ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/225 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения лактобактерий из материала от людей при исследовании на дисбактериоз кишечника, влагалища и других отделов организма человека, а также для определения физиологической активности лактобактерий по их кислотообразующей способности и наличия каталазоподобных ферментов.

При диагностике дисбактериоза кишечника, влагалища, полости рта важно бывает не только знать количество лактобактерий, присутствующих в составе микрофлоры того или другого отдела, но иметь представление об их колонизирующей способности, складывающейся из ряда свойств микроорганизмов, в частности:
- их кислотообразующей способности, которая в известной степени характеризует их антагонистическую активность;
- возможности синтезировать ряд ферментов, способствующих защите микроорганизмов от фагоцитоза (каталаза, супероксиддисмутаза и т.д.).

Известны питательные среды для выделения лактобактерий, состоящие их томатного, капустного, морковного отваров с добавлением пептона, L-цистина и др. Эти среды многокомпонентные, содержат трудно поддающиеся стандартизации ингредиенты, готовятся на основе пищевых продуктов. Они достаточно сложны в приготовлении, не всегда дают воспроизводимые результаты.

Известна питательная среда МРС-5 (среда Rogosa) (ФС 42-252 ВС-89, Лактобактерин сухой, 01.04.1989), имеющая следующий состав (г/л):
Сернокислый марганец - 0,05±0,0005
Цистин солянокислый - 0,2±0,0005
Сернокислый магний - 0,2±0,0005
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,0±0,01
Пептон - 10±0,5
Глюкоза - 20±0,5
Твин-80 - (1,0±0,02)мл
Дрожжевой аутолизат - 50,0±1,5 мл
Агар-агар - 15,0±0,1
Вода дистиллированная - 500 мл
Гидролизат молока - 500 мл
Приведенная питательная среда также многокомпонентная, содержит гидролизованное молоко по Богданову, которое сложно по технологии приготовления, имеет нестандартизированные ростовые качества, готовится из дефицитного пищевого продукта и не позволяет судить о кислотообразующей способности лактобактерий. Для определения образования каталазоподобных ферментов (псевдокаталазы и пр.) в МРС необходимо дополнительно добавить в среду гемин, прогретую кровь и другие компоненты, стимулирующие выработку данных ферментов, что не только осложняет получение питательной среды, но и делает ее более дорогостоящей.

Целью настоящего изобретения является создание новой дешевой питательной среды для выделения лактобактерий и изучения их свойств кислотообразования (антагонистической способности) и продукции каталазоподобных ферментов.

Настоящая цель достигается тем, что в качестве питательной основы используют гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы (молозивного творога) из отходов производства лактоглобулина. Для определения кислотообразующей (антагонистической) способности лактобактерий в среду входит стерильный мел. Предлагаемая питательная среда состоит из следующих ингредиентов (в соотношении в г/литр готовой среды):
Сернокислый марганец - 0,049 - 0,05
Сернокислый магний - 0,19 - 0,2
L-цистин солянокислый - 0,095 - 0,1
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 1,95-0,2
Пептон - 4,9 - 5,0
Глюкоза - 19,8 - 20,0
Агар-агар - 15,0±0,1
Стерильный мел - 9,9 - 10,0
Гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов лактоглобулина - Остальное
Молозивный творог является отходом при производстве лечебного препарата лактоглобулина в процессе получения лактосыворотки из молозива коров. "Из 35 литров молозива получают (24,5±1) л лактосыворотки, при этом остается (9,3±2) кг молозивного творога, содержащего до (1,5±0,5) л сыворотки" (производственный регламент 328-91) "Лактоглобулин противоколипротейный коровий сухой для перорального применения). Молозивный творог должен иметь соотношение казеин-сыворотка не менее 7:3, рН не ниже 4,1±0,2.

Молозивный творог помещают в 5 литровую бутыль, разбавляют дистиллированной водой из расчета 100 грамм массы на 1 литр дистиллированной воды, хорошо перемешивают, доводят рН 25% водным раствором аммиака до рН 8,0, добавляют панкреатин (МРТУ 425946-84) в количестве 0,1 г на литр смеси, вновь хорошо перемешивают и помещают смесь в термостат при температуре (45±1)^oС на 3±0,5 часа. В течение инкубации каждый час смесь перемешивают, доводя рН до 8,0 с помощью 25% водного раствора аммиака. По истечении 3-х часов гидролиз останавливают, изменяя рН смеси до значений 4,3 с помощью уксусной кислоты. Смесь прогревают до закипания и выдерживают при такой температуре 3-5 минут, затем охлаждают и фильтруют через миткалевый фильтр. Полученный гидролизат стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 30 минут. Стерильный гидролизат годен к употреблению в течение 3-х месяцев.

Пример 1.

Среда с максимальным содержанием ингредиентов. К 0,5 литра гидролизата последовательно добавляют глюкозы 25 г, пептона 5,5 г, L-цистина солянокислого 0,15 г, сернокислого марганца 0,055 г, сернокислого магния 0,25 г, калия двузамещенного фосфорнокислого 3-х водного 2,2 г, агар-агара 15,5 г, стерильного мела 15,0 г. Объем среды доводят до 1,0 л гидролизатом. После внесения всех ингредиентов измеряют рН, доводят до значения 7,4-7,6 разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 15 мин.

Пример 2.

Среда с оптимальным содержанием компонентов. К 0,5 литра гидролизата последовательно добавляют глюкозы 20 г, пептона 5 г, L-цистина солянокислого 0,1 г, сернокислого марганца 0,05 г, сернокислого магния 0,2 г, калия двузамещенного фосфорнокислого 3-х водного 2,0 г, агар-агара 15,0 г, стерильного мела 10,0 г. Объем среды доводят до 1,0 л гидролизатом.

После внесения всех ингредиентов измеряют рН, доводят до значения 7,4-7,6 разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 15 мин.

Пример 3.

Среда с минимальным содержанием ингредиентов. К 0,5 литра гидролизата последовательно добавляют глюкозы 15 г, пептона 4,5 г, L-цистина солянокислого 0,05 г, сернокислого марганца 0,05 г, сернокислого магния 0,15 г, калия двузамещенного фосфорнокислого 3-х водного 1,9 г, агар-агара 14,5 г, стерильного мела 9,0 г. Объем среды доводят до 1,0 л гидролизатом. После внесения всех ингредиентов измеряют рН, доводят до значения 7,4-7,6 разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 15 мин.

Пример 4.

Ростовые свойства среды определяют по отношению к типовому штамму лактобактерий Lactobacterium plantarum 8P-A3 по сравнению со средой МРС-5 - прототип. Сравнительные данные ростовых свойств трех вариантов предлагаемой среды изложены в таблице 1.

Приведенные в таблице результаты свидетельствуют, что на предлагаемой среде лактобактерий типового штамма Lactobacterium plantarum 8P-A3 растут лучше, чем на типовой среде МРС-5.

Пример 5.

Использование среды для выращивания лактобактерий. Среда с гидролизатом использована для обеспечения роста разных видов лактобактерий (Lactobacterium plantarum, L.fermenti, L.casei, L.acidophilus). Полученные результаты изложены в таблице 2.

Как видно из представленных данных, полученная среда с гидролизатом молозивного творога обеспечивает рост разных видов лактобактерий в титрах, несколько превышающих количество их на среде МРС-5.

Пример 6.

Возможность практического использования среды для диагностики дисбактериозов кишечника у людей.

Изучено использование среды с гидролизатом молозивного творога для выделения лактобактерий из фекалий людей с дисбактериозом. Производили параллельный посев фекалий в разведениях от 10⁴ до 10⁷ на стандартную среду МРС-5 и предлагаемую среду на основе гидролизата молозивного творога. Результаты представлены в таблице 3.

Приведенные результаты указывают, что использование среды с гидролизатом молозивного творога позволяет выявить лактобактерии в фекалиях людей с дисбактериозом в более высоких титрах, чем среда МРС-5.

Пример 7.

Изучение антагонистической активности лактобактерий.

Сопоставляли степень антагонистической активности лактобактерий и величину зон просветления вокруг колоний на среде с гидролизатом молозивного творога на примере производственного штамма Lactobacterium plantarum 8P-A3.

Антагонистическую активность 100 клонов производственного штамма L. plantarum 8P-A3 определяли по отношению к тест-кульутрам патогенных (Shigella flexneri-2 культуры, Shigella sonnei-1 культура) и условно-патогенных бактерий (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Escherichiae coli, Staphilococcus aureus) методом отсроченного антагонизма, изложенному в ФС 42-252 ВС-89 "Лактобактерин сухой". Клоны штамма L.plantarum 8P-A3 получали путем рассева культуры производственного штамма лактобактерий L.plantarum, выращенной в течение (47±1) часов на среде МРС-1 при температуре (37,2±0,2)^oС. Степень активности клонов определяли по величине зоны задержки роста тест-культур. При этом высокоактивными считали клоны, дающие зоны задержки роста более 21 мм, среднеактивными - 10-20 мм, слабо активными - менее 10 мм. Результаты сопоставления степени антагонистической активности изученных клонов и их кислотообразующей способности на предлагаемой среде приведены в таблице 4.

Представленные в таблице 4 результаты указывают на наличие тесной взаимозависимости величины зон просветления на предлагаемой среде и антагонистической активности культур лактобактерий.

Пример 8.

Изучение кислотообразующей и антагонистической активности культур лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом.

Изучена кислотообразующая активность 142 культур лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом, а также их антагонистическая активность по отношению к тест-культурам патогенных (Shigella flexneri, Shigella sonnei) и условно-патогенных бактерий (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Escherichiae coli, Staphilococcus aureus) методом отсроченного антагонизма. Данные приведены в таблице 5.

Приведенные в таблице 5 результаты указывают на полное совпадение данных о величине зон просветления вокруг колоний лактобактерий, выросших на среде с основой из гидролизата молозивного творога и их антагонистической активности.

Пример 9.

Изучение наличия каталазоподобных ферментов у лактобактерий.

Определяли наличие каталазоподобных ферментов у лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника (100 штаммов) и от практически здоровых людей (127 штаммов). Учет реакции проводили с использованием 6% раствора перекиси водорода согласно методике, описанной в руководстве под редакцией М. Биргера (1982г.). Каталазоподобные ферменты определяли у лактобактерий, выросших на стандартной среде МРС-5 с добавлением прогретой крови и без добавления, а также на предлагаемой среде на основе гидролизата молозивного творога. Результаты исследования представлены в таблице 6.

На предлагаемой среде и на среде МРС-5 с добавлением прогретой крови в обеих группах обследованных штаммов каталазоподобные ферменты выявлялись в сопоставимых процентах случаев, в то время как, на среде МРС-5 без добавления прогретой крови признак отсутствовал в обеих группах.

Таким образом, предлагаемая питательная среда проста в изготовлении, содержит доступные компоненты. Использование отходов производства лактоглобулина позволяет среду в больших количествах. Предлагаемая питательная среда позволяет уже при первичном анализе на дисбактериоз судить о физиологической активности и частично о колонизующей способности лактобактерий, выделенных их материала от больных, по двум признакам - их антагонистической активности и способности к продукции каталазоподобных ферментов.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при исследовании микрофлоры организма человека на дисбактериоз. Среда содержит, г/л: сернокислый марганец 0,049-0,05; сернокислый магний 0,19-0,2; L-цистин солянокислый 0,095-0,1; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 1,95-0,2; пептон 4,9-5,0; глюкоза 19,8-20,0; агар-агар 15,0±0,1; стерильный мел 9,9-10,0; гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов - остальное. Питательная среда не имеет дорогостоящих компонентов, проста в приготовлении, обеспечивает рост и развитие разных штаммов лактобактерий и позволяет судить о кислотообразующей активности, об образовании каталазоподобных ферментов. 6 табл.

Питательная среда для выделения лактобактерий, содержащая питательную основу, глюкозу, пептон, L-цистин солянокислый, сернокислый марганец, сернокислый магний, калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы среда содержит ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов и дополнительно включает стерильный мел и агар-агар при следующем соотношении компонентов, в г/л:
Сернокислый марганец - 0,049 - 0,05
Сернокислый магний - 0,19 - 0,2
L-цистин солянокислый - 0,095 - 0,1
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 1,95 - 0,2
Пептон - 4,9 - 5,0
Глюкоза - 19,8 - 20,0
Агар-агар - 15,0±0,1
Стерильный мел - 9,9 - 10,0
Гидролизат молозивной казеиново-сывороточной массы из отходов производства лактоглобулинов - Остальноел