НОВЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ FGFR2B Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 G01N33/574 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В целом, настоящее изобретение относится к новым антителам против человеческого FGFR2b.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рецепторы факторов роста фибробластов (FGFR) представляют собой транс мембранные тирозинкиназы, кодируемые четырьмя структурно родственными генами (от FGFR1 до FGFR4). FGFR характеризуются множественным альтернативным сплайсингом их мРНК, приводящим к множеству изоформ (Ornitz etal., J. Biol. Chem. 271: 15292, 1996; см. также UniProtKB P21802 и изоформы с Р21802-1 по Р21802-23 применительно к последовательности человеческого FGFR2 и его изоформам; UniProtKB PI 1362 и изоформы с Р11362-1 по Р11362-21 применительно к последовательности человеческого FGFR1 и его изоформам). FGFR имеют общие структурные признаки, состоящие из внеклеточной лигандсвязывающей части, которая составлена из различных Ig-подобных доменов (α-изоформа содержит все три Ig-подобных домена D1, D2 и D3; β-изоформа содержит только два Ig-подобных домена D2 и D3, но без D1), трансмембранного домена и внутриклеточного тирозинкиназного каталитического домена. FGF связываются с рецепторами главным образом через области D2 и D3 рецепторов. У FGFR1-FGFR3 все формы содержат первую половину D3, изоформы, содержащие только первую половину D3 обозначают как формы IIIa, в то время как во второй половине D3 могут быть использованы два альтернативных экзона, что приводит к формам IIIb и IIIc. Например, в FGFR1, альтернативный сплайсинг экзона, кодирующего третий Ig-подобный домен, приводит к образованию сплайсинговых форм FGFR1IIIb или FGFR1IIIc (или просто FGFR1b и FGFR1c), имеющих разные свойства предпочтительного связывания с лигандом. Применительно к FGFR2, эти формы обозначают как FGFR2IIIb и FGFR2IIIc (или просто FGFR2b и FGFR2c), соответственно. FGFR2b образуется только в клетках эпителиального происхождения, a FGFR2c - только в мезенхимальных клетках. FGFR2b-форма FGFR2 представляет собой высокоаффинный рецептор FGF1 и является специфичным рецептором представителей семейства KGF (например, FGF10, FGF22 и, в особенности, FGF7); в то время как FGFR2c связывается как с FGF1, так и с FGF2, но не связывается с представителями семейства KGF (Miki et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246, 1992).

При связывании с FGFR, FGF опосредуют множество ответов в клетках различных типов, включая пролиферацию, миграцию и дифференцировку, особенно во время эмбрионального развития (Ornitz et al, J. Biol. Chem. 271:15292, 1996), а у взрослых вовлечены в гомеостаз и восстановление тканей. Установлено, что KGF (FGF7) и KGFR (FGFR2IIIb) вовлечены в различные типы рака, такие как рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичника и рак молочной железы. FGF7 и FGFR2b сверхэкспрессированы при раке поджелудочной железы (Ishiwata era/., Am. J. Pathol. 153: 213, 1998), и их совместная экспрессия коррелирует с неблагоприятным прогнозом (Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007). Амплификация и сверхэкспрессия FGFR2 особенно характерна для недифференцированного диффузного типа рака желудка с крайне неблагоприятным прогнозом, и ингибирование активности FGFR2 низкомолекулярными соединениями в значительной степени ингибировало пролиферацию таких раковых клеток (Kunii era/., Cancer Res. 68:2340, 2008; Nakamura et al, Gastroenterol. 131:1530, 2006). Лиганды FGFR2b FGF1, FGF 7 и FGF 10 индуцировали пролиферацию, подвижность и защиту от гибели клеток в клеточных линиях ЕОС (Steele et al, Growth Factors 24:45, 2006), указывая на то, что FGFR2b может способствовать злокачественному фенотипу при раке яичника. Экспрессия FGFR2b повышена приблизительно в 5% случаях рака молочной железы (Finch and Rubin 2006), опосредуя сигнальные каскады через MAPK и PI3K (Moffa, Tannheimer et al. 2004). Также обнаружена связь частых активирующих мутаций FGFR2 (например, S252W) с различными видами рака.

Согласно сообщениям, амплификация или активация FGFR1 происходит при многих видах рака, включая плоскоклеточный рак полости рта (Freier et al., Oral Oncol. 43(1):60-6, 2007), рак молочной железы (Turner et al, Cancer Res. 1;70(5):2085-94, 2010), плоско клеточный рак пищевода (Ishizuka et al, Biochem Biophys Res Commun. 9;296(1):152-5, 2002), рак яичника (Gorringe et al, Clin Cancer Res. 15;13(16):4731-9, 2007), рак мочевого пузыря (Simon et al, Cancer Res. 1;61(11):4514-9, 2001), рак предстательной железы (Edwards et al, Clin Cancer Res. 1;9(14):5271-81 2003) и рак легкого, преимущественно плоскоклеточного подтипа (Dutt et al, PLoS One. 6(6):е20351, 2011; Weir et al, Nature. 6;450(7171):893-8, 2007; Weiss et al, Sci Transl Med. 15;2(62):62ra93, 2010).

Существует значительная потребность в новых антителах против FGFR2b. В частности, принято считать, что ни об одних антителах не сообщалось, что они способны связываться как с FGFR2b, так и с FGFR1b.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении формы единственного числа использованы для обозначения одного или более чем одного (то есть по меньшей мере одного) грамматического объекта указанной формы. Например, «антитело» означает одно антитело или более чем одно антитело.

Согласно настоящему изобретению предложены новые моноклональные антитела против FGFR2b, их аминокислотные и нуклеотидные последовательности и их применение.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложено выделенное антитело против FGFR2b, содержащее 1, 2 или 3 последовательности участков, определяющих комплементарность (CDR), тяжелой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7, и/или 1, 2 или 3 последовательности CDR легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, 4 и 6, способное специфично связываться как с FGFR2b, так и с FGFR1b. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, не обладает поддающейся определению аффинностью связывания с FGFR2c.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 5 и/или CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 6. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H), имеющую 1, 2 или 3 последовательности CDR тяжелой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7, и/или вариабельную область легкой цепи (V_L), имеющую 1, 2 или 3 последовательности CDR легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4 и 6. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую SEQ ID NO: 1, 3 и 5, и/или вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую SEQ ID NO: 2, 4 и 6. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую SEQ ID NO: 1, 7 и 5, и/или вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую SEQ ID NO: 2, 4 и 6.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 8, 12 или 16 или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 8, 12 или 16. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10 или 14 или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 10 или 14. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 14. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, дополнительно содержит одну или более чем одну замену или модификацию аминокислотного остатка, но сохраняет специфичную аффинность связывания с FGFR2b и/или с FGFR1b. В некоторых воплощениях по меньшей мере одна из замен или модификаций присутствует в одной или более чем одной последовательности CDR, и/или в одной или более чем одной последовательности V_H и V_L, или в одной или более чем одной последовательности V_H и V_L, но вне каких-либо последовательностей CDR.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, дополнительно содержит константную область иммуноглобулина, возможно, константную область человеческого иммуноглобулина, предпочтительно константную область человеческого иммуноглобулина G (IgG), более предпочтительно константную область человеческого IgG1.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, дополнительно содержит, в своей константной области, одну или более чем одну модификацию, которые: (а) приводят к появлению или удалению сайта гликозилирования; (б) приводят к появлению свободного цистеинового остатка; (в) усиливают связывание с активирующим Fc-рецептором; и/или (г) усиливают антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, представляет собой антитело с модифицированным гликозилированием. В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, является афукозилированным. В некоторых воплощениях афукозилированное антитело, предложенное здесь, не содержит фукозу в Asn297. В некоторых конкретных воплощениях антитело с модифицированным гликозилированием демонстрирует усиленную ADCC-активность по сравнению с его аналогом с немодифицированным гликозилированием. В некоторых воплощениях усиленная ADCC-активность характеризуется усилением лизиса клеток, экспрессирующих FGFR2b, по меньшей мере на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70% или 75%.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, представляет собой химерное антитело. В некоторых других воплощениях антитело, предложенное здесь, представляет собой гуманизированное антитело.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, связано с одной или более чем одной конъюгатной группировкой. В определенных воплощениях конъюгатная группировка включает терапевтический агент, радиоактивный изотоп, выявляемую метку, группировку, модифицирующую фармакокинетику, или группировку для очистки. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка ковалентно присоединена напрямую или через линкер.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложены выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, конкурирующие за связывание с FGFR2b и/или FGFR1b с антителом, описанным выше.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело, предложенное здесь. В некоторых воплощениях выделенный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 или 17 и последовательности, гомологичной им, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 или 17. В некоторых воплощениях гомологичная последовательность кодирует такой же белок, как белок, кодируемый SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 или 17.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид, предложенный здесь.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения антитела, предложенного здесь. В некоторых воплощениях способ включает культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, при которых происходит экспрессия вектора экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает очистку антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело, предложенное здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В некоторых воплощениях заболевание или состояние представляет собой рак и, возможно, рак характеризуется экспрессией или сверхэкспрессией FGFR2b и/или FGFR1b.

В некоторых воплощениях введение проводят посредством перорального, интраназального, внутривенного, подкожного, сублингвального или внутримышечного введения. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ выявления присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце, включающий приведение образца в контакт с антителом по настоящему изобретению и определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ диагностики заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающий: (а) приведение образца, полученного от субъекта, в контакт с антителом по настоящему изобретению; (б) определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце; (в) соотнесение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b с наличием или статусом заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены способы прогнозирования заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающие: (а) приведение образца, полученного от субъекта, в контакт с антителом по настоящему изобретению; (б) определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце; (в) соотнесение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b с возможным ответом субъекта на антагонист FGFR2b и/или FGFR1b.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение антитела по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, при котором полезна модуляция экспрессии FGFR2b и/или FGFR1b у субъекта.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение антитела по настоящему изобретению в изготовлении диагностического реагента для выявления заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены наборы для выявления FGFR2b и/или FGFR1b, содержащие антитело по настоящему изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1. Аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи (А) и тяжелой цепи (В) антитела (Ab) hu21-26 (обозначенного на графических материалах как «hu21-26») с подчеркнутыми CDR.

ФИГ. 2. K_a, K_off и аффинность K_D антитела 21с, антитела hu21-21 и afhu21-26 (обозначенных на графических материалах как «21с», «hu21-21» и «afhu21-26», соответственно) по результатам анализа Biacore при связывании с человеческим FGFR2b или человеческим FGFR1b с использованием FPA144 в качестве контрольного антитела для эталонного сравнения.

ФИГ. 3. Проточная цитометрия дозозависимого связывания химерного антитела 21с с FGFR2b на клетках KATOIII.

ФИГ. 4. Перекрестное межвидовое связывание антитела 21с с человеческим FGFR2b, FGFR2b яванского макака и крысиным/мышиным FGFR2b.

ФИГ. 5. Избирательность связывания мышиного антитела 21 (обозначенного на графических материалах как «21») с различными представителями семейства человеческих FGFR.

ФИГ. 6. Ингибирование пролиферации клеток Ba/F3, стабильно трансфицированных человеческим FGFR2b, индуцированной FGF7, под действием антитела 21 с с человеческим антителом изотипа IgG1 в качестве отрицательного контроля.

ФИГ. 7. Дозозависимая понижающая регуляция фосфорилирования FGFR2b и фосфорилирования его последующей мишени ERK антителом 21 с.

ФИГ. 8. Интернализация антител согласно конфокальной визуализации внутриклеточного распределения мышиного антитела 21 после инкубации с клетками KATOIII при 37°С на протяжении 2 часов и 4 часов. Конфокальные изображения внутриклеточного распределения мышиного антитела 21 после инкубации с клетками KATOIII при 4°С на протяжении 2 часов и 4 часов использовали в качестве исходного отрицательного контроля.

ФИГ. 9. ADCC-активность афукозилированного антитела (Ab) hu21-26 (обозначенного на графических материалах как «afhu21-26») и фукозилированного антитела 21 с против клеток KATOIII.

ФИГ. 10. Противоопухолевая эффективность антитела afhu21-26 in vivo при его внутрибрюшинном (в/б) введении в дозе 10 мг/кг два раза в неделю в ксенотрансплантационной модели рака желудка SNU16 (А) и ксенотрансплантационной модели рака легкого LC038, полученного от пациента (В). FPA144 использовано для сравнения.

ФИГ. 11. Анализ отношения лекарственного средства к антителу для неконъюгированного afhu21-26 (нижняя кривая) и ADC-конъюгатов afhu21-26-MMAE (верхняя кривая) с применением HIC-HPLC.

ФИГ. 12. Противоопухолевая эффективность in vivo (A) afhu21-26-MMAE в ксенотрансплантационной модели рака легкого LC038, полученного от пациента, и (В) антитела 21с-ММАЕ, антитела 21c-MMAF в ксенотрансплантационной модели рака желудка SNU16. Препараты вводили животным внутривенно один раз в неделю.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последующее описание изобретения предназначено лишь для пояснения различных воплощений изобретения. Как таковые, конкретные обсуждаемые модификации не следует трактовать как ограничения объема изобретения. Специалисту в данной области будет ясно, что возможны различные эквиваленты, изменения и модификации без выхода за рамки объема изобретения, и следует понимать, что настоящее изобретение включает такие эквивалентные воплощения. Все источники, процитированные здесь, включая публикации, патенты и заявки на патенты, полностью включены сюда посредством ссылки.

Определения

При использовании здесь термин «антитело» включает любой иммуноглобулин, моноклональное антитело, поликлональное антитело, мультивалентное антитело, бивалентное антитело, моновалентное антитело, мультиспецифичное антитело, биспецифичное антитело, а также их антигенсвязывающие фрагменты, связывающиеся с определенным антигеном. Нативное интактное антитело содержит две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи. Тяжелые цепи млекопитающих классифицируют как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области (V_H) и первой, второй и третьей константной области (C_H1 C_H2, C_H3, соответственно); легкие цепи млекопитающих классифицируют как λ или κ, в то время как каждая легкая цепь состоит из вариабельной области (V_L) и константной области. Антитело имеет Y-образную форму, при этом основание Y состоит из второй и третьей константных областей двух тяжелых цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями. Каждая ветвь Y содержит вариабельную область и первую константную область одной тяжелой цепи, связанные с вариабельной и константной областями одной легкой цепи. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей обеспечивают связывание с антигеном. Вариабельные области обеих цепей обычно содержат три высоко вариабельные петли, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR) (CDR легкой цепи включают LCDR1, LCDR2 и LCDR3, CDR тяжелой цепи включают HCDR1, HCDR2, HCDR3). Границы CDR антител, раскрытых здесь, могут быть определены или установлены согласно Kabat, IMGT, Chothia или Al-Lazikani (Al-Lazikani, В., Chothia, С, Lesk, А. М., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, С.et al, J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, AM., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al, Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Marie-Paule Lefranc et al, Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc et al, Immunome Research, 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of В cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015)). Между тремя CDR расположены фланкирующие участки, известные как каркасные области (FR), которые более консервативны, чем CDR, и образуют каркас, поддерживающий гипервариабельные петли. Константные области тяжелой и легкой цепей не вовлечены в связывание с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции. Антитела относят к классам, исходя из аминокислотной последовательности константной области их тяжелой цепи. Пятью основными классами или изотипами антител являются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые характеризуются присутствием тяжелых цепей альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Некоторые из основных классов антител разделяют на подклассы, такие как IgG1 (тяжелая цепь гамма-1), IgG2 (тяжелая цепь гамма-2), IgG3 (тяжелая цепь гамма-3), IgG4 (тяжелая цепь гамма-4), IgA1 (тяжелая цепь альфа-1) или IgA2 (тяжелая цепь альфа-2).

При использовании здесь термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту антитела, образованному частью интактного антитела, содержащей один или более чем один CDR, или к любому другому фрагменту антитела, который может связываться с антигеном, но не содержит структуру интактного нативного антитела. Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают, без ограничения, диатело, Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fv-фрагмент, дисульфидно стабилизированный Fv-фрагмент (dsFv), (dsFv)₂, биспецифичный dsFv (dsFv-dsFv'), дисульфидно стабилизированное диатело (ds-диатело), молекулу одноцепочечного антитела (scFv), одноцепочечное Fv-Fc-антитело (scFv-Fc), димер scFv (бивалентное антитело), биспецифичное антитело, мультиспецифичное антитело, камелизированное однодоменное антитело, нанотело, однодоменное антитело и бивалентное однодоменное антитело. Антигенсвязывающий фрагмент способен связываться с тем же антигеном, с которым связывается исходное антитело.

Применительно к антителу, «Fab» относится к той части антитела, которая состоит из одной легкой цепи (как вариабельной, так и константной областей), связанной с вариабельной областью и первой константной областью одной тяжелой цепи дисульфидной связью.

«Fab'» относится к Fab-фрагменту, содержащему часть шарнирной области.

«F(ab')₂» относится к димеру Fab'. Применительно к антителу, «Fv» относится к наименьшему фрагменту антитела, содержащему полноразмерный антигенсвязывающий сайт. Fv-фрагмент состоит из вариабельной области одной легкой цепи, связанной с вариабельной областью одной тяжелой цепи.

«dsFv» относится к дисульфидно стабилизированному Fv-фрагменту, таким образом, что связь между вариабельной областью одной легкой цепи и вариабельной областью одной тяжелой цепи представляет собой дисульфидную связь. В некоторых воплощениях «(dsFv)2» или «(dsFv-dsFv')» содержит три пептидные цепи: две группировки V_H, соединенные пептидным линкером (например, длинным гибким линкером) и связанные с двумя группировками V_L, соответственно, посредством дисульфидных связей. В некоторых воплощениях dsFv-dsFv' является биспецифичным, где пары тяжелой и легкой цепей, соединенных дисульфидными связями, имеют разную антигенную специфичность.

«Одноцепочечное Fv-антитело», или «scFv», относится к конструированному антителу, состоящему из вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, соединенных друг с другом непосредственно или через пептидную линкерную последовательность (Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)).

Применительно к антителу, «Fc» относится к той части антитела, которая состоит из второй и третьей константных областей первой тяжелой цепи, связанных со второй и третьей константными областями второй тяжелой цепи посредством дисульфидных связей. Fc-часть антитела обеспечивает различные эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), но не задействована в связывании с антигеном.

«Одноцепочечное Fv-Fc-антитело», или «scFv-Fc», относится к конструированному антителу, состоящему из scFv, соединенного с Fc-областью антитела.

«Камелизированное однодоменное антитело», «тяжелоцепочечное антитело» или «HCAb» относится к антителу, содержащему два домена V_H без легких цепей (Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001); WO 94/04678; WO 94/25591; патент США №6,005,079). Тяжелоцепочечные антитела исходно имеют происхождение от представителей семейства Camelidae (верблюдов, одногорбых верблюдов и лам). Несмотря на то, что они лишены легких цепей, камелизированные антитела имеют аутентичный репертуар связывания с антигенами (Hamers-Casterman С.et al, Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," knmunogenetics. Apr;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al. Immunology. May;109(1):93-101 (2003)). Вариабельный домен тяжелоцепочечного антитела («домен VHH») является наименьшей известной антигенсвязывающей единицей, образуемой при адаптивных иммунных ответах (Koch-Nolte F. et al, FASEB J. Nov;21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)).

«Нанотело» относится к фрагменту антитела, состоящему из одного домена VH тяжелой цепи обычного IgG и двух константных доменов тяжелой цепи, например, СН2 и СНЗ.

«Диатела», или «dAb», включают малые фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащие домен V_H, соединенный с доменом V_L в одной полипептидной цепи (V_H-V_L или V_L-V_H) (см., например, Holliger P. et al, Proc Natl Acad Sci USA. Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP 404097; WO 93/11161). Использование линкера, слишком короткого для образования пар из доменов, расположенных на одной цепи, приводит к образованию пар из комплементарных доменов разных цепей с получением двух антигенсвязывающих сайтов. Антигенсвязывающие сайты могут быть направлены на одинаковые или разные антигены (или эпитопы). В определенных воплощениях "биспецифичное ds диатело" представляет собой диатело, мишенями которого являются два разных антигена (эпитопа).

В определенных воплощениях «димер scFv» представляет собой бивалентное диатело или бивалентный scFv (BsFv), содержащий V_H-V_L (соединенные пептидным линкером), димеризованные с другой группировкой V_H-V_L, таким образом, что V_H одной группировки связаны с V_L другой группировки, образуя два связывающих сайта, которые могут быть направлены на одинаковые антигены (или эпитопы) или разные антигены (или эпитопы). В других воплощениях «димер scFv» представляет собой биспецифичное диатело, содержащее V_H1-V_L2 (соединенные пептидным линкером), связанные с V_L1-V_H2 (также соединенными пептидным линкером), таким образом, что связаны V_H1 с V_L1 и V_H2 с V_L2 и эти связанные пары имеют разную антигенную специфичность.

«Однодоменное антитело» относится к фрагменту антитела, содержащему только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В определенных случаях два или более домена V_H ковалентно соединены пептидным линкером с получением бивалентного или мультивалентного однодоменного антитела. Два домена V_H бивалентного однодоменного антитела могут быть направлены на один и тот же антиген или на разные антигены.

При использовании здесь термин «химерное/химерный» обозначает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где одна часть тяжелой и/или легкой цепи имеет происхождение от одного вида, а остальные части тяжелой и/или легкой цепи имеют происхождение от другого вида. В одном наглядном примере химерное антитело может содержать константную область, имеющую происхождение от человека, и вариабельную область от животного, не являющегося человеком, такого как мышь. В некоторых воплощениях животное, не являющееся человеком, представляет собой млекопитающее, например, мышь, крысу, кролика, козу, овцу, морскую свинку или хомяка.

При использовании здесь термин «гуманизированное/гуманизированный» означает, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR, имеющие происхождение от животных, не являющихся людьми, FR-области, имеющие происхождение от человека, и, где это применимо, константные области, имеющие происхождение от человека.

При использовании здесь термин «бивалентное/бивалентный» относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющему два антигенсвязывающих сайта; термин «моновалентное/моновалентный» относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющему только один антигенсвязывающий сайт; и термин «мультивалентное/мультивалентный» относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющему множество антигенсвязывающих сайтов.

При использовании здесь «биспецифичное» антитело относится к искусственному антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющим фрагменты, имеющие происхождение от двух разных моноклональных антител, и способным связываться с двумя разными эпитопами. Два эпитопа могут быть расположены на одном и том же антигене, или они могут быть расположены на двух разных антигенах.

Если не указано иное, то при использовании здесь термин «FGFR» включает любых или всех представителей семейства рецепторов факторов роста фибробластов (FGFR1-FGFR4), и подразумевают, что он включает любую форму FGFR, например: (1) нативные непроцессированные молекулы FGFR, «полноразмерные» цепи FGFR или встречающиеся в природе варианты FGFR, включая, например, аллельные варианты; (2) любую форму FGFR, являющуюся результатом его внутриклеточного процессинга, например, различные сплайсинговые формы, например, FGFR1b, FGFR1c, FGFR2a, FGFR2b, FGFR2c и тому подобное; или (3) фрагмент (например, усеченную форму, внеклеточный/трансмембранный домен) или модифицированную форму (например, мутантную форму, гликозилированную/пегилированную форму, форму, слитую с His-меткой / флуоресцентной меткой) субъединицы FGFR, полученные рекомбинантными методами. При использовании здесь «FGFR» может иметь происхождение от любого позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди, обезьяны) и грызуны (например, мыши и крысы).

Термины «FGFR2IIIb» и «FGFR2b» использованы взаимозаменяемо для обозначения подтипа ШЬ сплайсинговой формы FGFR2. Типичные последовательности FGFR2b включают белок FGFR2b Homo sapiens (человек) (например, последовательность предшественника с сигнальным пептидом, регистрационный номер в Genbank NP 075259.4), белок FGFR2b Rattus norvegicus (крыса) (например, полноразмерная последовательность, регистрационный номер в Genbank NP 001103363.1), белок FGFR2b Mus musculus (мышь) (например, полноразмерная последовательность, регистрационный номер в Genbank NP 963895.2).

«FGFR2IIIc» или «FGFR2c» использованы взаимозаменяемо для обозначения подтипа Шс сплайсинговой формы FGFR2. Типичные последовательности FGFR2c включают человеческий белок FGFR2c (например, последовательность предшественника, регистрационный номер в Genbank NP 000132.3), белок FGFR2c Rattus norvegicus (крыса) (полноразмерная последовательность, регистрационный номер в Genbank NP 001103362.1), белок FGFR2c Mus musculus (мышь) (полноразмерная последовательность, регистрационный номер в Genbank NP_034337.2).

Термины «FGFRlIIIb» и «FGFR1b» использованы взаимозаменяемо для обозначения подтипа ШЬ сплайсинговой формы FGFR1. Типичные последовательности FGFR1b включают белок FGFR1b Homo sapiens (человек) (например, последовательность предшественника с сигнальным пептидом, регистрационный номер в UniProtKB PI 1362-19); белок FGFR1b Mus musculus (мышь) (например, последовательность предшественника с сигнальным пептидом, регистрационный номер в UniProtKB Р16092-5).

Термин «антитело против FGFR2b» относится к антителу, способному специфично связываться с FGFR2b. В некоторых воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, способны специфично связываться как с FGFR2b, так и с FGFR1b, но не связываются с FGFR2c и FGFRlc или хуже связываются с FGFR2c и FGFR1c (например, аффинность связывания с FGFR2c или FGFR1c по меньшей мере в 10 раз ниже аффинности связывания с FGFR2b или FGFR1b, или по меньшей мере в 50 раз ниже, или по меньшей мере в 100 раз ниже, или по меньшей мере в 200 раз ниже). В некоторых воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, не обладают поддающейся определению аффинностью связывания с FGFR2c.

При использовании здесь термин «специфичное связывание» или «специфично связывается» относится к неслучайному связывающему взаимодействию двух молекул, такому как, например, взаимодействие между антителом и антигеном. Аффинность связывания антитела и антигенсвязывающего фрагмента, предложенных здесь, может быть представлена значением K_D, представляющим собой отношение скорости диссоциации к скорости ассоциации (k_off/k_on), когда связывание антигена с антигенсвязывающей молекулой (например, антителом и антигенсвязывающим фрагментом) достигает равновесия. Аффинность связывания с антигеном (например, K_D) может быть надлежащим образом определена с применением подходящих методов, известных в данной области, включая, например, методики Biacore (основанные на технологии поверхностного плазмонного резонанса, см., например, Murphy, М. et al., Current protocols in protein science, Chapter 19, unit 19.14, 2006), методики Kinexa (см., например, Darling, R. J., et al, Assay Drug Dev. Technol., 2(6): 647-657 (2004)) и проточную цитометрию.

При использовании здесь способность «конкурировать за связывание» относится к способности антитела или антигенсвязывающего фрагмента ингибировать связывающее взаимодействие двух молекул (например, человеческого FGFR2b и антитела против FGFR2b) в любой поддающейся определению степени (например, по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%). Специалистам в данной области будут ясны возможности определения, без ненужных экспериментов, того, конкурирует ли заданное антитело за связывание с FGFR2b и/или FGFR1b с антителом по настоящему изобретению (например, антителом 21, антителом 21с, антителом hu21-21 или антителом hu21-26, определенными ниже).

При использовании здесь термин «эпитоп» относится к определенной группе атомов или аминокислот на антигене, с которыми связывается антитело.

Применительно к аминокислотной последовательности, «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь со сходными физико-химическими свойствами. Например, возможны консервативные замены аминокислотных остатков с гидрофобными боковыми цепями (например, Met, Ala, Val, Leu и Ile), остатков с нейтральными гидрофильными боковыми цепями (например, Cys, Ser, Thr, Asn и Gin), остатков с кислыми боковыми цепями (например, Asp, Glu), аминокислот с основными боковыми цепями (например, His, Lys и Arg) или остатков с ароматическими боковыми цепями (например, Trp, Tyr и Phe). Как известно в данной области, консервативная замена обычно не приводит к существенному изменению конформационной структуры белка и, таким образом, позволяет сохранять биологическую активность белка.

При использовании здесь термины «гомолог» и «гомологичный» взаимозаменяемы и относятся к последовательностям нуклеиновых кислот (или их комплементарным цепям) или аминокислотным последовательностям, по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичным другим последовательностям при их оптимальном выравнивании.

Применительно к аминокислотной последовательности (или последовательности нуклеиновой кислоты), «процент (%) идентичности последовательностей» определяют как процент аминокислотных (или нуклеиновокислотных) остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным (или

нуклеиновокислотным) остаткам в эталонной последовательности после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения разрывов для достижения максимального числа идентичных аминокислот (или нуклеиновых кислот). Консервативно замененные аминокислотные остатки можно рассматривать как идентичные или неидентичные остатки. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей (или последовательностей нуклеиновых кислот) может быть проведено, например, с использованием общедоступных инструментов, таких как BLASTN, BLASTp (доступно на интернет-сайте Национального центра биотехнологической информации США (NCBI), см. также Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (доступно на интернет-сайте Европейского института биоинформатики, см. также Higgins D.G et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)) и программное обеспечение ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут использовать параметры по умолчанию, предоставляемые инструментом, или могут изменять параметры в соответствии с проводимым выравниванием, например, выбирая подходящий алгоритм.

«Выделенное» вещество было изменено человеком относительно его естественного состояния. Если «выделенные» композиция или вещество встречаются в природе, они были изменены и/или удалены из их исходного окружения. Например, полинуклеотид или полипептид, естественным образом присутствующий в живом животном, не является «выделенным», но тот же самый полинуклеотид или полипептид является «выделенным», если он в достаточной степени отделен от веществ, сосуществующих с ним в его естественном состоянии, таким образом, что он представлен в по существу чистом состоянии. «Выделенная полинуклеотидная последовательность» относится к последовательности выделенной полинуклеотидной молекулы. В определенных воплощениях «выделенное антитело» относится к антителу, степень чистоты которого составляет по меньшей мере 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, как определено электрофоретическими методами (такими как SDS-PAGE, изоэлектрическое фокусирование, капиллярный электрофорез) или хроматографическими методами (такими как ионообменная хроматография или HPLC с обращенной фазой).

При использовании здесь «эффекторные функции» относятся к биологической активности, обусловленной связыванием Fc-области антитела с ее эффекторами, такими как комплекс С1 и Fc-рецептор. Типичные эффекторные функции включают: комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), индуцируемую взаимодействием антител с C1q на комплексе С1; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), индуцированную связыванием Fc-области антитела с Fc-рецептором на эффекторной клетке; и фагоцитоз.

«Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и «ADCC» относятся к клеточно-опосредованной реакции, при которой эффекторные клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR), распознают связанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент на клетке-мишени и впоследствии приводят к лизису клетки-мишени. «ADCC-активность» относится к способности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, связанных на клетке-мишени, запускать ADCC-реакцию, как описано выше.

«Клетки-мишени» представляют собой клетки, с которыми специфично связываются антитела, содержащие Fc-область, обычно через ту часть белка, которая расположена ближе к С-концу относительно Fc-области. «Эффекторные клетки» представляют собой лейкоциты, экспрессирующие один или более чем один Fc-рецептор и выполняющие эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcyRIII и выполняют ADCC-эффекторную функцию. Примеры человеческих лейкоцитов, опосредующих ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), натуральные клетки-киллеры (NK-клетки), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом МКПК и NK-клетки предпочтительны. Эффекторные клетки могут быть выделены из их нативного источника, например, из крови или МКПК, как известно в данной области.

При использовании здесь «вектор» относится к полинуклеотидной молекуле, позволяющей реплицировать/клонировать желаемый фрагмент нуклеиновой кислоты, входящий в состав указанной молекулы, или позволяющей экспрессировать белок, кодируемый таким желаемым фрагментом нуклеиновой кислоты, при ее введении в подходящую клетку-хозяина. Примеры векторов включают как клонирующие векторы, так и векторы экспрессии. При использовании здесь термин «вектор экспрессии» относится к вектору, в который может быть функционально введен полинуклеотид, кодирующий белок, таким образом, чтобы обеспечить экспрессию этого белка. Вектор экспрессии может содержать различные элементы контроля экспрессии, включая промоторные последовательности, последовательности инициации транскрипции, энхансерные последовательности, селектируемые элементы и репортерные гены. Кроме того, вектор может содержать репликатор.

При использовании здесь термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую введен экзогенный полинуклеотид и/или вектор экспрессии.

При использовании здесь «лечение» состояния включает предупреждение или облегчение состояния, замедление начала или уменьшение скорости развития состояния, снижение риска развития состояния, предупреждение или задержку развития симптомов, связанных с состоянием, уменьшение или устранение симптомов, связанных с состоянием, обеспечение полного или частичного обратного развития состояния, излечение состояния или некоторую их комбинацию.

При использовании здесь заболевание или состояние, «связанное с FGFR2b и/или FGFR1b», относится к любому заболеванию или состоянию, чувствительному к лечению модулятором FGFR2b и/или модулятором FGFR1b, или сопровождающемуся экспрессией или сверхэкспрессией FGFR2b и/или FGFR1b. В некоторых воплощениях заболевание или состояние, связанное с FGFR2b и/или FGFR1b, представляет собой рак и, возможно, рак с положительной экспрессией или повышенной экспрессией FGFR2b и/или FGFR1b.

При использовании здесь «рак» относится к любому медицинскому состоянию, характеризующемуся злокачественным клеточным ростом или неоплазией, аномальной пролиферацией, инфильтрацией или метастазированием, и включает как солидные опухоли, так и гемобластозы. При использовании здесь «солидная опухоль» относится к солидной массе неопластических и/или злокачественных клеток. «Гемобластоз» относится к гематологическим злокачественным опухолям, таким как лейкоз, лимфома, миелома и другие гематологические злокачественные опухоли. Примеры рака или опухоли включают гематологические злокачественные опухоли (например, лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому и В-клеточную лимфому), рак полости рта (например, губы, языка или глотки), опухоли пищеварительных органов (например, пищевода, желудка, тонкой кишки, ободочной кишки, толстой кишки или прямой кишки), брюшины, печени и желчевыводящих путей, поджелудочной железы, дыхательной системы, например, гортани или легкого (мелкоклеточные и немелкоклеточные), кости, соединительной ткани, кожи (например, меланома), молочной железы, репродуктивных органов (фаллопиевой трубы, матки, шейки матки, яичек, яичника или предстательной железы), мочевыделительной системы (например, мочевого пузыря или почек), головного мозга и желез внутренней секреции, таких как щитовидная железа. В определенных воплощениях рак выбран из рака яичника, эндометриального рака, рака молочной железы, рака легкого (мелкоклеточного или немелкоклеточного), рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака предстательной железы, рака шейки матки, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака пищевода, печеночноклеточного рака (рака печени), почечноклеточного рака (рака почки), рака головы и шеи, мезотелиомы, меланомы, сарком и опухолей головного мозга (например, глиом, таких как глиобластомы).

Термин «фармацевтически приемлемый» указывает на то, что указанные носитель, растворитель, разбавитель, эксципиент (эксципиенты) и/или соль в целом химически и/или физически совместимы с другими ингредиентами, входящими в состав композиции, и физиологически совместимы с ее реципиентом.

Антитела против FGFR2b

Согласно настоящему изобретению, предложены антитела против FGFR2b, содержащие одну или более чем одну (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) последовательность CDR антитела 21. Последовательности CDR антитела 21 показаны в Таблице 1. При использовании здесь термин «антитело 21» относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 12 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 14. Антитело 21 специфично связывается как с FGFR2b, так и с FGFR1b.

Известно, что CDR обеспечивают связывание с антигеном, тем не менее, было обнаружено, что не все из 6 CDR обязательны и неизменны. Иными словами, можно заменить, или изменить, или модифицировать один или более чем один CDR антитела 21, но по существу сохранить специфичную аффинность связывания с FGFR, в частности с FGFR2b и FGFR1b.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, могут содержать одну или более чем одну модификацию или замену в одном или более чем одном CDR-участке, представленном в Таблице 1. Такие варианты сохраняют специфичную аффинность связывания их исходного антитела с FGFR2b и/или FGFR1b, но могут иметь одно или более чем одно улучшение свойств, такое как повышенная аффинность связывания с антигеном или сниженная вероятность гликозилирования.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, могут быть модифицированы для удаления одной или более чем одной горячей точки Asn или Asp в пределах CDR-участков (или в пределах вариабельных областей). Такие горячие точки Asn и Asp могут приводить к деградации антител и, вследствие этого, снижать стабильность антител. Примеры предполагаемых мотивов горячих точек в пределах CDR-участков включают Asn-Gly, Asn-Thr, Asn-Ser, Asn-Asn, Asp-Gly, Asp-Thr, Asp-Ser, Asp-Asp и Asp-His. В определенных воплощениях HCDR2 антитела 21 модифицирован для удаления горячей точки Asn-Gly (NG). В определенных воплощениях модифицированный HCDR2 содержит SEQ ID NO: 7 (AIYPENRDINYNQKFKG).

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, содержат последовательность CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 5 и, возможно, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO:6. CDRS-участок тяжелой цепи расположен в центре антигенсвязывающего сайта, и поэтому полагают, что он в наибольшей степени контактирует с антигеном и обеспечивает большую часть свободной энергии применительно к аффинности антитела в отношении антигена. Также полагают, что CDR3 тяжелой цепи значительно разнообразнее других CDR антигенсвязывающего сайта по длине, аминокислотному составу и конформации благодаря множеству механизмов диверсификации (Tonegawa S. Nature. 302:575-81. (1983)). Разнообразия CDR3 тяжелой цепи достаточно для обеспечения специфичности большинства антител (Xu JL, Davis MM. Immunity. 13:37-45 (2000)), а также желаемой аффинности связывания с антигеном (Schier R, etc. J Mol Biol. 263:551-67 (1996)).

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, дополнительно содержат подходящие последовательности каркасных областей (FR), при условии, что антитела могут специфично связываться с FGFR2b и/или FGFR1b. Последовательности CDR, представленные в Таблице 1, получены из мышиного антитела, но они могут быть перенесены на любые подходящие последовательности FR любого подходящего вида, такого как, среди прочих, мышь, человек, крыса, кролик, с применением подходящих методов, известных в данной области, таких как рекомбинантные методики.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, являются гуманизированными. Типичные гуманизированные антитела, предложенные здесь, включают антитело Hu21-21 и антитело hu21-26.

При использовании здесь «антитело hu21-21» относится к гуманизированному антителу на основе антитела 21, имеющему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 16 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 10.

При использовании здесь «антитело hu21-26» относится к гуманизированному антителу на основе антитела 21, имеющему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 10. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела hu21-26 (SEQ ID NO: 8) идентична последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела hu21-21 (SEQ ID NO: 16), за исключением мутации G56R, приводящей к удалению горячей точки NG в HCDR2.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, дополнительно содержат константную область иммуноглобулина, возможно, человеческого иммуноглобулина, возможно, человеческого IgG. В некоторых воплощениях константная область иммуноглобулина включает константную область тяжелой цепи и/или легкой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит область СН1, шарнирную область и/или области СН2-СНЗ. В определенных воплощениях константная область тяжелой цепи содержит Fc-область. В определенных воплощениях константная область легкой цепи содержит Сκ или Сλ.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, представляют собой химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. При использовании здесь «антитело 21с» относится к химерному антителу на основе антитела 21, содержащему мышиную вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 12 и мышиную вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 14, слитые с человеческой константной областью тяжелой цепи и человеческой константной областью легкой цепи, соответственно.

Последовательности вариабельных областей типичных антител показаны в Таблице 2 и Таблице 3.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, могут содержать одну или более чем одну модификацию или замену в одной или более чем одной последовательности вариабельной области, представленной здесь, но сохраняют специфичную аффинность связывания с FGFR2b и/или с FGFR1b. В определенных воплощениях по меньшей мере одна (или все) из замен в последовательностях CDR, последовательностях FR или последовательностях вариабельных областей включает консервативную(ые) замену (замены).

Для решения этой задачи могут быть применены различные методы, известные в данной области. Например, с применением технологии фагового дисплея может быть получена и экспрессирована библиотека вариантов антител (таких как Fab- или scFv-варианты) с последующим скринингом на предмет аффинности связывания с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b. В качестве другого примера, может быть применено компьютерное программное обеспечение для виртуальной симуляции связывания антител с FGFR2b и/или FGFR1b и определения аминокислотных остатков антител, образующих поверхность, задействованную в связывании. Такие остатки можно либо обходить при заменах во избежание снижения аффинности связывания, либо целенаправленно заменять для усиления связывания.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, содержат замену одного или более чем одного аминокислотного остатка в одной или более чем одной последовательности CDR и/или одной или более чем одной последовательности FR в пределах SEQ ID NO: 1-7. В определенных воплощениях в последовательностях CDR и/или последовательностях FR проведено в общей сложности не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замены (замен).

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b содержат 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR, по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичных последовательностям (последовательности), приведенным в SEQ ID NO: 1-7, и в то же время сохраняют аффинность связывания с FGFR2b и/или FGFR1b на уровне, сходном или даже превышающем аффинность их исходного антитела.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b содержат одну или более чем одну последовательность вариабельной области, по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную последовательности (последовательностям), приведенной в Таблице 1, и в то же время сохраняют аффинность связывания с FGFR2b и/или FGFR1b на уровне, сходном или даже превышающем аффинность их исходного антитела. В некоторых воплощениях в последовательности вариабельной области, приведенной в Таблице 2, проведена замена, вставка или делеция в общей сложности 1-10 аминокислот.В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции проведены в областях вне CDR (например, в FR).

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, содержат константную область, способную индуцировать эффекторную функцию, такую как ADCC или CDC. Эффекторные функции, такие как ADCC и CDC, могут приводить к цитотоксичности в отношении клеток, экспрессирующих FGFR, и могут быть оценены с применением различных анализов, таких как анализ связывания с Fc-рецепторами, анализ связывания с C1q и анализ лизиса клеток. В определенных воплощениях константная область представляет собой константную область изотипа IgG1, которая, как известно, индуцирует ADCC.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b содержат одну или более чем одну модификацию в константной области, усиливающую ADCC. При использовании здесь термин «усиленная ADCC» определяют как увеличение числа клеток-мишеней, лизируемых за заданное время при заданной концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, посредством механизма ADCC, определенного выше, и/или снижение концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, необходимой для достижения лизиса заданного числа клеток-мишеней за заданное время посредством механизма ADCC.

Для оценки ADCC-активности интересующей молекулы может быть проведен анализ ADCC in vitro, такой как описанный в: патенте США №5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) и Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); патенте США№5,821,337; или Bruggemann et al, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Альтернативно, могут быть применены методы нерадиоактивных анализов (см., например, нерадиоактивный

проточноцитометрический анализ цитотоксичности ACTI™ (Cell Technology Inc., Маунтин-Вью, штат Калифорния, США) и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Мэдисон, штат Висконсин)). Кроме того, ADCC-активность интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например, в модели на животных, такой как раскрытая в Clynes et al, PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

В предшествующем уровне техники описаны различные методы усиления ADCC. Например, было продемонстрировано, что в связывание с FcyR вовлечена подгруппа аминокислотных остатков Fc-области, такая как следующие аминокислотные остатки (EU-нумерация остатков): (1) Lys274-Arg301 и Tyr407-Arg416 (Sarmay et al (1984) Mol. Immunol., 21:43-51, и Gergely et al (1984) Biochem. Soc. Tans.,12: 739-743); (2) Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 и Ala327-Ile332 (Sondermann et al. (2000) Nature, 406:267-273; и (3) T256, K290, S298, Е333, K334, A339 (Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604, и заявка на патент США №2004/0228856) в Fc-области вовлечены в связывание с человеческим FcyRTIIA. Возможны мутации указанных выше аминокислотных остатков для усиления ADCC-активности, например, в Shields et al. (2001), J Biol Chem 9(2), 6591-6604, было доказано, что у Fc-вариантов Т256А, K290A, S298A, Е333А, K334A и А339Т ADCC-активность была усилена по сравнению с нативными последовательностями.

Альтернативно, усиленная ADCC-активность может быть получена конструированием гликозилированных форм антитела. Согласно сообщениям, ряд гликозилированных форм усиливают ADCC-активность антитела посредством усиления его связывания с Fc-рецептором эффекторных клеток. Различные гликозилированные формы включают любые из нескольких форм гликанов, присоединенных к антителу, с разными сахаридами (например, без сахаридов одного типа, таких как фукоза, или с высоким уровнем сахаридов одного типа, таких как манноза), или имеющих разную структуру (например, различные разветвленные структуры, такие как биантенные (две ветви), триантенные (три ветви) или тетраантенные (четыре ветви) структуры).

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, представляют собой антитела с модифицированным гликозилированием. У антитела или антигенсвязывающего фрагмента «с модифицированным гликозилированием» может быть повышен или снижен уровень гликозилирования, изменена форма гликозилирования и/или оба из указанного по сравнению с его аналогом с немодифицированным гликозилированием. В определенных воплощениях антитела с модифицированным гликозилированием демонстрируют усиленную ADCC-активность по сравнению с их аналогами с немодифицированным гликозилированием. В некоторых воплощениях усиленная ADCC-активность характеризуется усилением лизиса клеток, экспрессирующих FGFR2b, по меньшей мере на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70% или 75%.

Гликозилирование антител может быть модифицировано методами, известными в данной области, включая любую манипуляцию с пептидным каркасом (например, модификации аминокислотной последовательности и/или групп боковых цепей отдельных аминокислот) и/или манипуляцию посттрансляционными модификациями через линию клеток-хозяев (например, модификации паттерна гликозилирования). Методы изменения ADCC-активности посредством модификации гликозилирования антитела также описаны в данной области, см., например: Weikert et al. (1999) Nature Biotech., 17:116- 121; Shields R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem., 277: 26733-26740; Shinkawa et al. (2003), J Biol Chem., 278, 3466-3473; Ferrara et al. (2006), Biotech. Bioeng., 93, 851-861; Yamane-Ohnuki et a/.(2004), Biotech Bioeng., 87, 614-622; Niwa et al.(2006), J Immunol Methods 306, 151-160; Shinkawa T. et al, J. Biol. Chem, (2003), 278: 3466-3473.

В некоторых воплощениях антитела с модифицированным гликозилированием, предложенные здесь, являются афукозилированными (то есть не содержат фукозу). В нескольких исследованиях было показано, что афукозилированное (то есть фукозодефицитное или нефукозилированное) антитело демонстрировало повышенное связывание с FcyRIII и, таким образом, приводило к повышенной ADCC-активности (Shields et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem., 278:3466-3473; и заявка на европейский патент №1176195). В некоторых воплощениях афукозилированное антитело, предложенное здесь, не содержит фукозу при аспарагине 297 (Asn297) тяжелой цепи (исходя из нумерации Kabat). Asn297 является консервативным сайтом N-гликозилирования, обнаруженным в каждом домене СН2 Fc-области антител изотипа IgGl (Arnold et al, Glycobiology and Medicine, 564:27-43, 2005).

В некоторых воплощениях антитела с модифицированным гликозилированием, предложенные здесь, характеризуются гликозилированной формой с высоким содержанием маннозы (например, манноза е5, манноза 7,8,9 гликан). Было доказано, что гликозилированная форма с высоким содержанием маннозы усиливает ADCC-активность (Yu et al. (2012), Landes Bioscience, mAbs 4:4, 475-487).

В некоторых воплощениях антитело, предложенное здесь, дополнительно содержит, в своей константной области, одну или более чем одну модификацию, которые: (а) приводят к появлению или удалению сайта гликозилирования; (б) приводят к появлению свободного цистеинового остатка; (в) усиливают связывание с активирующим Fc-рецептором; и/или (г) усиливают ADCC.

Антитело против FGFR2b или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать один или более чем один аминокислотный остаток с боковой цепью, к которой может быть присоединена углеводная группировка (например, олигосахаридная структура). Гликозилирование антител обычно представляет собой N-гликозилирование или О-гликозилирование. N-гликозилирование относится к присоединению углеводной группировки к боковой цепи аспарагинового остатка, например, аспарагинового остатка в трипептидной последовательности, такой как аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. О-гликозилирование относится к присоединению одного из Сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину. Удаление нативного сайта гликозилирования может быть удобным образом проведено, например, посредством изменения аминокислотной последовательности с заменой одной из описанных выше трипептидных последовательностей (в случае сайтов N-гликозилирования) или сериновых или треониновых остатков (в случае сайтов О-гликозилирования), присутствующих в последовательности антитела. Новый сайт гликозилирования может быть создан сходным образом посредством введения такой трипептидной последовательности или серинового или треонинового остатка.

Антитела против FGFR2b, предложенные здесь, также включают цистеиноконструированный вариант, содержащий один или более чем один введенный свободный цистеиновый аминокислотный остаток. Свободный цистеиновый остаток представляет собой цистеиновый остаток, не являющийся частью дисульфидной связи. Цистеиноконструированный вариант полезен для конъюгации, например, среди прочего, с цитотоксическим соединением и/или соединением для визуализации, меткой или радиоизотопом, в сайте цистеинового конструирования, например, через малеимид или галогенацетил. Методы конструирования антител для введения свободных цистеиновых остатков известны в данной области; см., например, WO 2006/034488.

Антитела против FGFR2b, предложенные здесь, также включают Fc-вариант, содержащий модификацию или замену одного или более чем одного аминокислотного остатка в его Fc-области и/или шарнирной области. В определенных воплощениях антитела против FGFR2b содержат одну или более чем одну аминокислотную замену (замены), улучшающую рН-зависимое связывание с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Такой вариант может иметь увеличенный фармакокинетический период полувыведения, поскольку он связывается с FcRn при кислом рН, что позволяет ему избежать расщепления в транспортной лизосоме с его последующей транслокацией и высвобождением из клетки. Методы конструирования антител и их антигенсвязывающих фрагментов для повышения аффинности связывания с FcRn хорошо известны в данной области; см., например, Vaughn, D. et al., Structure, 6(1): 63-73 (1998); Kontermann, R. et al, Antibody Engineering, Volume 1, Chapter 27: Engineering of the Fc region for improved PK, published by Springer, 2010; Yeung, Y. et al, Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010); и Hinton, P. et al, J. Immunology, 176:346-356 (2006).

Характеристики связывания

Антитела против FGFR2b, предложенные здесь, способны специфично связываться с FGFR2b и FGFR1b. В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, специфично связываются с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b с аффинностью связывания (K_D) 10^-6М или менее (например, 5×10^-7 М или менее, 2×10^-7 М или менее, 10^-7 М или менее, 5×10^-8 М или менее, 2×10^-8 М или менее, 10^-8 М или менее, 5×10^-9 М или менее, 4×10^-9М или менее, 3×10^-9М или менее, 2×10^-9 М или менее, 10^-9 М или менее, 9×10^-10 М или менее, 8×10^-10 М или менее, 7×10^-10 М или менее, 6×10^-10 М или менее, 5×10^-10 М или менее, 4×10^-10 М или менее, 3×10^-10 М или менее, 2,5×10^-10 М или менее, 2×10^-10 М или менее, 1,5×10^-10 М или менее, 10^-10 М или менее, 9×10^-11 М или менее, 5×10^-11 М или менее, 4×10^-11 М или менее, 3×10^-11 М или менее, 2×10^-11 М или менее или 10^-11 М или менее).

В некоторых воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, способны специфично связываться с человеческим FGFR2b с аффинностью связывания (K_D) не более 5×10^-9 М, не более 4×10^-9 М, не более 3×10^-9 М, не более 2×10^-9 М, не более 10^-9 М, не более 5×10^-10 М, не более 4х 10^-10 М, не более 3×10^-10 М, не более 2×10^-10 М, не более 10^-10 М, не более 5×10^-11 М или не более 4×10^-11 М, не более 3×10^-11 М, не более 2×10^-11 М, как измерено посредством Biacore.

В некоторых воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, способны специфично связываться с человеческим FGFR1b с аффинностью связывания (K_D) не более 5×10^-9 М, не более 4×10^-9 М, не более 3×10^-9 М, не более 2×10^-9 М, не более 10^-9 М, не более 5×10^-10 М, не более 4х 10^-10 М, не более 3×10^-10 М, не более 2×10^-10 М, не более 10^-10 М, не более 5×10^-11 М или не более 4×10^-11 М, не более 3×10^-11 М, не более 2×10^-11 М, как измерено посредством Biacore.

В определенных воплощениях антитела против FGFR2b, предложенные здесь, перекрестно взаимодействуют с соответствующим FGFR яванского макака, соответствующим крысиным FGFR и соответствующим мышиным FGFR.

Связывание антител с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b может также быть представлено значением «полумаксимальной эффективной концентрации» (ЕС₅₀), относящимся к концентрации антитела, при которой наблюдают 50% его максимального эффекта (например, связывания, или ингибирования, и так далее). Значение ЕС₅₀ может быть измерено методами, известными в данной области, например, сэндвич-анализом, таким как ELISA, вестерн-блот, проточноцитометрический анализ и другие анализы связывания. В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, специфично связываются с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b с ЕС₅₀ (то есть концентрацией 50%-го связывания) не более 5 нМ, не более 4 нМ, не более 3 нМ, не более 2 нМ, не более 1,5 нМ, не более 1 нМ, не более 0,9 нМ, не более 0,8 нМ, не более 0,7 нМ, не более 0,6 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,4 нМ, не более 0,3 нМ, не более 0,2 нМ или не более 0,1 нМ, по результатам ELISA. В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, специфично связываются с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b с ЕС₅₀ (то есть концентрацией 50%-го связывания) не более 10 нМ, не более 9 нМ, не более 8 нМ, не более 7 нМ, не более 6 нМ, не более 5 нМ, не более 4 нМ, не более 3 нМ, не более 2 нМ, не более 1 нМ, не более 0,8 нМ, не более 0,5 нМ или не более 0,3 нМ, по результатам проточной цитометрии.

В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, также способны специфично связываться с FGFR2b и/или FGFR1b яванского макака и/или с крысиным/мышиным FGFR2b и/или FGFR1b. В определенных воплощениях аффинность связывания антител, предложенных здесь, с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b сходна с аффинностью их связывания с крысиным/мышиным FGFR2b и/или FGFR1b.

В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, имеют специфичную аффинность связывания с человеческим FGFR2b и/или FGFR1b, достаточную для их диагностического и/или терапевтического применения.

В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, блокируют связывание человеческого FGFR2b и/или FGFR1b с их лигандом и, посредством этого, его биологическую активность, включая, например, ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих FGFR2b и/или FGFR1b.

Эффект ингибирования пролиферации может быть представлен значением «50%-й ростоингибирующей концентрации» (GI₅₀), относящимся к концентрации антитела, при которой наблюдают 50% максимального ингибирования пролиферации. Значение GI₅₀ может быть измерено методами, известными в данной области, например, колориметрическим анализом с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолием (MTS) (см. описание в патенте США №5,185,450), анализом с бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) (см. описание в Berridge et al. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:127-52), анализом с alamarBlue (см. описание в патенте США №5,501,959) и любыми другими методами, как описано в Assay Guidance Manual (Sittampalam et al., editors. 2004). В определенных воплощениях антитела, предложенные здесь, способны ингибировать пролиферацию клеток, имеющих человеческий FGFR2b, экспрессированный на их поверхности, с 50%-й ростоингибирующей концентрацией (GI₅₀) не более 15 нМ, не более 14 нМ, не более 13 нМ, не более 12 нМ, не более 11 нМ, не более 10 нМ, не более 9 нМ, не более 8 нМ, не более 7 нМ, не более 6 нМ, не более 5 нМ, не более 2 нМ или не более 1 нМ, как измерено с использованием MTS.

Антигенсвязывающие фрагменты

Согласно изобретению, также предложены антигенсвязывающие фрагменты, которые могут специфично связываться с FGFR2b и/или FGFR1b. Антигенсвязывающие фрагменты различных типов известны в данной области и могут быть разработаны на основе антител против FGFR2b, предложенных здесь, включая, например, типичные антитела, CDR и вариабельные последовательности которых показаны в SEQ ID NO: 1-7 и Таблице 2, и их различные варианты, содержащие модификации или замены.

В определенных воплощениях антигенсвязывающий фрагмент против FGFR2b, предложенный здесь, представляет собой камелизированное однодоменное антитело, диатело, одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), димер scFv, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv-фрагмент, Fab, Fab', F(ab')2, биспецифичное антитело, ds-диатело, нанотело, доменное антитело, однодоменное антитело или бивалентное однодоменное антитело.

Для получения таких антигенсвязывающих фрагментов могут быть применены различные методики. Типичные методы включают ферментативное расщепление интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992), и Brennan et al, Science, 229:81 (1985)), рекомбинантную экспрессию клетками-хозяевами, такими как Е. coli (например, в случае Fab-, Fv- и scFv-фрагментов антител), скрининг из фаговых дисплейных библиотек, как обсуждено выше (например, в случае scFv), и химическое сочетание двух Fab'-SH-фрагментов с получением Р(ab')₂-фрагментов (Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Другие методики получения фрагментов антител будут очевидны специалисту в данной области.

В определенных воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv. Получение scFv описано, например, в WO 93/16185; патентах США №№5,571,894 и 5,587,458). ScFv может быть слит с эффекторным белком на N- или С-конце с получением слитого белка (см., например, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck).

Конъюгаты

В некоторых воплощениях антитела против FGFR2b дополнительно содержат конъюгатную группировку. Конъюгатная группировка может быть связана с антителом, предложенным здесь. Конъюгатная группировка представляет собой небелковую или пептидную группировку, которая может быть присоединена к антителу. Предполагают, что с антителами, предложенными здесь, может быть связано множество конъюгатных группировок (см., например, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)). Помимо прочих методов, конъюгатная группировка может быть связана с антителом посредством ковалентных связей, аффинных связей, интеркаляции, координационных связей, комплексообразования, ассоциации, смешивания или добавления.

В определенных воплощениях антитело против FGFR2b связано с одним или более чем одним конъюгатом через линкер. В определенных воплощениях линкер представляет собой гидразиновый линкер, дисульфидный линкер, бифункциональный линкер, дипептидный линкер, глюкуронидный линкер или тиоэфирный линкер. В определенных воплощениях линкер представляет собой лизосомно расщепляемый дипептид, например валин-цитруллин (vc).

Конъюгатная группировка может представлять собой терапевтический агент (например, цитотоксический агент), радиоактивный изотоп, выявляемую метку (например, лантаноид, люминесцентную метку, флуоресцентную метку или фермент-субстратную метку), группировку, модифицирующую фармакокинетику, или группировку для очистки (такую как магнитная частица или наночастица).

Примеры выявляемой метки могут включать флуоресцентную метку (например, флуоресцеин, родамин, дансил, фикоэритрин или техасский красный), фермент-субстратную метку (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, люциферазы, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы или β-D-галактозидазу), радиоизотоп, люминесцентную метку, хромофорную группировку, дигоксигенин, биотин/авидин, молекулу ДНК или золото для выявления.

Примеры радиоизотопов могут включать ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I,³⁵S, ³Н, ¹¹In, ¹¹²In, ¹⁴С, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P и другие лантаноиды. Антитела, меченные радиоизотопами, полезны в экспериментах с рецептор-направленной визуализацией.

В определенных воплощениях группировка, модифицирующая фармакокинетику, может представлять собой агент, модифицирующий клиренс, способствующий увеличению периода полувыведения антитела. Типичные примеры включают водорастворимые полимеры, такие как ПЭГ, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля и тому подобное. Полимеры могут иметь любую молекулярную массу и могут быть разветвленными или неразветвленными. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и в случае присоединения более чем одного полимера они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы.

В определенных воплощениях конъюгатная группировка может представлять собой группировку для очистки, такую как магнитная частица или наночастица. Конъюгаты антител с лекарственными средствами

В определенных воплощениях конъюгаты, предложенные здесь, представляют собой конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC), содержащие любое из указанных выше антител против FGFR2b, конъюгированное с цитотоксическим агентом. Иными словами, конъюгатная группировка включает цитотоксический агент.

ADC могут быть полезны для местной доставки цитотоксического агента, например, при лечении рака. Это позволяет проводить направленную доставку цитотоксических агентов в опухоли и обеспечивать их внутриклеточное накопление в опухолях, что особенно полезно в тех случаях, когда системное введение этих цитотоксических агентов в неконъюгированной форме может приводить к неприемлемым уровням токсичности в отношении нормальных клеток наряду с опухолевыми клетками, которые необходимо устранить (Baldwin et al., (1986), Lancet, 603-05; Thorpe, (1985), Monoclonal Antibodies, 84; Pinchera et al. (ed.s), Biological And Clinical Applications, 475-506; Syrigos and Epenetos (1999), Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; и патент США №4,975,278).

«Цитотоксический агент» может представлять собой любой агент, который вреден для раковых клеток или может повреждать или уничтожать раковые клетки. В определенных воплощениях цитотоксический агент, возможно, представляет собой химиотерапевтический агент (такой как ростоингибирующий агент, агенты, алкилирующие ДНК, ингибитор топоизомеразы, агенты, связывающиеся с тубулином, или другие противораковые лекарственные средства), токсин или высоко реактивный радиоактивный изотоп.

Примеры цитотоксических агентов включают высокомолекулярные бактериальные токсины и растительные токсины, такие как, например, дифтерийный токсин, А-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), рицин, абрин, модессин, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PARI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены (см., например, WO 93/21232). Такой высокомолекулярный токсин может быть конъюгирован с антителами, предложенными здесь, с применением методов, известных в данной области, например, как описано в Vitetta et al. (1987) Science, 238:1098.

Цитотоксический агент может также представлять собой низкомолекулярные токсины и химиотерапевтические лекарственные средства, такие как гелданамицин (Mandler et al. (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтансиноиды (ЕР 1391213; Liu et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, виндезин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин,

дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и их аналоги, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, дакарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платины (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее - дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее - актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин), калихеамицин, майтансиноиды, доластатины, ауристатины (такие как монометилауристатин Е (ММАЕ) и монометилауристатин F (MMAF)), трихотецен, и СС1065, и их производные, обладающие цитотоксической активностью. Такой токсин может быть конъюгирован с антителами, предложенными здесь, с применением методов, известных в данной области, например, как описано в US 7,964,566, Kline, Т. et al, Pharmaceutical Research, 32(11): 3480-3493.

Цитотоксический агент может также представлять собой высоко радиоактивный изотоп.Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Методы конъюгации радиоизотопа с антителом известны в данной области, например, конъюгация с использованием подходящего лигандного реагента (см, например, WO 94/11026; Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)). Лигандный реагент имеет хелатирующий лиганд, который может связываться, образовывать хелат или иной комплекс с радиоизотопом металла, и также имеет функциональную группу, способную взаимодействовать с тиолом цистеина антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Типичные хелатирующие лиганды включают DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и ТЕТА (Macrocyclics, Даллас, штат Техас).

В определенных воплощениях антитела присоединены к конъюгатной группировке через линкер, например, гидразиновый линкер, дисульфидный линкер, бифункциональный линкер, дипептидный линкер, глюкуронидный линкер или тиоэфирный линкер.

Типичные бифункциональные линкеры включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(и-азидобензоил)-гександиамин), бис-диазониевые производные (такие как бис-(и-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и активные бис-фторсодержащие соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).

В определенных воплощениях линкер является расщепляемым в определенной физиологической среде, способствуя посредством этого высвобождению цитотоксического агента в клетке. Например, линкер может представлять собой кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al, Cancer Research 52:127-131 (1992); патент США №5,208,020). В некоторых воплощениях линкер может содержать аминокислотные остатки, такие как дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Аминокислотные остатки линкера могут представлять собой природные или не встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Примеры таких линкеров включают валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe), глицин-в алии-цитруллин (gly-val-cit), глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly), валин-цитруллин-и-аминобензилоксикарбонил («vc-PAB»). Компоненты аминокислотного линкера могут быть выбраны и оптимизированы для обеспечения селективности их ферментативного расщепления определенным ферментом, например, опухоль-ассоциированной протеазой, катепсином В, С и D или плазминовой протеазой.

В определенных воплощениях в ADC, предложенном здесь, антитело (или антигенсвязывающий фрагмент) конъюгировано с одним или более чем одним цитотоксическим агентом в соотношении антитело/агент от приблизительно 1 до приблизительно 20, от приблизительно 1 до приблизительно 6, от приблизительно 1 до приблизительно 3, от приблизительно 1 до приблизительно 2, от приблизительно 1 до приблизительно 1, от приблизительно 2 до приблизительно 5 или от приблизительно 3 до приблизительно 4.

ADC, предложенный здесь, может быть получен любыми подходящими методами, известными в данной области. В определенных воплощениях сначала проводят взаимодействие нуклеофильной группы антитела с бифункциональным линкерным реагентом, а затем его связывание с цитотоксическим агентом, или наоборот, то есть сначала проводят взаимодействие нуклеофильной группы цитотоксического агента с бифункциональным линкером, а затем его связывание с антителом.

В определенных воплощениях цитотоксический агент может содержать (или может быть модифицирован, чтобы содержать) тиолореактивную функциональную группу, которая может взаимодействовать с цистеиновым тиолом свободного цистеина антител, предложенных здесь. Типичная тио лоре активная функциональная группа включает, например, малеимид, йодацетамид, пиридилдисульфид, галогенацетил, сукцинимидиловый сложный эфир (например, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, суль фонил хлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафторфениловый сложный эфир или фосфорамидит (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, hie; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp.40-55, 643-671).

Цитотоксический агент или антитело могут взаимодействовать со связывающим реагентом до их конъюгации с образованием ADC. Например, может быть получен, выделен, очищен и/или охарактеризован N-гидроксисукцинимидиловый сложный эфир (NHS) цитотоксического агента, или он может быть образован in situ и подвергнут взаимодействию с нуклеофильной группой антитела.

В некоторых воплощениях цитотоксический агент и антитело могут быть связаны посредством активации и взаимодействия in situ с образованием ADC за одну стадию. В другом примере антитело может быть конъюгировано с биотином, затем непрямым образом конъюгировано со вторым конъюгатом, конъюгированным с авидином.

В определенных воплощениях конъюгатная группировка случайным образом присоединена к поверхностному аминокислотному остатку конкретного типа в антителе, например, к цистеиновому остатку или лизиновому остатку.

В определенных воплощениях конъюгатная группировка присоединена к конкретно определенному сайту с получением популяций ADC с высокой однородностью и единообразием от партии к партии применительно к отношению лекарственного средства к антителу (DAR) и сайта присоединения. В определенных воплощениях конъюгатная группировка присоединена к конкретно определенным сайтам молекул антител через природные аминокислоты, не встречающуюся в природе аминокислоту, короткие пептидные метки или гликаны Asn297. Например, конъюгация может быть проведена в конкретном сайте вне эпитопсвязывающей части.

Сайт-специфичное присоединение может быть осуществлено введением такой аминокислоты, как цистеин, с которой можно конъюгировать группировку лекарственного средства, вместо нативной аминокислоты в конкретном сайте антитела или до/после конкретного сайта антитела (см. Stimmel et al. (2000), JBC, 275(39):30445-30450; Junutula et al. (2008), Nature Biotechnology, 26(8):925-932; и WO 2006/065533). Альтернативно, сайт-специфичная конъюгация может быть осуществлена посредством конструирования антител, содержащих не встречающиеся в природе аминокислоты (например, n-ацетилфенилаланин (pAcF), N6-((2-азидоэтокси)карбонил)-Ь-лизин, и-азидометил-L-фенилаланин (pAMF) и селеноцистеин (Sec)) в конкретных сайтах их тяжелых и/или легких цепей, как описано Axup et al. ((2012), Proc Natl Acad Sci USA. 109(40):16101-16116), где не встречающиеся в природе аминокислоты обеспечивают дополнительное преимущество, заключающееся в возможной ортогональной химии для присоединения линкерного реагента и лекарственного средства. Типичные конкретные сайты (например, V205 легкой цепи, А114, S239, Н274, Q295, S396 и так далее), применимые в двух описанных выше методах сайт-специфичной конъюгации, описаны во многих источниках из предшествующего уровня техники, например, Strop et al. (2013), Chemistry & Biology, 20, 161-167; Qun Zhou (2017), Biomedicines, 5, 64; Dimasi et al. (2017), Mol. Pharm., 14, 1501-1516; WO 2013/093809 и WO 2011/005481. Другим методом сайт-специфичной конъюгации ADC является гликаноопосредованная конъюгация, при которой линкер с лекарственным средством может быть конъюгирован с гликанами Asn297 (такими как фукоза, галактоза, N-ацетил галактозами, N-ацетилглюкозамин, сиаловая кислота), расположенного в домене СН2, вместо сочетания относительно гидрофобного цитотоксического агента с аминокислотным каркасом антитела. Также были предприняты усилия для введения уникальных коротких пептидных меток (таких как LLQG, LPETG, LCxPxR) в антитела через конкретные сайты (например, сайты в N-концевых или С-концевых областях), что позволяет затем функционализировать определенные аминокислоты пептидных меток и сочетать их с линкерами, связанными с лекарственными средствами (Strop et al. (2013), Chemistry & Biology, 20, 161-167; Beerli et al. (2015), PLoS ONE, 10, e0131177; Wu et al. (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 3000-3005; Rabuka (2012), Nat. Protoc. 7, 1052-1067).

Полинуклеотиды и рекомбинантные методы

Согласно настоящему изобретению предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие антитела против FGFR2b, предложенные здесь.

При использовании здесь термин «полинуклеотид» относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одно- или двуцепочечной форме. В отсутствие конкретных ограничений данный термин охватывает полинуклеотиды, содержащие известные аналоги естественных нуклеотидов, характеристики связывания которых сходны с соответствующими характеристиками эталонной нуклеиновой кислотой и метаболизм которых сходен с метаболизмом нуклеотидов, встречающихся в природе. Если не указано иное, определенная полинуклеотидная последовательность также полностью охватывает свои консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также прямо указанную последовательность. Конкретно, замены вырожденных кодонов могут быть осуществлены получением последовательностей, где третье положение одного или более чем одного из выбранных (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками (см. Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

В определенных воплощениях выделенные полинуклеотиды содержат одну или более чем одну нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, и/или последовательность, гомологичную им, идентичную по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 88%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%), и/или их вариант, имеющий только вырожденные замены и кодирующий вариабельную область типичных антител, предложенных здесь. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, легко выделить и секвенировать с применением обычных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Кодирующая ДНК может также быть получена синтетическими методами.

Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитела против FGFR2b (например, содержащий последовательности, как показано в Таблице 3), может быть введен в вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии с применением рекомбинантных методик, известных в данной области. Доступно множество векторов. Компоненты вектора обычно включают, без ограничения, одно или более из следующего: сигнальную последовательность, репликатор, один или более чем один маркерный ген, энхансерный элемент, промотор (например, SV40, CMV, EF-1α) и последовательность терминации транскрипции. Вектор может также включать вещества, способствующие его проникновению в клетку, включая, без ограничения, вирусные частицы, липосомы или белковую оболочку.

Согласно настоящему изобретению предложены векторы (например, векторы для клонирования или векторы экспрессии), содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, предложенную здесь, кодирующую антитела, по меньшей мере один промотор (например, SV40, CMV, EF-1α), функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один селекционный маркер. Примеры векторов включают, без ограничения, плазмиды, фагмиды, космиды и искусственные хромосомы, такие как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (ВАС) или искусственная хромосома, имеющая происхождение от Р1 (РАС), бактериофаги, такие как фаг лямбда или фаг М13, и вирусы животных. Категории вирусов животных, используемых в качестве векторов экспрессии, включают ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, папилломавирус и паповавирус (например, SV40). Типичные плазмиды включают pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCa1, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, pl5TV-L, _PProl8, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1. 1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXTl, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos и так далее.

Векторы, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, могут быть введены в клетку-хозяина для клонирования или экспрессии гена. Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных здесь, представляют собой прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки, описанные выше. Подходящие прокариоты для этой цели включают эубактерий, таких как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis, Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces.

Помимо прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела против FGFR2b, являются эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Из низших эукариотических микроорганизмов-хозяев наиболее широко используемыми являются Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи. Тем не менее, существуют другие общедоступные и применимые здесь рода, виды и штаммы, такие как: Schizosaccharomyces pombe; хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (АТСС 12,424), K. bulgaricus (АТСС 16,045), К. wickeramii (АТСС 24,178), K. waltii (АТСС 56,500), К. drosophilarum (АТСС 36,906), K. thermotolerans и K. marxianus; Yarrowia (ЕР 402,226); Pichia pastoris (ЕР 183,070); Candida; Trichoderma reesia (ЕР 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие как, например, хозяева Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии антител или антигенсвязывающих фрагментов, предложенных здесь, имеют происхождение от многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают растительные клетки и клетки насекомых. Известно множество бакуловирусных штаммов и вариантов и соответствующих пермиссивных клеток-хозяев, представляющих собой клетки насекомых-хозяев, таких как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Есть множество общедоступных вирусных штаммов для трансфекции, например, вариант L-1 NPV Autographa californica и штамм Bm-5 NPV Bombyx mori, и такие вирусы могут быть использованы здесь в качестве вируса по настоящему изобретению, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев могут также быть использованы культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов и табака.

Тем не менее, наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) стало рутинной процедурой. Примерами применимых линий клеток-хозяев, являющихся клетками млекопитающих, являются: линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линия эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); линия клеток мышиной миеломы (NSO, Galfre and Milstein (1981), Methods in Enzymology, 73:3-46; Sp2/0-Ag14, ATCC CRL-1581); клетки яичника китайского хомяка/-DHFR (CHO, Urlaub et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки рака шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL34); клетки печени крысы (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2). В некоторых предпочтительных воплощениях клетка-хозяин представляет собой культивированные клетки млекопитающего, такие как клетки СНО, клетки ВНК или клетки NS0.

В некоторых воплощениях клетка-хозяин способна продуцировать антитело с модифицированным гликозилированием. Например, линия клеток-хозяев может обеспечивать гликозилирующий аппарат, необходимый при посттрансляционной модификации. Примеры таких линий клеток-хозяев включают, без ограничения, линии клеток с измененной (повышенной или сниженной), нативным образом или в результате генной инженерии, активностью ферментов, связанных с гликозилированием, таких как глюкозаминилтрансфераза (например, β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III (GnTIII)), гликозилтрансфераза (например, β(1,4)-галактозилтрансфераза (GT)), сиалилтрансфераза (например, α(2,3)-сиалилтрансфераза (ST)), маннозидаза (например, маннозидаза II (ManII)), фукозилтрансфераза (например, ген альфа-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8), (1,3)фукозилтрансфераза), прокариотическая ОВР-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулозоредуктаза (RMD), GDP-фукозный переносчик (GFT).

В некоторых воплощениях клетка-хозяин характеризуется недостаточностью функциональной FUT8, сверхэкспрессией гетерологичной GnTIII, экспрессией прокариотической ОВР-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулозоредуктазы (RMD) или недостаточностью функционального GFT. Линия клеток-хозяев с нокаутом FUT8 характеризуется дефицитом фукозилирования и продуцирует афукозилированные антитела. Сверхэкспрессия GnTIII в линии клеток-хозяев (см., например, технологию Glycart от Roche) приводит к образованию раздвоенной нефукозилированной гликозилированной формы антитела. Экспрессия RMD (например, как в системе GlymaxX® от ProBioGen AG) ингибирует биосинтез фукозы de novo, и, вследствие этого, антитела, продуцируемые такими линиями клеток-хозяев, также демонстрируют сниженное фукозилирование. Нокаут GFT в клеточной линии СНО (см., например, технологию от Beijing Mabworks Biotech) блокирует как путь биосинтеза фукозы de novo, так и реутилизационный путь биосинтеза фукозы и приводит к снижению фукозилирования.

Клетки-хозяева трансформируют описанными выше векторами экспрессии или клонирующими векторами для продукции антитела против FGFR2b и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. В другом воплощении антитело может быть получено гомологичной рекомбинацией, известной в данной области.

Клетки-хозяева, используемые для получения антител, предложенных здесь, можно культивировать во множестве сред. Для культивирования клеток-хозяев подходят имеющиеся в продаже среды, такие как среда Хэма (Ham's F10) (Sigma), минимальная питательная среда (Minimal Essential Medium, MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM) (Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды для клеток-хозяев может быть использована любая из сред, описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem. 102:255 (1980), патентах США №№4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655 или 5,122,469, WO 90/03430, WO 87/00195 или патенте США №30,985. Любые из этих сред могут, по необходимости, быть дополнены гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как GENTAMYCIN™), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в микромолярных конечных концентрациях) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Также могут быть включены любые другие необходимые добавки в подходящих концентрациях, которые будут известны специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, идентичны использованным ранее с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалисту в данной области.

При применении рекомбинантных методик возможна продукция антитела внутри клеток, в периплазматическом пространстве или с его секрецией непосредственно в среду. При внутриклеточной продукции антитела в качестве первой стадии удаляют частицы детрита, представляющие собой клетки-хозяева или лизированные фрагменты, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. В Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992) описана методика выделения антител, секретированных в периплазматическое пространство Е. coli. Кратко, клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), EDTA и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) на протяжении приблизительно 30 мин. Клеточный детрит можно удалить центрифугированием. В случае секреции антитела в среду образцы надосадочной жидкости таких систем экспрессии обычно сначала концентрируют с использованием имеющегося в продаже фильтра для концентрирования белка, например, ультрафильтрационной системы Amicon или Millipore Pellicon. В любую из вышеупомянутых стадий может быть включен ингибитор протеаз, такой как PMSF, для ингибирования протеолиза, и могут быть включены антибиотики для предотвращения роста случайных примесных клеток.

Антитела против FGFR2b, полученные из клеток, могут быть очищены с применением, например, хроматографии с гидроксиапатитом, электрофореза в геле, диализа, ионообменной хроматографии с DEAE-целлюлозой, преципитацией с сульфатом аммония, высаливанием и аффинной хроматографией, при этом предпочтительной методикой очистки является аффинная хроматография.

В определенных воплощениях используют белок А, иммобилизованный на твердой фазе, для иммуноаффинной очистки антитела и его антигенсвязывающего фрагмента. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в антителе. Белок А может быть использован для очистки антител на основе человеческих тяжелых цепей гамма-1, гамма-2 или гамма-4 (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Для всех мышиных изотипов и для человеческих гамма-3 рекомендован белок G (Guss et al, EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). Матрицей, к которой присоединен аффинный лиганд, чаще всего является агароза, но доступны другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемой пористостью или поли(стиролдивинил)бензол, позволяют применять более высокие скорости потока и меньшее время обработки, чем при использовании агарозы. Когда антитело содержит домен СНЗ, для очистки может быть использована смола Bakerbond АВХ™ (J. Т. Baker, Филипсбург, штат Нью-Джерси). Также доступны другие методики очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация с этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарине, SEPHAROSE™, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и преципитация с сульфатом аммония, в зависимости от выделяемого антитела.

После любой стадии (стадий) предварительной очистки смесь, содержащая интересующее антитело и примеси, может быть подвергнута хроматографии гидрофобного взаимодействия при низком рН с использованием элюирующего буфера при рН приблизительно 2,5-4,5, предпочтительно проводимой при низких концентрациях соли (например, при приблизительно 0-0,25 М соли).

Фармацевтическая композиция

Согласно настоящему изобретению также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело против FGFR2b, предложенное здесь, и один или более чем один фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемые носители для применения в фармацевтических композициях, раскрытых здесь, могут включать, например, фармацевтически приемлемые жидкие, гелевые или твердые носители, водные растворители, неводные растворители, антимикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, анестетики, суспендирующие/диспергирующие агенты, секвестрирующие или хелатирующие агенты, разбавители, адъюванты, эксципиенты или нетоксичные вспомогательные вещества, другие компоненты, известные в данной области, или их различные комбинации.

Подходящие компоненты могут включать, например, антиоксиданты, наполнители, связывающие агенты, разрыхлители, буферы, консерванты, смазывающие агенты, корригенты, загустители, красители, эмульгаторы или стабилизаторы, такие как сахара и циклодекстрины. Подходящие антиоксиданты могут включать, например, метионин, аскорбиновую кислоту, EDTA, тиосульфат натрия, платину, каталазу, лимонную кислоту, цистеин, тиоглицерин, тиогликолевую кислоту, тиосорбит, бутилгидроксианизол, бутилгидрокситолуол и/или пропилгаллат.Как раскрыто здесь, включение одного или более чем одного антиоксиданта, такого как метионин, в композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент и конъюгаты, как предложено здесь, снижает окисление антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Такое снижение окисления предотвращает или уменьшает снижение аффинности связывания, улучшая посредством этого стабильность антитела и максимизируя срок хранения. Таким образом, в определенных воплощениях предложены композиции, содержащие одно или более чем одно антитело, как раскрыто здесь, и один или более чем один антиоксидант, такой как метионин. Также предложены способы предотвращения окисления, продления срока хранения и/или улучшения эффективности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как предложено здесь, посредством смешивания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с одним или более чем одним антиоксидантом, таким как метионин.

Для дополнительного пояснения, фармацевтически приемлемые носители могут включать, например, водные растворители, такие как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотоническая декстроза для инъекций, стерильная вода для инъекций или декстроза и лактат Рингера для инъекций, неводные растворители, такие как нелетучие масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло или арахисовое масло, антимикробные агенты в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, изотонические агенты, такие как хлорид натрия или декстроза, буферы, такие как фосфатные или цитратные буферы, антиоксиданты, такие как бисульфат натрия, местные анестетики, такие как гидрохлорид прокаина, суспендирующие и диспергирующие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, гидроксипропилметилцеллюлоза или поливинилпирролидон, эмульгаторы, такие как полисорбат 80 (TWEEN 80), секвестрирующие или хелатирующие агенты, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) или EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), этиловый спирт, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, гидроксид натрия, соляную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту. В фармацевтические композиции в многодозовых контейнерах могут быть добавлены антимикробные агенты, используемые в качестве носителей, включающие фенолы или крезолы, соединения ртути, бензиновый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый эфиры и-гидроксибензойной кислоты, тимеросал, хлорид бензалкония и хлорид бензетония. Подходящие эксципиенты могут включать, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин или этанол. Подходящие нетоксичные вспомогательные вещества могут включать, например, смачивающие агенты или эмульгаторы, рН-буферные агенты, стабилизаторы, усилители растворимости или такие агенты, как ацетат натрия, сорбитанмонолаурат, олеат триэтаноламина или циклодекстрин.

Фармацевтические композиции могут представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, пилюлю, капсулу, таблетку, композицию с длительным высвобождением или порошок. Композиции для перорального введения могут содержать стандартные носители, такие как фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, поливинилпирролидона, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и так далее.

В определенных воплощениях фармацевтические композиции изготавливают в виде композиций для инъекций. Фармацевтические композиции для инъекций могут быть изготовлены в любой обычной форме, такой как, например, жидкий раствор, суспензия, эмульсия или твердые формы, подходящие для получения жидкого раствора, суспензии или эмульсии. Препараты для инъекций могут включать стерильные и/или апирогенные растворы, готовые для инъекции, стерильные сухие растворимые вещества, такие как лиофилизированные порошки, готовые для смешивания с растворителем непосредственно перед применением, включая подкожные таблетки, стерильные суспензии, готовые для инъекции, стерильные сухие нерастворимые вещества, готовые для смешивания с наполнителем непосредственно перед применением, и стерильные и/или апирогенные эмульсии. Растворы могут быть водными или неводными.

В определенных воплощениях препараты для парентерального введения со стандартной дозой упакованы в ампулу, флакон или шприц с иглой. Все препараты для парентерального введения должны быть стерильными и апирогенными, что является известной практикой в данной области.

В определенных воплощениях стерильный лиофилизированный порошок получают растворением антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как раскрыто здесь, в подходящем растворителе. Растворитель может содержать эксципиент, улучшающий стабильность других фармакологических компонентов порошка или восстановленного раствора, полученного из порошка. Эксципиенты, которые могут быть использованы, включают, без ограничения, воду, декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу или другой подходящий агент. Растворитель может содержать буфер, такой как цитратный буфер, буфер с фосфатом натрия или калия или другой такой буфер, известный специалистам в данной области, при, в одном воплощении, приблизительно нейтральном рН. Последующая стерилизующая фильтрация раствора с последующей лиофилизацией в стандартных условиях, известных специалистам в данной области, приводит к получению желаемой композиции. В одном воплощении полученный раствор будут распределять по флаконам для лиофилизации. Каждый флакон может содержать одну дозу или множество доз антитела против FGFR2b или его композиции. Допустимо переполнение флаконов небольшим количеством сверх необходимого для дозы или набора доз (например, приблизительно на 10%) для облегчения точности отбора образцов и точности дозирования. Лиофилизированный порошок можно хранить в подходящих условиях, таких как температура от приблизительно 4°С до комнатной.

Восстановление лиофилизированного порошка водой для инъекций приводит к получению композиции для применения при парентеральном введении. В одном воплощении для восстановления к лиофилизированному порошку добавляют стерильную и/или апирогенную воду или другой подходящий жидкий носитель. Точное количество зависит от выбранной проводимой терапии и может быть определено эмпирически.

Способы применения

Согласно настоящему изобретению также предложены терапевтические способы, включающие введение терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как предложено здесь, субъекту, нуждающемуся в этом, что приводит к лечению или предупреждению состояния или расстройства, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b. В некоторых воплощениях состояние или расстройство, связанное с FGFR2b и/или FGFR1b, представляет собой рак, возможно, рак характеризуется экспрессией или сверхэкспрессией FGFR2b и/или FGFR1b.

Примеры рака включают, без ограничения, рак яичника, эндометриальный рак, рак молочной железы, рак легкого (мелкоклеточный или немелкоклеточный), рак толстой кишки, рак предстательной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак пищевода, печеночноклеточный рак (рак печени), почечноклеточный рак (рак почки), рак головы и шеи, мезотелиому, меланому, саркомы, опухоли головного мозга (например, глиомы, такие как глиобластомы) и гематологические злокачественные опухоли.

В некоторых воплощениях состояние или расстройство, связанное с FGFR представляет собой рак, характеризующийся экспрессией или сверхэкспрессией FGFR2b и/или FGFR1b.

Экспрессия или сверхэкспрессия FGFR2b и/или FGFR1b могут быть определены в диагностическом или прогностическом анализе посредством оценки повышенных уровней FGFR в биологическом образце субъекта (таком как образец, имеющий происхождение от раковой клетки или ткани или иммунных клеток, инфильтрирующих опухоль). Могут быть применены различные методы. Например, может быть применен диагностический или прогностический анализ для оценки уровней экспрессии FGFR2b и/или FGFR1b, присутствующих на поверхности клетки (например, посредством иммуногистохимического (ИГХ) исследования). Альтернативно или дополнительно, возможно измерение уровней нуклеиновой кислоты, кодирующей FGFR, в клетке, например, посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH; см. WO 98/45479, опубликованную в октябре 1998 г. ), Саузерн-блоттинга или методик на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как количественная ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Methods 132: 73-80 (1990)). Помимо анализов, указанных выше, специалисту в данной области доступны различные анализы in vivo. Например, можно воздействовать на клетки в организме пациента антителом, возможно, меченным выявляемой меткой, например, радиоактивным изотопом, и можно провести оценку связывания антитела с клетками пациента, например, посредством внешнего сканирования на предмет радиоактивности или посредством анализа биоптата, полученного у пациента, которому ранее было введено антитело.

Терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как предложено здесь, будет зависеть от различных факторов, известных в данной области, таких как, например, масса тела, возраст, прошлый анамнез, сопутствующая лекарственная терапия, состояние здоровья субъекта и возможные перекрестные реакции, аллергии, чувствительность и нежелательные побочные эффекты, а также путь введения и степень развития заболевания. Специалист в данной области (например, врач или ветеринар) может пропорционально снижать или повышать дозы, в соответствии с этими и другими обстоятельствами или требованиями.

В определенных воплощениях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как предложено здесь, может быть введен в терапевтически эффективной дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг. В определенных из этих воплощений антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе приблизительно 50 мг/кг или менее, и в определенных из этих воплощений доза составляет 10 мг/кг или менее, 5 мг/кг или менее, 3 мг/кг или менее, 1 мг/кг или менее, 0,5 мг/кг или менее или 0,1 мг/кг или менее. В определенных воплощениях вводимая доза может меняться в ходе лечения. Например, в определенных воплощениях начальная вводимая доза может быть выше последующих вводимых доз. В определенных воплощениях вводимая доза может варьировать в ходе лечения в зависимости от реакции субъекта.

Схемы введения можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, возможно введение единственной дозы или введение нескольких разделенных доз с течением времени.

Антитела, раскрытые здесь, могут быть введены любым путем введения, известным в данной области, таким как, например, парентеральные (например, подкожная, внутрибрюшинная, внутривенная, включая внутривенную инфузию, внутримышечная или внутрикожная инъекция) или непарентеральные (например, пероральный, интраназальный, внутриглазной, сублингвальный, ректальный или местный) пути введения.

В некоторых воплощениях антитела, раскрытые здесь, могут быть введены сами по себе или в комбинации с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим средством или агентом. Например, антитела, раскрытые здесь, могут быть введены в комбинации с другим терапевтическим агентом, например, химиотерапевтическим агентом или противораковым лекарственном средством.

В определенных из этих воплощений антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как раскрыто здесь, вводимые в комбинации с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом, могут быть введены одновременно с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом, и в определенных из этих воплощений антитело или антигенсвязывающий фрагмент и дополнительный терапевтический агент (агенты) могут быть введены как часть одной и той же фармацевтической композиции. Тем не менее, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вводимые «в комбинации» с другим терапевтическим агентом, не обязательно вводят одновременно или в одной и той же композиции с этим агентом. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вводимые до или после другого агента, рассматривают как вводимые «в комбинации» с данным агентом, как эта фраза использована здесь, даже если антитело или антигенсвязывающий фрагмент и второй агент вводят разными путями введения. По возможности, дополнительные терапевтические агенты, вводимые в комбинации с антителами, раскрытыми здесь, вводят по схеме, приведенной в инструкции по применению дополнительного терапевтического агента, или в соответствии с Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)) или протоколами, хорошо известными в данной области.

Согласно настоящему изобретению также предложены способы применения антител против FGFR2b.

В некоторых воплощениях согласно настоящему изобретению предложены способы выявления присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце, включающие приведение образца в контакт с антителом и определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце.

В некоторых воплощениях согласно настоящему изобретению предложены способы диагностики заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающие: (а) приведение образца, полученного от субъекта, в контакт с антителом, предложенным здесь; (б) определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце; (в) соотнесение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b с наличием или статусом заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта.

В некоторых воплощениях согласно настоящему изобретению предложены способы прогнозирования заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающие: (а) приведение образца, полученного от субъекта, в контакт с антителом, предложенным здесь; (б) определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце; (в) соотнесение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b с возможным ответом субъекта на антагонист FGFR2b и/или FGFR1b.

В некоторых воплощениях согласно настоящему изобретению предложены наборы, содержащие антитело, предложенное здесь, возможно, конъюгированное с выявляемой группировкой. Наборы могут быть полезны при выявлении FGFR2b и/или FGFR1b или диагностике заболевания, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b.

В некоторых воплощениях согласно настоящему изобретению также предложено применение антитела, предложенного здесь, в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, при котором полезна модуляция экспрессии FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, в изготовлении диагностического/прогностического реагента для диагностики/прогнозирования заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b.

Последующие примеры приведены для лучшего пояснения заявленного изобретения, и их не следует интерпретировать как ограничение объема изобретения. Все конкретные композиции, материалы и методы, описанные ниже, полностью или частично, включены в объем настоящего изобретения. Подразумевают, что эти конкретные композиции, материалы и методы не ограничивают изобретение, а лишь поясняют конкретные воплощения, включенные в объем изобретения. Специалист в данной области может разработать эквивалентные композиции, материалы и методы, не используя изобретательские способности и не выходя за рамки объема изобретения. Следует понимать, что в методики, описанные здесь, можно внести множество изменений, не выходя за рамки настоящего изобретения. Авторы изобретения подразумевают, что такие изменения включены в объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Клетки и реагенты

Клеточные линии рака желудка человека KATOIII и SNU16 с экспрессией FGFR2b и клетки Ba/F3 (пре-В-лимфоциты) получали от Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС). Клеточная линия рака пищевода человека KYSE180 была предоставлена Пекинским университетом. Описанные выше человеческие клеточные линии культивировали в соответствии с рекомендациями изготовителей. Человеческую опухолевой ткань получали из больницы Чжуншаня (Китай) с согласия пациента в соответствии с правилами и использовали для разработки ксенотрансплантационной модели рака легкого человека LC038, полученного от пациента.

Для разработки клеточных анализов для скрининга антител в периоде получения антител клетки Ba/F3 модифицировали для экспрессии FGFR2b или FGFR2c. Клетки Ba/F3 трансфицировали плазмидами, кодирующими изоформы 2b или 2 с человеческого FGFR2. После селекции с использованием G418 выделяли один клон с высокой экспрессией FGFR2b или FGFR2c.

Бета-изоформу (домены IgD2 и IgD3) человеческого FGFR2b экспрессировали в форме иммуноадгезионных молекул посредством слияния остатков 65-267 внеклеточного домена («ECD-домена») FGFR2b (регистрационный номер в Genbank NP 001138391) с человеческой Fc-областью (остатки 100-330) в ДНК-плазмидах. Белок экспрессировали, трансфицируя человеческие клетки 293F (Invitrogen), и очищали из культуральной среды с использованием колонки с белком A/G.

кДНК ECD-домена FGFR2b яванского макака (супо) клонировали с применением стандартных методик из мРНК кожи яванского макака и проводили слияние аминокислот 1-253 с мышиной Fc, получая «FGFR2b яванского макака - Fc» для экспрессии. Также экспрессировали остатки ECD-домена человеческого (hu) FGFR2b (65-267 NP 001138391) или крысиного FGFR2b (56-308 NP 001103363.1), слитые с мышиной Fc. ECD крысиного и мышиного FGFR2b идентичны.

Все слитые белки других представителей семейства человеческих FGFR с человеческой Fc получали от R&D Systems, включая рекомбинантные белки FGFR1b-Fc, FGFR1c-Fc, FGFR2c, FGFR1c-Fc, FGFR3b-Fc, FGFR3c-Fc и FGFR4-Fc. Альфа-изоформу FGFR2b-Fc, FGF также получали от R&D Systems. Гепарин получали от Sigma-Aldrich (SIGMA, #H3149-500KU-9). МКПК получали от AllCell (#LP 180322).

Клинически применяемое специфичное антитело против человеческого FGFR2b FPA144 экспрессировали согласно родственной патентной заявке WO 2015/017600 А1.

Пример 2. Получение моноклинальных антител против FGFR

Мышей Balb/c или мышей SJL иммунизировали «человеческим FGFR2b (бета) -Fc» в CFA/IFA внутрибрюшинно в начальной дозе 50 мкг/мышь и затем 25 мкг/мышь или в начальной дозе 10 мкг/мышь и затем 5 мкг/мышь. Сывороточный титр против человеческого FGFR2b-Fc или человеческого FGFR2c-Fc определяли посредством ELISA. Через четверо суток после последней инъекции извлекали лимфоидные клетки из подколенной области и проводили их слияние с клетками мышиной миеломы. Через десять суток после слияния проводили первичный скрининг надосадочной жидкости гибридомных культур на предмет связывания с «FGFR2b (бета) - Fc» в сравнении с NC-Fc (Fc-фрагменты отрицательного контроля) посредством ELISA. Отбирали гибридомы с антителами, связывавшимися с «FGFR2b (бета) Fc», но не связывавшимися с NC-Fc. Гибридомы, прошедшие первичный скрининг подвергали вторичному скринингу, включавшему связывание с клетками BaF3/FGFR2b и BaF3/FGFR2c при FACS, блокаду связывания с FGF-лигандами и уничтожение клеток. Таким образом были отобраны несколько положительных клонов, включая клон, названный Ab 21 (антитело 21). Изотип моноклональных антител, продуцируемых этими отобранными клонами, определяли с использованием изотип-специфичных антител.

Пример 3. Гуманизация антитела 21

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (VH, VL) антитела 21 определяли с применением стандартной технологии RACE. Из выбранной гибридомной клеточной линии выделяли общую РНК. Полноразмерную первую цепь кДНК, содержащую 5'-концы, получали с использованием набора SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Пало-Альто, штат Калифорния) или набора GeneRacer Kit (Invitrogen), следуя инструкциям изготовителя, и амплифицировали посредством ПЦР. Проводили выделение и очистку продуктов ПЦР с последующим ТА-клонированием и секвенированием.

Затем получали химерное антитело 21с (Ab 21с), перенося V_H и V_L мышиного антитела 21 (Ab 21) на человеческую Fc, и гуманизированное антитело 21 разрабатывали, конструировали и экспрессировали с применением стандартных молекулярно-биологических методов. Кратко, CDR мышиного антитела 21 переносили на человеческую акцепторную каркасную область. Затем в тех положениях каркасных областей, которые, согласно компьютерному моделированию, существенным образом взаимодействуют с CDR, аминокислотные остатки человеческих каркасных областей, включая M69L, А93Т и R94S, заменяли на аминокислотные остатки мышиного антитела, без замен в легкой цепи, нумерация Kabat. Так было получено гуманизированное антитело 21, обозначенное как антитело hu21-21 (Abhu21-21). Кроме того, проводили замену аминокислот Asn-Gly (NG) в CDR2 тяжелой цепи антитела hu21-21 аминокислотами Asn-Arg (NR) с получением варианта, обозначенного антитело hu21-26 (Ab hu21-26). Последовательности CDR-участков тяжелой цепи и/или легкой цепи и последовательности вариабельных областей антитела 21, антитела 21 с, антитела hu21-21 и антитела hu21-26 показаны в Таблицах 1-3, описанных выше.

Аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи полноразмерного зрелого антитела hu21-26 с человеческим IgG1 показаны на Фиг. 1.

Пример 4. Афукозилирование антитела hu21-26 и анализ гликанов

Для получения афукозилированного варианта антитела hu21-26 (обозначенного как «afhu21-26», где префикс «af» является сокращением от «афукозилированное») в качестве клеток-хозяев использовали клетки CHOK1 с нокаутом 1,6-фукозилтрансферазы (FUT8 -/-) (Wuxi Biologies, Китай, Шанхай), продуцирующие антитела без фукозы (то есть афукозилированные антитела). Вектором экспрессии, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC) моноклонального антитела Ab hu21-26 с константной Fc человеческого IgGl, транзиторно трансфицировали FUT8-/- CHOK1 для продукции афукозилированного антитела.

Afhu21-26 очищали посредством SEC-HPLC с белком А и диализа с заменой буфера на буфер для лекарственной формы и хранили при -80°С.

Анализ гликанов полученного afhu21-26 проводили с применением LC-MS. Кратко, 10 мкг антитела в 10 мкл расщепляли с использованием 1 мкл фермента IdeS (Genovis AB), 12 единиц/мкл, на протяжении 1 ч при 37°С, с последующим последовательным добавлением 37,5 мкл 8 М гуанидингидрохлорида, 2,5 мкл 1 М трис-HCl и 1 мкл 1 М DTT, после чего проводили перемешивание и инкубацию на протяжении 30 мин при 10-30°С. Полностью восстановленное антитело выделяли методом HPLC с обращенной фазой. Затем анализировали гликановый профиль с применением LS-MS. Определяли массу каждого пика и использовали ее для идентификации каждого гликана, и полученные результаты показаны в Таблице 4 ниже.

Таблица 4. Массы гликановых пиков

Представленные результаты демонстрируют, что G0F, G1F, G2F не поддавались выявлению и антитело было афукозилировано почти на 100%, как показано в Таблице 5.

Таблица 5. Гликановый профиль afhu21-26

Пример 5. Характеристики связывания антител

Связывание антител с человеческим антигеном FGFR2b или человеческим антигеном FGFR1b определяли с применением поверхностного плазмонного резонанса (Biacore). Кратко, сенсорный чип СМ5 (GE Healthcare Life Sciences) сначала активировали 4 мин инъекцией 1:1 свежей смеси 50 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS): 200 мМ ECD-домена. Затем на активированном сенсорном чипе СМ5 иммобилизовали hFGFR2b-Fc или hFGFR1b-Fc с использованием набора Amine Coupling Kit (GE Healthcare Life Sciences) и 1 M этаноламина в качестве блокирующего реагента. Проводили захват приблизительно 20-30 единиц ответа (RU, 1 RU соответствует связыванию 1 пг белка на квадратный мм) антигенного белка.

Антитела разводили в аналитическом буфере HBS-EP+ (GE Healthcare Life Sciences) (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% сурфактанта Р20, рН 7,4) и вводили в серийном разведении (0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 150, 200 нМ), и каждый аналитический цикл включал восстановление поверхности сенсорного чипа СМ5. Константу ассоциации и константу диссоциации рассчитывали с применением аналитического программного обеспечения Biacore Т200 (версии 1.0). Как показано на Фиг. 2, антитело 21с (химерное) и его гуманизированные варианты антитело hu21-21 и антитело hu21-26 продемонстрировали высокую аффинность связывания с человеческим FGFR2b со значением K_D в диапазоне 220-489 пМ, лучше, чем у антитела FPA144, использованного в качестве положительного контроля. Кроме того, антитело 21 с отличается от антитела FPA144 связыванием с FGFR1b. Антитело 21 с активно связывается с FGFR1b со значением K_D 3,69 нМ, по сравнению с очень слабым связыванием антитела FPA144 с человеческим FGFR1b со значением K_D 225 нМ. Аналогично антителу 21 с, как антитело hu21-21, так и антитело hu21-26 также демонстрировали специфичное связывание с человеческим FGFR1b (данные не показаны).

Для подтверждения того, что выбранные антитела могут связываться с эндогенными формами FGFR2b на клеточной мембране, проводили проточную цитометрию с использованием клеток KATOIII, экспрессирующих FGFR2b. Подготавливали все антитела в PBS-буфере с 10% ослиной сыворотки (Jackson Immunogen #017-000-121). 500000 клеток KATOIII инкубировали со 100 мкл различных концентраций антитела против FGFR2b на протяжении 60 мин при 4°С. Клетки промывали два раза и инкубировали в 100 мкл 10 мкг/мл 2-го антитела IgG с Alexa488 (Jackson Immunogen #709546149) на протяжении 30 минут при 4°С в темноте. Клетки промывали три раза, ресуспендировали промывочным буфером и анализировали на проточном питометре. Данные FACS ясно продемонстрировали, что антитело 21 с активно связывается с клетками KATOIII со значением ЕС₅₀ приблизительно 8 нМ, как показано на Фиг. 3. Аналогично антителу 21 с, как антитело hu21-21, так и антитело hu21-26 также демонстрировали специфичное связывание с клетками KATOIII (данные не показаны).

Межвидовое связывание антитела 21 с с рекомбинантными слитыми белками FGFR2b яванского макака, крысиного/мышиного и человеческого FGFR2b и Fc анализировали с применением ELISA. Кратко, на 96-луночный планшет для ELISA сорбировали приблизительно 100 мкл на лунку 0,1 мкг/мл рекомбинантного белка человеческого FGFR2b с Fc, рекомбинантного белка крысиного/мышиного FGFR2b с Fc или рекомбинантного белка FGFR2b яванского макака с Fc в PBS в течение ночи. Затем планшет блокировали с использованием 2%-го BSA в PBS с 0,05% Tween 20, инкубировали с образцами антител на протяжении 60 мин при комнатной температуре и затем промывали два раза в 1x TBST (Cell Signaling Technology, #9997) с последующей инкубацией с конъюгатом противочеловеческого IgG с HRP (пероксидаза хрена) на протяжении 60 мин при комнатной температуре. Активность HRP выявляли тетраметилбензидиновым субстратом (Cell Signaling Technology, #7004) и реакцию останавливали останавливающим раствором (Cell Signaling Technology, #7002). Планшет прочитывали при 450 нм. Как показано на Фиг. 4, значимых различий ЕС₅₀ при связывании антитела 21с с FGFR2b различных видов нет.Наиболее высокой является аффинность связывания антитела 21 с с мышиным/крысиным FGFR2b, за ней следует аффинность связывания с человеческим FGFR2b, а после нее - с FGFR2b яванского макака. Аналогично антителу 21с, как антитело hu21-21, так и антитело hu21-26 также демонстрировали специфичное связывание с FGFR2b различных видов (данные не показаны).

Сходным образом, специфичность связывания антитела 21 с различными представителями семейства FGFR, FGFR1b, FGFR3c, FGFR3b, FGFR4, характеризовали с применением ELISA. Полученные данные показаны на Фиг. 5. По результатам ELISA-анализ а, антитело 21 специфично связывается с FGFR2b и FGFR1b, что согласуется с данными, показанными на Фиг. 2, и не связывается с другими представителями семейства FGFR. Аналогично антителу 21с, как антитело hu21-21, так и антитело hu21-26 также демонстрировали специфичное связывание с FGFR2b и FGFR1b, но не демонстрировали специфичного связывания с другими представителями семейства FGFR в ELIS А-анализе (данные не показаны).

Пример 6. Ингибирующая активность in vitro

Ингибирующую активность антитела на лиганд-индуцированную пролиферацию клеток анализировали в FGFR2b-модифицированных клонах клеток Ba/F3 (Ba/F3-FGFR2b). Клетки высевали в 96-луночные планшеты, 30000 клеток на лунку, в среде RPMI1640, содержавшей 10%-ю фетальную бычью сыворотку и рекомбинантный человеческий белок FGF7 (10 нг/мл) в присутствии гепарина (10 мкг/мл). После инкубации в течение ночи в аналитические планшеты добавляли антитело против FGFR2b в различных концентрациях и проводили инкубацию на протяжении еще 72 часов. После 72 часов инкубации в каждую лунку добавляли 20 мкл CellTiter Aqueous One Solution Reagent и планшеты инкубировали при комнатной температуре на протяжении 2 часов. Для измерения оптической плотности в каждую лунку добавляли по 25 мкл 10%-го SDS для остановки реакции. Оптическую плотность измеряли при 490 нм и 650 нм (эталонная длина волны) на Tecan Spark 20М. Антитело 21 с может сильно ингибировать EGF7-индуцированную пролиферацию клеток BaF3 с GI₅₀ приблизительно 10 нМ. Эти данные по ингибирующей активности антитела 21с обрабатывали с применением Prism, и построенный график показан на Фиг. 6. Аналогично антителу 21 с, как антитело hu21-21, так и антитело hu21-26 также демонстрировали сильное ингибирование FGF7-индуцированной пролиферации клеток BaF3 (данные не показаны).

Исследовали ингибирование сигнального пути FGFR2 антителом. Клетки SNU16 выращивали в среде RPMI с 10% FBS, затем высевали в количестве 30000 на лунку и подвергали голоданию в бессывороточной RPMI/0,1%BSA в течение ночи. Затем клетки собирали соскабливанием и промывали один раз в холодном PBS и затем лизировали в 2х лизирующем буфере с SDS (100 мМ трис, рН 6,8, 4% SDS, 20% глицерина и 1х ингибиторы протеаз и фосфатаз (Pierce)). Затем лизаты кипятили на протяжении 10 мин при 100°С.Концентрации белков определяли с использованием набора для ВСА-анализа белка (Pierce), равные количества белков вносили в гель для SDS-PAGE, затем с использованием iBolt (mvitrogen) белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые затем анализировали вестерн-блоттингом на предмет фосфорилирования FGFR2 и следующего за ним гена ERK. Как показано на Фиг. 7, обработка клеток SNU16 антителом 21 с приводит к дозозависимой понижающей регуляции фосфорилирования FGFR2 и фосфорилирования ERK. Аналогично антителу 21с, как антитело hu21-21, так и антитело hu21-26 также демонстрировали понижающую регуляцию фосфорилирования FGFR2 и фосфорилирования ERK (данные не показаны).

Интернализацию антитела выявляли конфокальной микроскопией. Кратко, в день конфокальной микроскопии клетки собирали с использованием раствора для неферментативной диссоциации и подготавливали по 5×10⁵ клеток для каждой пробирки. Клетки промывали и ре суспендировали с использованием 100 мкл блокирующего буфера (10%-я ослиная сыворотка) на протяжении 30 мин при 4°С.Затем клетки промывали два раза и инкубировали со 100 мкл 10 мкг/мл антитела 21 при 4°С на протяжении 60 мин. Клетки промывали и разделяли на несколько аликвот во флаконах, часть из которых держали при 4°С, а часть - при 37°С. В указанной временной точке брали один флакон, который держали при 4°С, и один флакон, который держали при 37°С. После промывки и ресуспендирования клетки фиксировали и затем блокировали с использованием 100 мкл 10%-й ослиной сыворотки перед промывкой и инкубацией с 10 мкг/мл ослиного противочеловеческого IgG с Alexa488 при 4°С на протяжении 30 минут в темноте. Клетки промывали и ресуспендировали и 5 мкл клеточной суспензии распределяли по предметному стеклу (для получения монослоя), высушивали на горячей поверхности при 55°С и обрабатывали с использованием 5 мкл 1×DAPI перед тем, как накрыть покровным стеклом. Затем получали конфокальное изображение. Как показано на Фиг. 8, при 4°С, когда интернализация невозможна, антитело 21 наблюдали только на поверхности клеток. Через 2 ч или 4 ч при 37°С, что допускает интернализацию, антитело было обнаружено внутри клеток (отмечено стрелкой), что указывает на интернализацию антитела. Аналогично антителу 21, антитело 21 с, антитело hu21-21 и антитело hu21-26 также были подвержены внутриклеточной интернализации (данные не показаны).

Были проведены анализы для определения ADCC-активности антител in vitro. Анализ ADCC проводили с использованием первичных NK-клеток, выделенных из человеческих МКПК (AllCells, CAT#PB0004F) с использованием набора EasySep™ Human NK Cell Isolation Kit (Stemcell, #17955), в качестве эффекторных клеток при отношении эффекторных клеток к клеткам-мишеням (Е/Т) 8:1. Человеческие МКПК размораживали в RPMI1640, содержавшей 10%FBS с HEPES, 10 мМ, и пируватом натрия, 1 мМ, за сутки до проведения FACS-анализа. Клетки-мишени KATOIII окрашивали клеточным маркером CFSE-FITC (Invitrogen, #С34554) на протяжении 30 минут и затем инкубировали на протяжении 5 часов при 37°С в присутствии эффекторов и антитела. Затем клетки окрашивали маркером жизнеспособности Viability Stain-APC-Cy7 (BD, #565388). Цитотоксический лизис определяли посредством FACS, группируя клетки, положительно окрашенные как CFSE, так и маркером жизнеспособности. Данные показаны на Фиг. 9. Afhu21-26 показало значимо лучшую ADCC-активность по сравнению с антителом 21 с, продемонстрировав, что афукозилирование улучшало ADCC-активность антитела 21 с как по максимальному проценту лизиса, так и по ЕС₅₀. Сходные результаты получены также для afhu21-21.

Пример 7. Противоопухолевая активность антител in vivo в опухолевых моделях на мышах

Иммунодефицитных бестимусных мышей получали от VitaRiver. Все исследования на животных были одобрены IACUC и проводились в соответствии с внутренними и местными нормативными требованиями.

Ксенотрансплантационные мышиные модели рака желудка человека SNU16, имеющие происхождение от клеточной линии (CDX), получали сначала культивированием клеток in vitro с последующим подкожным введением клеток мышам в дорс о латеральные области в количестве 1×10⁷ клеток в 200 мкл смеси с 50%-м Matrigel на одну мышь и, когда ксенотрансплантированные опухоли достигали размера 300-500 мм³, их иссекали, разрезали на фрагменты одинакового размера и подкожно (п/к) имплантировали новой группе бестимусных мышей. Ксенотрансплантационные модели рака легкого человека LC038, полученного от пациента (PDX), у мышей получали сходным образом. Кратко, хирургически удаленные ткани от пациентов (F0) разрезали на фрагменты одинакового размера и подкожно имплантировали иммунодефицитным бестимусным мышам (мыши F1) в течение 2 часов после хирургического вмешательства. Когда ксенотрансплантированные опухоли достигали размера 400-600 мм³, их иссекали, разрезали на фрагменты и имплантировали бестимусным мышам для пассажа, которые представляли собой F2, и так далее.

Опухолевые узлы измеряли по двум осям с использованием штангенциркулей и объем опухоли рассчитывали по формуле, где объем опухоли равен произведению длины на квадрат ширины, умноженному на 0,52. Когда объем опухоли достигал 150-250 мм³, мышей с опухолями рандомизировали в группы введения. Затем мышам вводили либо изотипический контроль (то есть IgG1), либо исследуемые антитела (то есть FPA144, afhu21-26) один/два раза в неделю, начиная с суток, следовавших за рандомизацией. Объем опухоли и массу тела мышей измеряли два раза в неделю и записывали необработанные данные. Ингибирование роста опухоли от начала лечения оценивали, сравнивая среднее изменение объема опухоли в контрольных группах и группах введения. Расчет был основан на геометрическом или арифметическом среднем относительного объема опухоли (RTV) в каждой группе. RTV рассчитывали как отношение объема опухоли к суткам введения с исходным объемом опухоли.

Кривая роста опухоли in vivo для клеток SNU16 и клеток LC038 (PDX) при введении afhu21-26 или антитела FPA144 была показана на Фиг. 10А и 10В, соответственно. В обеих моделях afhu21-26 демонстрирует лучшую противоопухолевую активность по сравнению с антителом FPA144. Сходные результаты получены также для afhu21-21.

Пример 8. Получение конъюгатов антител с лекарственными средствами (ADC) и их свойства

3 мл антитела 21с, 10 мг/мл в PBS, добавляли к свежему ТСЕР при молярном отношении ТСЕР/Ab 2,2. После инкубации на водяной бане при 37°С на протяжении 120 мин к раствору антитела добавляли 1/10 (об./об.) М,М-диметилацетамид (DMA). Затем к раствору антитела добавляли 10 мМ mc-vc-MMAE (mc - малеимидокапроил; vc - валинцитруллиновый линкер) в DMA при молярном отношении ММАЕ к антителу 6. Раствор держали при комнатной температуре в течение ночи и затем уравновешивали колонку PD-10 с использованием 25 мл 1×PBS. Затем конъюгационную смесь загружали в колонку PD-10 для очистки ADC. Концентрацию ADC измеряли в Nanodrop. SEC-HPLC и HIC-HPLC применяли в рамках контроля качества для анализа агрегации ADC и отношения лекарственного средства к антителу (DAR), соответственно. Среднее DAR рассчитывали стандартным методом. ADC-конъюгаты 21c-MMAF и afhu21-26-MMAE получали сходным образом. HIC-HPLC-гистограмма afhu21-26-MMAE показана на Фиг. 11. Расчетное DAR составляет 3,76, что близко к DAR утвержденного ADC-лекарственного средства брентуксимаб ведотин.

Противоопухолевую активность ADC оценивали в различных ксенотрансплантационных моделях опухолей, таких как PDX-модель LC038 и ксенотрансплантационная модель SNU16. Введение afHu21-26-MMAE, 21c-MMAF и 21с-ММАЕ приводило к регрессии опухоли в обеих опухолевых моделях (Фиг. 12А и 12В).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Dizal (Jiangsu) Pharmaceutical Co., Ltd.

<120> НОВЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ FGFR2B

<130> 070542-8006WO03

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> HCDR1

<222> (1)..(5)

<400> 1

Asn Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> LCDR1

<222> (1)..(10)

<400> 2

Ser Ala Ser Ser Gly Leu Ser Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> HCDR2

<222> (1)..(17)

<400> 3

Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> LCDR2

<222> (1)..(7)

<400> 4

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> HCDR2

<222> (1)..(4)

<400> 5

Arg Gly Asp Tyr

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> LCDR3

<222> (1)..(9)

<400> 6

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> УСТРАНЕНИЕ ГОРЯЧЕЙ ТОЧКИ NG

<220>

<221> MODIFIED HCDR2

<222> (1)..(17)

<400> 7

Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Arg Asp Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ТЯЖЕЛОЙ

ЦЕПИ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА 21-26

<220>

<221> Hu21-26 VH

<222> (1)..(113)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Arg Asp Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 9

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ ВАРИАБЕЛЬНУЮ ОБЛАСТЬ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ

ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА 21-26

<400> 9

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atctaccccg agaacaggga catcaactac 180

aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggagctga gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actactgcac cagcaggggc 300

gactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgagcagc 339

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ЛЕГКОЙ

ЦЕПИ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ 21-26/21-21

<400> 10

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Leu Ser Tyr Met

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ ВАРИАБЕЛЬНУЮ ОБЛАСТЬ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ

ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ 21-26/21-21

<400> 11

gccatccagc tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca gcgccagcag cggcctgagc tacatgagct ggtaccagca gaagcccggc 120

aaggccccca agctgctgat ctacgacacc agcaacctgg ccagcggcgt gcccagcagg 180

ttcagcggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct gcagcccgag 240

gacttcgcca cctactactg ccagcagtgg agcagctacc cctacacctt cggccagggc 300

accaagctgg agatcaag 318

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ТЯЖЕЛОЙ

ЦЕПИ ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА 21

<400> 12

Glu Val Gln Leu His Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 13

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ ВАРИАБЕЛЬНУЮ ОБЛАСТЬ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ

ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА 21

<400> 13

gaggttcagc tccaccagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc aactactgga tgcactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gataggggct atttatcctg aaaatggtga tattaactac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240

atggacctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagtcggggg 300

gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ЛЕГКОЙ

ЦЕПИ ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА 21

<400> 14

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Leu Ser Tyr Met

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ ВАРИАБЕЛЬНУЮ ОБЛАСТЬ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ

ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА 21

<400> 15

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aggtttaagt tacatgtcct ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgtacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaa 318

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ТЯЖЕЛОЙ

ЦЕПИ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА 21-21

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 17

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ ВАРИАБЕЛЬНУЮ ОБЛАСТЬ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ

ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА 21-21

<400> 17

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atctaccccg agaacggcga catcaactac 180

aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggagctga gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actactgcac cagcaggggc 300

gactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgagcagc 339

<210> 18

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ГУМАНИЗИРОВАННОГО

АНТИТЕЛА 21-26

<400> 18

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Leu Ser Tyr Met

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 443

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ГУМАНИЗИРОВАННОГО

АНТИТЕЛА 21-26

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Arg Asp Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

340 345 350

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным специфично связываться как с рецептором фактора роста фибробластов 2b (FGFR2b), так и с FGFR1b, способу его получения, а также к конъюгату и композиции, их содержащим. Также раскрыты выделенный полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело или его фрагмент, а также клетка-хозяин и вектор, его содержащие. Изобретение также относится к способу диагностики заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, способу выявления присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце, а также к способу прогнозирования заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, предусматривающим использование вышеуказанного антитела или его фрагмента. Изобретение эффективно для лечения заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b. 13 н. и 28 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфично связываться как с рецептором фактора роста фибробластов 2b (FGFR2b), так и с FGFR1b, содержащие:

а) вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую SEQ ID NO: 1, 3 и 5, и вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую SEQ ID NO: 2, 4 и 6; или

б) вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую SEQ ID NO: 1, 7 и 5, и вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую SEQ ID NO: 2, 4 и 6.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, не обладающие поддающейся определению аффинностью связывания с FGFR2c.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1, 2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 8, 12 или 16 или последовательность, гомологичную им, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 8, 12 или 16.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10 или 14 или последовательность, гомологичную им, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 10 или 14.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, содержащие:

а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10;

б) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 14;

в) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, содержащие одну или более чем одну замену или модификацию аминокислотного остатка, но сохраняющие специфичную аффинность связывания с FGFR2b и/или с FGFR1b, где указанные замены или модификации присутствуют в одной или более чем одной последовательности V_H или V_L, но вне каких-либо последовательностей CDR.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, содержащие константную область иммуноглобулина, возможно, константную область человеческого иммуноглобулина или, возможно, константную область человеческого иммуноглобулина G (IgG).

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где константная область содержит одну или более чем одну модификацию, которые:

а) приводят к появлению или удалению сайта гликозилирования;

б) приводят к появлению свободного цистеинового остатка;

в) усиливают связывание с активирующим Fc-рецептором; и/или

г) усиливают антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, с модифицированным гликозилированием, причем указанное антитело предпочтительно демонстрирует усиленную ADCC-активность по сравнению с его аналогом с немодифицированным гликозилированием.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 9, где антитело является афукозилированным, предпочтительно не содержащим фукозу в Asn297.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, где усиленная ADCC характеризуется усилением лизиса клеток, экспрессирующих FGFR2b, по меньшей мере на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70% или 75%.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, где антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, где указанный антигенсвязывающий фрагмент выбран из камелизированного однодоменного антитела, диатела, scFv, димера scFv, BsFv, dsFv, (dsFv)₂, Fv-фрагмента, Fab, Fab', F(ab')₂, ds-диатела, нанотела, однодоменного антитела или бивалентного однодоменного антитела.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-13, способные специфично связываться с человеческим FGFR2b при значении K_D не более 1×10^-9 М, как измерено посредством Biacore, и/или способные специфично связываться с человеческим FGFR1b при значении K_D не более 5×10^-9 М, как измерено посредством Biacore.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14, способные специфично связываться с человеческим FGFR2b, экспрессированным на поверхности клетки, с EC₅₀ не более 10 нМ, как измерено проточной цитометрией.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-15, способные специфично связываться с человеческим FGFR2b, FGFR2b яванского макака, крысиным FGFR2b и мышиным FGFR2b.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-16, способные специфично связываться с человеческим FGFR2b, экспрессированным на поверхности клетки, и ингибировать пролиферацию указанной клетки с 50%-ной ростоингибирующей концентрацией (GI₅₀) не более 15 нМ, как измерено колориметрическим анализом с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметокси-фенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолием.

18. Конъюгат, способный специфично связываться как с FGFR2b, так и с FGFR1b, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-17, связанные с одной или более чем одной конъюгатной группировкой.

19. Конъюгат по п. 18, где конъюгатная группировка включает терапевтический агент, предпочтительно включающий цитотоксический агент, радиоактивный изотоп, выявляемую метку, группировку, модифицирующую фармакокинетику, или группировку для очистки.

20. Конъюгат по п. 18, где конъюгатная группировка ковалентно присоединена напрямую или через линкер.

21. Конъюгат по п. 20, где линкер представляет собой гидразиновый линкер, дисульфидный линкер, бифункциональный линкер, дипептидный линкер, глюкуронидный линкер, тиоэфирный линкер, возможно, линкер представляет собой лизосомно расщепляемый дипептид, например валин-цитруллин (vc).

22. Конъюгат по любому из пп. 18-21, где конъюгатная группировка случайным образом присоединена к поверхностному аминокислотному остатку конкретного типа, возможно, конкретный остаток представляет собой цистеиновый остаток или лизиновый остаток.

23. Конъюгат по любому из пп. 18-22, где конъюгатная группировка присоединена к конкретно определенным сайтам молекул антител через природные аминокислоты, не встречающуюся в природе аминокислоту, короткие пептидные метки или гликаны Asn297.

24. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-17.

25. Выделенный полинуклеотид по п. 24, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 и последовательности, гомологичной им, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 или 17, причем гомологичная последовательность предпочтительно кодирует такой же белок, как белок, кодируемый SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 или 17.

26. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 24 или 25.

27. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-17, содержащая вектор экспрессии по п. 26.

28. Клетка-хозяин по п. 27, способная продуцировать антитело или антигенсвязывающий фрагмент с модифицированным гликозилированием.

29. Клетка-хозяин по п. 27, характеризующаяся недостаточностью функциональной альфа-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8), сверхэкспрессией гетерологичной β-1,4-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), экспрессией прокариотической GDP-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулозоредуктазы или недостаточностью функционального GDP-фукозного переносчика (GFT).

30. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-17, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 27-29 в условиях, при которых происходит экспрессия вектора экспрессии по п. 26.

31. Способ по п. 30, дополнительно включающий очистку антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.

32. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-17 и фармацевтически приемлемый носитель.

33. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-17 или фармацевтической композиции по п. 32.

34. Способ по п. 33, где заболевание или состояние представляет собой рак и, возможно, рак характеризуется экспрессией или сверхэкспрессией FGFR2b и/или FGFR1b, и предпочтительно рак представляет собой рак яичника, эндометриальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак толстой кишки, рак предстательной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак пищевода, печеночноклеточный рак, почечноклеточный рак, рак головы и шеи, мезотелиому, меланому, саркомы и опухоли головного мозга.

35. Способ по п. 33 или 34, где введение проводят посредством перорального, интраназального, внутривенного, подкожного, сублингвального или внутримышечного введения.

36. Способ по любому из пп. 33-35, где субъект представляет собой человека.

37. Способ выявления присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце, включающий приведение образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-17 и определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце.

38. Способ диагностики заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающий:

а) приведение образца, полученного от субъекта, в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-17;

б) определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце;

в) соотнесение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b с наличием или статусом заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта.

39. Способ прогнозирования заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, включающий:

а) приведение образца, полученного от субъекта, в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-17;

б) определение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b в образце;

в) соотнесение присутствия или количества FGFR2b и/или FGFR1b с возможным ответом субъекта на антагонист FGFR2b и/или FGFR1b.

40. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-17 в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b, у субъекта, нуждающегося в этом.

41. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-17 в изготовлении диагностического реагента для выявления заболевания или состояния, связанного с FGFR2b и/или FGFR1b.