МУТЕИНЫ КИСЛОТНОЙ ЗОНЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ДОМЕНА РЕЦЕПТОРА ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ Российский патент 2014 года по МПК C07K14/71 C07K14/50 C07K19/00 C12N15/27 C12N15/62 A61K38/18 A61P35/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к созданию мутеинов рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), и может быть использовано в медицине. Полипептид мутеина кислотной зоны внеклеточного домена (ECD) рецептора FGFR4 представляет собой химеру кислотной зоны FGFR4 ECD или вариант длинного кислотного бокса FGFR4 и имеет большее количество кислотных остатков в линкерной зоне D1-D2, чем FGFR4 ECD дикого типа. Мутеин может содержать точечную мутацию, которая ингибирует гликозилирование. Мутеин используют для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, например пролиферативных заболеваний, в том числе различных видов рака, нарушений ангиогенеза и дегенерации желтого пятна. Изобретение позволяет получить мутеин кислотной зоны FGFR4 ECD, имеющий сниженную способность связываться с тканями, путем увеличения количества кислых аминокислотных остатков внутри линкерной зоны D1-D2. 8 н. и 24 з.п. ф-лы, 22 ил., 11 табл., 18 пр.

1. Полипептид, по существу, соответствующий мутеину кислотной зоны внеклеточного домена (ECD) рецептора FGFR4, для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, где мутеин кислотной зоны FGFR4 ECD выбран из химеры кислотной зоны FGFR4 ECD и варианта длинного кислотного бокса FGFR4, и где мутеин кислотной зоны FGFR4 ECD имеет большее количество кислотных остатков в линкерной зоне D1-D2, чем FGFR4 ECD дикого типа, и где мутеин кислотной зоны FGFR4 ECD необязательно содержит по меньшей мере одну точечную мутацию, которая ингибирует гликозилирование.

2. Полипептид по п.1, где химера кислотной зоны FGFR4 ECD выбрана из химеры линкера D1-D2 домена FGFR4 ECD, химеры экзона 4 FGFR4 ECD, химеры кислотного бокса FGFR4 ECD, химеры длинного кислотного бокса FGFR4 ECD и химеры короткого кислотного бокса FGFR4 ECD.

3. Полипептид по п.2, где:
a) химера линкера D1-D2 домена FGFR4 ECD содержит D1-D2 линкер, выбранный из D1-D2 линкера FGFR1, D1-D2 линкера FGFR2 и D1-D2 линкера FGFR3, вместо D1-D2 линкера FGFR4;
b) химера экзона 4 FGFR4 ECD содержит экзон 4, выбранный из экзона 4 FGFR1, экзона 4 FGFR2 и экзона 4 FGFR3, вместо экзона 4 FGFR4;
c) химера кислотного бокса FGFR4 ECD содержит:
i) кислотный бокс, выбранный из кислотного бокса FGFR1, кислотного бокса FGFR2 и кислотного бокса FGFR3, вместо кислотного бокса FGFR4;
ii) зону кислотного бокса, выбранную из зоны кислотного бокса FGFR1, зоны кислотного бокса FGFR2 и зоны кислотного бокса FGFR3, вместо кислотного бокса FGFR4;
iii) зону кислотного бокса, выбранную из зоны кислотного бокса FGFR1, зоны кислотного бокса FGFR2 и зоны кислотного бокса FGFR3, вместо зоны кислотного бокса FGFR4;
iv) кислотный бокс, выбранный из кислотного бокса FGFR1, кислотного бокса FGFR2 и кислотного бокса FGFR3, вместо зоны кислотного бокса FGFR4;
d) химера длинного кислотного бокса FGFR4 ECD содержит длинный кислотный бокс, выбранный из длинного кислотного бокса FGFR1, длинного кислотного бокса FGFR2 и длинного кислотного бокса FGFR3, вместо длинного кислотного бокса FGFR4; и
e) химера короткого кислотного бокса FGFR4 ECD содержит короткий кислотный бокс, выбранный из короткого кислотного бокса FGFR1, короткого кислотного бокса FGFR2 и короткого кислотного бокса FGFR3, вместо короткого кислотного бокса FGFR4.

4. Полипептид по п.3, где:
a) химера линкера D1-D2 домена FGFR4 ECD содержит:
i) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO:22, 26, 28 и 32, вместо D1-D2 линкера FGFR4, выбранного из SEQ ID NO:16 и 17; или
ii) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 35 до 38;
b) химера экзона 4 FGFR4 ECD содержит:
i) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO:23, 92, 29 и 33, вместо экзона 4 FGFR4, выбранного из SEQ ID NO:18 и 19; или
ii) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 39 до 42;
c) химера кислотного бокса FGFR4 ECD содержит:
i) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO:24, 30 и 34 вместо кислотного бокса FGFR4, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO:20;
ii) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 56 до 65, вместо кислотного бокса FGFR4, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO:20; или
iii) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 56 до 65, вместо зоны кислотного бокса FGFR4, имеющей последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 46 до 55;
iv) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO:24, 30 и 34 вместо зоны кислотного бокса FGFR4, имеющей последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 46 до 55; или
v) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 43 до 45 и 157;
d) химера длинного кислотного бокса FGFR4 ECD содержит:
i) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 98 до 100, вместо длинного кислотного бокса FGFR4, выбранного из SEQ ID NO:96 и 97; или
ii) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 105 до 107; и
e) химера короткого кислотного бокса FGFR4 ECD содержит:
i) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 102 до 104, вместо короткого кислотного бокса FGFR4, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO:101; или
ii) последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 108 до 110.

5. Полипептид по п.1, где вариант длинного кислотного бокса FGFR4 ECD содержит вариант FGFR4 ECD с увеличенным количеством кислых аминокислотных остатков в длинном кислотном боксе по сравнению с длинным кислотным боксом дикого типа FGFR4.

6. Полипептид по п.5, где:
a) по меньшей мере два некислотных остатка в составе длинного кислотного бокса FGFR4 ECD независимо друг от друга замещены кислотным остатком, выбранным из Glu (Е) и Asp (D);
b) по меньшей мере три некислотных остатка в составе длинного кислотного бокса FGFR4 ECD независимо друг от друга замещены кислотным остатком, выбранным из Glu (Е) и Asp (D); или
c) по меньшей мере четыре некислотных остатка в составе длинного кислотного бокса FGFR4 ECD независимо друг от друга замещены кислотным остатком, выбранным из Glu (Е) и Asp (D).

7. Полипептид по п.5, где:
a) по меньшей мере один кислотный остаток вставлен между аминокислотами 103 и 104 из SEQ ID NO:1 и 2; или
d) два кислотных остатка вставлены между аминокислотами 103 и 104 из SEQ ID NO:1 и 2.

8. Полипептид по п.5, где количество кислотных остатков в длинном кислотном боксе FGFR4 равно по меньшей мере семи.

9. Полипептид по п.5, где:
a) остатки домена FGFR4 ECD от 104 до 114 (SEQ ID NO:145) замещены остатками FGFR1 ECD от 106 до 117 (SEQ ID NO:149);
b) остатки домена FGFR4 ECD от 104 до 114 (SEQ ID NO:145) замещены остатками FGFR1 ECD от 107 до 117 (SEQ ID NO:150);
c) остатки домена FGFR4 ECD от 104 до 110 (SEQ ID NO:146) замещены остатками FGFR1 ECD от 105 до 113 (SEQ ID NO:151);
d) остатки домена FGFR4 ECD от 113 до 116 (SEQ ID NO:147) замещены остатками FGFR1 ECD от 116 до 119 (SEQ ID NO:152);
e) остатки домена FGFR4 ECD от 109 до 113 (SEQ ID NO:148) замещены остатками FGFR1 ECD от 112 до 116 (SEQ ID NO: 153); или
f) вариант длинного кислотного бокса FGFR4 ECD содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 111 до 119.

10. Полипептид по п.1, где мутеин кислотной зоны FGFR4 содержит по меньшей мере одну точечную мутацию, которая ингибирует гликозилирование.

11. Полипептид по п.10, где по меньшей мере одна точечная мутация, которая ингибирует гликозилирование, выбрана из N91 А, N156A, N23 7А, N269A, N290A и N301A.

12. Полипептид по п.10, где мутеин кислотной зоны FGFR4 содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO:120, 121 и 168.

13. Слитая молекула FGFR4 ECD для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, содержащая полипептид по любому из пп.1-12, ковалентно связанный с партнером слияния.

14. Слитая молекула FGFR4 ECD по п.13, в которой партнер слияния выбран из Fc, альбумина и полиэтиленгликоля.

15. Слитая молекула FGFR4 ECD по п.14, в которой партнером слияния является Fc.

16. Слитая молекула FGFR4 ECD по п.15, где слитая молекула FGFR4 ECD содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: от 86 до 88, от 124 до 140, 143, 144 и 158.

17. Слитая молекула FGFR4 ECD для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, где слитая молекула FGFR4 ECD имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:86.

18. Полинуклеотид, который кодирует полипептид для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR по любому из пп.1-12 или слитую молекулу FGFR4 ECD по любому из пп.13-17.

19. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, содержащая эффективное количество полипептида или слитой молекулы FGFR4 по любому из пп.1-17 и фармацевтически приемлемый носитель.

20. Способ лечения нарушения ангиогенеза у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.19.

21. Способ по п.20, где нарушение ангиогенеза выбрано из рака и дегенерации желтого пятна.

22. Способ по п.21, где рак выбран из рака прямой кишки, печени, легких, груди и простаты.

23. Полипептид, по существу, соответствующий мутеину кислотной зоны FGFR2 ECD для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, где мутеин кислотной зоны FGFR2 ECD имеет большее количество кислотных остатков в линкерной зоне D1-D2, чем FGFR2 ECD дикого типа.

24. Полипептид по п.23, где мутеин кислотной зоны FGFR2 ECD является химерой короткого кислотного бокса FGFR2 ECD.

25. Полипептид по п.24, где химера короткого кислотного бокса FGFR2 ECD содержит по меньшей мере короткий кислотный бокс FGFR1 вместо по меньшей мере короткого кислотного бокса FGFR2.

26. Полипептид по п.24, где:
a) остатки домена FGFR2 ECD от 111 до 118 (SEQ ID NO:155) замещены остатками FGFR1 ECD от 105 до 112 (SEQ ID NO:154); или
b) химера короткого кислотного бокса FGFR2 ECD содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO:122.

27. Полипептид, по существу, соответствующий мутеину кислотной зоны FGFR3 ECD для лечения заболевания, ассоциированного с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, где мутеин кислотной зоны FGFR3 ECD имеет большее количество кислотных остатков в линкерной зоне D1-D2, чем FGFR3 ECD дикого типа.

28. Полипептид по п.27, где мутеин кислотной зоны FGFR3 ECD является химерой короткого кислотного бокса FGFR3 ECD.

29. Полипептид по п.28, где химера короткого кислотного бокса FGFR3 ECD содержит по меньшей мере короткий кислотный бокс FGFR1 вместо по меньшей мере короткого кислотного бокса FGFR3.

30. Полипептид по п.28, где:
a) остатки домена FGFR3 ECD от 110 до 117 (SEQ ID NO:156) замещены остатками FGFR1 ECD от 105 до 112 (SEQ ID NO:154); или
b) химера короткого кислотного бокса FGFR3 ECD содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO:123.

31. Полипептид по пп.1, 23 или 27, где заболевание, ассоциированное с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, представляет собой рак и/или нарушение ангиогенеза.

32. Слитая молекула FGFR4 ECD по п.13 или 17, где заболевание, ассоциированное с одним или несколькими лигандами семейства FGFR, представляет собой рак и/или нарушение ангиогенеза.