердца методом иммуноблотинга (см. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных препаратов / И.С. Чекман, Ю.И. Губский, И.Ф. Беленичев. - Метод, рекоменд. ГФЦ МЗ Украины, Киев. - 2010. - 81 с.). Определение гомоцистеина проводили иммунофлуоресцентным методом, используя набор реактивов фирмы AXISTM (Axis-Shield, Великобритания). Принцип метода заключается в восстановлении всех форм гомоцистеина, которые содержатся в плазме крови, до свободного гомоцистеина и потом в ферментативном переводе его в S-аденозил-L-гомоцистеин.

Таблица 2 Влияние Гипертрила и референс-препарата на показатели системы NO в цитозольной фракции гомогената сердца крыс с экспериментальной гомоцистеинемией (ГЦ) при введении в течение 6 недель Группа животных NOS, мкмоль НАДФ/мин/г белка Нитриты мкмоль/г ткани Концентрация eNOS у.е./г белка Гомоцистеин мкмоль/г ткани Интактные (n=10) 12,4±0,63 18,5±0,77 15,7±0,65 14,1±2,7 ГЦ (контроль) (n=10) 3,45±0,51 4,11±0,62 2,7±0,23 138,2±21,6 ГЦ + Гипертрил (3,5 мг/кг)
(n=10) 13,7±0,83*¹
(+297%) 14,7±1,51*¹
(+258%) 8,7±1,22*¹
(+223%) 54,7±7,7*¹
(-60%) ГЦ + L-аргинин (200 мг/кг) (n=10) 6,10±0,87*
(+77%) 6,72±0,77*
(+64%) 3,0±0,33
(+11%) 112,8±23,0*
(-18,4%) Примечание: * - изменения достоверны по отношению к животным контрольной группы (p<0,05); ¹ - изменения достоверны по отношению к группе животных, которые получали L-аргинин (p<0,05)

В результате проведенных исследований нами было установлено, что моделирование гомоцистеинемии путем введения метионина приводит к дефициту NO, о чем свидетельствует достоверное снижение его стабильного метаболита - нитрит-аниона на 77% на фоне угнетения активности общей NOS на 72% и снижения экспрессии eNOS на 83%, и увеличение гомоцистеина в 9,8 раз в цитозоле миокарда (табл.2) в сравнении с интактными животными. Курсовое назначение Гипертрила животным с ГЦ в дозе 3,5 мг/кг в сутки приводило к повышению продукции NO в цитозоле миокарда на 258%. Гипертрил усиливал физиологичный путь синтеза NO, повышая активность эндотелиальной NO-синтазы. Так, в группе животных с ГЦ, которые получали Гипертрил, активность общей NO-синтазы в цитозоле выросла на 297%, также отмечалось увеличение экспрессии эндотелиальной NO-синтазы на 223%. Гипертрил снижал образование гомоцистеина на 60% по сравнению с нелеченными животными. L-аргинин достоверно повышал активность NO-синтазы в миокарде на 77%, повышал образование NO, достоверно повышая уровень нитритов на 64%, и снижал образование гомоцистеина на 18%.

Таким образом, у известного средства - бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (Гипертрил) - нами обнаружено новое свойство - проявлять корригирующий эффект по отношению к нитроксидергической системе мозга и сердца при острых нарушениях мозгового кровообращения и при гомоцистеинемии. По активности препарат Гипертрил достоверно превышает препарат сравнения - L-аргинин. По токсичности препарат Гипертрил относится к IV классу (малотоксичный). Использование предлагаемого изобретения позволяет создать высокоэффективные малотоксичные лекарственные средства, которые содержат как активное действующее вещество бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (Гипертрил), для коррекции нарушений нитроксидергической системы органов-мишеней (сердца и головного мозга) при гомоцистеинемиии и острых нарушениях мозгового кровообращения.

Изобретение относится к медицине, фармации и фармакологии. Предложено применение бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (Гипертрил) как активной основы лекарственных средств для коррекции нарушений функционирования нитроксидергической системы органов-мишеней при гомоцистеинемии и острых нарушениях мозгового кровообращения. Технический результат: показано достижение заявленного назначения - нормализация работы нитроксидергической системы независимо от того, имеет место дефицит или гиперпродукция NO; при этом Гипертрил втрое эффективнее снижал образование гомоцистеина против известного препарата аналогичного действия L-аргинина и не оказывал побочного эффекта. 2 табл., 2 пр.

Применение бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (Гипертрил) как активной основы лекарственных средств для коррекции нарушений функционирования нитроксидергической системы органов-мишеней при гомоцистеинемии и острых нарушениях мозгового кровообращения.