Штамм клубеньковых бактерий ВRаDYRнIZовIUм Sp. (GLYcYRRIZa) для производства бактериального удобрения под солодку голую Советский патент 1991 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

сл

с

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к получению микробиологических средств повышения урожайности бобо- вых культур (солодки голой). Целью, изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizoblum sp. для производства бактериального удобрения под солодку голую. Штамм клубеньковых бактерий Brodyrhlzoblum sp. (Glycyrrhiza)3101 выделен из клубеньков солодки голой, депонирован во ВНИИСХМ под №3101. Штамм позволил увеличить урожай зеленой массы солодки голой на 7,0 ц/га(61,4%) и содержание белка в растениях на 3,2%. 3 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур, а именно солодки голой.

Целью изрбретения является получение штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. для производства бактериального удобрения под солодку голую.

Бактерии штамма Bradyrhizoblum sp. (Glycyrrhiza) 3101 выделены из клубеньков солодки голой дикой популяции. Идентифицированы по определителю бактерий Берги.

Штамм 2101 депонирован и хранится в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 3101.

Культурно-морфологические признаки.

Штамм 3101 растет на питательных средах следующего состава:

Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; К2НР04 0,5; MgSO 7H20 0.2; NaCI 0.1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; рН среды 6,8-7,0.

Маннитно-дрожжевой агар с бром- тимолсиним, г/л: 10,0; K2HPO i 0:5; MgS04x7H20 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; бромтимолсиний 5 мл 0,5% спиртового раствора, рН среды 6,8- 7.0.

Маннитно-дрожжевой агар с амино- пептидом, г/л: маннит 10,0; К2НР04 0,5; MgSO ix7H20 0,2; NaCI 0,1; СаСОз следы, дрожжевой экстракт 0,4; аминопептид 10 мл; агар 15,0; рН среды 6.8-7,0.

На косом маннитно-дрожжевом агаре при Т 26-28°С и рН 6,8-7,0 в 5-ти суточной культуре клетки имеют форму коротких толстых палочек с закругленными концами, размер 1,5-2,0x0,7-0.8 мкм, грамотрицаOs

ю

00 Ю

ю

тельные, до 72 ч подвижные, затем по мере старения к 5-и суткам утрачивают подвижность, Медленно растущая культура. Образование специализированных клеток.

При старении культуры на маннитно- дрожжевом агаре с рН 6,8-7,0 и при Т 26- 28°С в возрасте 7 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика роста на плотной среде.

Рост бактерий на данной среде аналогичен росту на МДА, но культура окрашивается в желтый цвет, а среда - в зеленоватый.

Штрих 5-ти суточной культуры обильный, бесцветный, слизистый, стекающий, плоский. Колонии появляются на 4-е сутки, на 7-е сутки имеют размер 3-4 мм, однотипные, круглые, беловатые, слизистые, выпуклые, растекающиеся, S-формы.Рост в жидкой среде.

Молоко с лакмусом, Т 26-28°С, не пеп- тонизирует, интенсивно подщелачивает. После 48 ч окраска молока изменяется в сторону синего спектра, максимальное изменение цвета отмечается на 15-е сут.

Физико-биохимические свойства.

Симбионт. Макросимбионт - бобовое растение солодка голая.

Отношение к:

а)кислороду - аэроб

б)Т° максимальная 40°С; минимальная 10°С: оптимальная 26-30°С.

в)рН максимальная 8Л; минимальная 6,0; оптимальная 6,8-7,0.

Отношение к углеводам. Интенсивно использует маннит, рамнозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, декстрин, слабее - глюкозу, галактозу, сорбит. Среды с ксилозой, декстрином - подкисляет, с остальными сахарами - подщелачивает. Клетчатку и крахмал не усваивает.

Отношение к источникам азота: хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, аминопептидом. На мясо-пептонном агаре (МПА) бактерии не растут.

Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен

Штамм 3101 хранится на маннитном агаре при 4-5°С и рН 6,8-7,0 пересевается один раз в 6 мес.

Пример 1 (оценки симбиотических

свойств штамма 3101).

Оценку симбиотических свойств штамма 3103: вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводят в условиях микровегетационного и ве0 гетационного опытов.

Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции солодки голой клубеньковыми бактериями. Азотфиксирую5 щую активность штаммов определяют по величине активности нитрогеназы - ключевого фермента в процессе связывания молекулярного азота. В свою очередь нит- рогеназную активность измеряют ацетиле0 новым методом (по редукции ацетилена) на интактных растениях.

Эффективность симбиотической азот- фиксации определяют по общему накоплению азота растениями на сосуд, а также по

5 величине урожая зеленой массы солодки голой и содержанию в нем азота, который определяют с помощью системы Кьельтек- ауто Текатор.

Микровегетационный опыт.

0В большие пробирки с 5 мл стерильного

вермикулита добавляют 11 мл среды Кра- сильникова-Кореняко, стерилизуют в автоклаве. Семена солодки голой дикой популяции стерилизуют концентрирован5 ной серной кислотой в течение 20 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры и чашках Петри для прорастания. Через 2-е суток проростки в

0 асептических условиях раскладывают в пробирки со средой (по 2 проростка). Опыты ставят в 10-ти кратной повторности, Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом

5 маннитно-дрожжевом агаре в пробирках в течени е 5 сут. при 28°С и суспендируют в растворе микроэлементов (по прописи Федорова). Через 2 сут. после посева семян в каждую пробирку вносят 1 мл инокулюма,

0 имеющего концентрацию 107 клеток. Растения выращивают в фитотроне при 24-26°С. Через45сут. пробирки герметично закрывают и вводят шприцем ацетилен до концентрации 10% по объему. Количество этилена,

5 образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяют через 24 ч на газовом хроматографе.

Величину нитрогеназной активности клубеньков, которой измеряют азотфиксирующую активность штамма, выражают в микромолях С2Н4 за 24 ч на сосуд.

Вегетационный опыт проводят в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, но без азота, Повторность опыта 4-кратная Используют семена солодки голой дикой популяции.

Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивают на скошенном ман- нитно-дрожжевом агаре. Культуру в пробирках с титром 4-5 млрд. смывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена солодки голой, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда. В сосуд вносят 10 клеток.

Симбиотические свойства: вирулентность и азотфиксирующая активность штамма 3101 и известных штаммов Rhizobium meliloti 425a и Rhizobium meliloti 282 приве- дены в табл.1.

Сравнительная вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 3101 и Rhizobium meliloti 425a и 282 при инокуляции солодки голой даны в табл.1.

Как показывает табл.1, бактерии предлагаемого штамма 3101 вирулентны на солодке голой, они образуют на ее корнях типичные для этого растения клубеньки; бактерии штамма 282 слабо вирулентны на этом растении, образуют бурые, единичные клубеньки не на всех растениях, а штамма 425а не вирулентны.

Штамм 3101 является активным азот- фиксирующим симбионтом солодки голой, нитрогеназная активность клубеньков, образованных бактериями этого штамма на солодке голой, в выше, чем у контрольных растений и растений, инокулиро- ванных штаммами 425а и 282. Бактерии штамма 282 образуют неактивные клубеньки на солодке голой, их нитрогеназная активность не превышаетуровня контрольных растений.

В табл.2 приведены данные микрове- гетационного опыта, эффективность сим- биотической азотфиксации штаммов Bradyrhlzobium sp. 3101, Rhizobium meliloti 425a и 282 при инокуляции солодки голой

Как прказывают данные, полученные в микровегетационном опыте (табл.2), в результате активной симбиотической фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями штамма 3101 общее накопле- ние азота растениями солодки голой, бактеризованной этим штаммом, было на 96,4 и 114,5% выше, чем при использовании штаммов 425а и 282 соответственно. При этом урожай зеленой массы растений, инокулированных штаммом 3101, повысился на 22,9%, а содержание азота в ней на 1,69%. В вариантах, где применялись штаммы 425а и 282, фиксации азота атмосферы не происходило, растения дополнительно не снабжались этим элементом и продуктивность растений не повысилась. Напротив, инокуляции солодки голой штаммом Rhizobium meliloti (Melilotus) 282 привела к достоверному снижению урожая зеленой массы, что по-видимому можно объяснить тем, что в данном варианте бактерии были конкурентами растений за азот, усвоенный ими из почвы.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что активная симбиотическая азотфиксация у солодки голой может быть получена только при инокуляции специфичными для нее штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшие опыты штаммы-прототипы не включались.

Пример 2 (использование штамма 3101 для получения бактериального удобрения).

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или 5-ти литровых бутылях в течение 3 сут. на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт 0,7-1,0; пекарские дрожжи (влажные) 0,06; сахар пищевой 1,0, (NH4)2SCM 0,05; KH2PCto 0,025; К2НР04хЗН20 0,025; MgSCMxTbbO 0,02; (стерильный) 0,1; вода водопроводная до 100,0; рН 6,8-7,0. Титр клеток 4-5 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в 5-литровых бутылях на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт 0,7-1,0; пекарские дрожжи (влажные) 0,05; меласса 1,0; глюкоза 0,5-1,0; (NH4)2S04 0..05-0.1; КН2Р04 0,025; К2НР04хЗН20 0,025; MgS04 7H20 0,02: СаСОз 0,02-0,1; вода водопроводная до 100,0, рН (после стерилизации) 6,8-7.0.

-Бутылки засевают посевной культурой клубеньковых бактерий солодки в количестве 5%. Бутыли встряхивают на качалке в течение 72-96 ч при Т 28-30°С. Титр S-6 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей используют для смеси с торфом.

Подготовка торфа Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулиру- ют инъекцией смеси культуральная жидкость + меласса (6%) из расчета исходного jHTpa бактерий в торфе 0 3-0,5 млрд/г торфа и влажности 45-50%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты 3-5 сут. при 15-20°С. Ризоторфин хранят при 3-8°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта. Ризоторфин для солодки голой на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового продукта 50-55%. Ризоторфин содержит 3-4 млрд бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес. со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Статистическая обработка, Р - 7,8%, HCPos-0,33, Фоновая величина нитрогеназной активности.

Статистическая обработка, Р - 1,8%, HCPos- 1,1 мг/ сосуд.

В таблице 3 приведены данные по эффективности инокуляции солодки голой штаммом 3101.

Эффективность инокуляции солодки го- 5 лой штаммом Bradyrhizobium sp. (Glycyrrhiza)3101 представлена в табл.3.

Из табл.3 следует, что штамм 3101 является активным азотфиксирующим симбионтом солодки голой и благодаря этому 10 свойству способен повышать урожай зеленой массы растения-хозяина на 7,0 ц/га (61,4%) и увеличивать содержание белка в растениях на 3,2%.

15 Формула изобретения

Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Glycyrriza) ВНИИСХМ- 3101 для производства бактериального удобрения под солодку голую.

0

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3