СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИАКЛОПРИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2014 года по МПК G01N30/95 

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к определению остаточных количеств инсектицида в органах и тканях животных при подозрении на отравление тиаклопридом, а также в продуктах животного происхождения.

Известен способ определения тиаклоприда в воде, включающий экстракцию тиаклоприда гексаном, с последующей переэкстракцией в дихлорметан, фильтрацию и дегидратацию безводным натрия сульфатом, упаривание и хроматографирование на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором [Определение остаточных количеств тиаклоприда в воде, почве и яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1399-03].

Недостатками данного способа являются его низкая чувствительность для проб биологического материала. Использование большой навески способствует образованию большого количества коэкстрактивных веществ, мешающих проведению анализа и требующих включение этапа очистки экстракта, что ведет к снижению чувствительности метода и увеличению времени для проведения анализа.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является определение тиаклоприда в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, который заключается в отборе проб соломы 5 г или размолотого зерна 20 г, последующей экстракции 100 мл смеси ацетон-вода (1:1 по объему) в течение 15 минут. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра повторно экстрагируют с 50 мл 50%-ного водного раствора ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка 75-80 мл на роторном испарителе, доводят до объема 100 мл дистиллированной водой, промывают в делительной воронке 20 мл гексана, встряхивая делительную воронку в течение 1-2 минут. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2-3 минут. Объединенный метиленхлоридный раствор промывают в делительной воронке дважды 0,02М раствором NaOH порциями по 30 мл, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта растительного материала проводят в смеси гексан-этилацетат (50:50 по объему) в кондиционированной хроматографической колонке. Промывают колонку 75 мл в смеси гексан-этилацетат (1:1 по объему). Элюат отбрасывают. Тиаклоприд элюируют 70 мл в смеси гексан-этилацетат (1:9 по объему), после чего упаривают на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (смеси ацетонитрил-вода в соотношении 28:72) и 50 мкл раствора вводят в инжектор жидкостного хроматографа. Хроматографируют при следующих условиях: жидкостный хроматограф с УФ- детектором. Длина волны УФ-детектора 244 нм. Колонка Symmetry С-18 (250×4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA), предколонка Waters Symmetry С-18. Подвижная фаза ацетонитрил-вода (28:72). Скорость потока 1 мл/мин. Время удерживания тиаклоприда 10,9±0,2 мин. Предел обнаружения тиаклоприда в зерне 0,01 мг/кг, соломе 0,04 мг/кг. Линейный диапазон детектирования 0,1-2,0 мкг/мл.

Обработку результатов анализа проводят по формуле:

$$X=\frac{Cx{S}_{2}xV}{S_{1}xP}$$ ,

где

Х - содержание тиаклоприда в пробе, мг/кг;

С - концентрация стандартного раствора тиаклоприда, мкг/мл;

S₁ - площадь пика тиаклоприда в стандартном растворе, мм;

S₂ - площадь пика тиаклоприда в анализируемой пробе, мм;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств тиаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений [Методические указания по определению остаточных количеств тиаклоприда в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МУК 4.1.1853 - 04 /Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды /Сборник методических указаний. Выпуск 6, М.2009. - С.127-133].

Недостатком данного метода определения тиаклоприда является его низкая чувствительность и избирательность для проб биологического материала, а также длительность проведения анализа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и избирательности способа, сокращение продолжительности проведения анализа.

Технический результат достигается тем, что способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор пробы, экстракцию, фильтрацию, дегидратацию натрия сульфатом безводным, упаривание, введение растворенного сухого остатка в хроматограф, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску органов или тканей животных массой от 50 до 200 мг, экстракцию проводят ацетоном, растворенный сухой остаток вносят в жидкостный хроматограф «Хромоc -ЖХ 301» с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер - 110С - 16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 30:70.

Уменьшение массы пробы биологического объекта позволяет снизить количество коэкстрактивных веществ в экстракте, мешающих проведению анализа, что повышает чувствительность и избирательность метода.

Использование в качестве экстрагента ацетона связано с высокой растворимостью тиаклоприда в растворителе, быстрым испарением ацетона при выпаривании экстракта. Выпаривание проводят сразу после экстракции без этапа очистки. Очистка экстракта не требуется, так как ацетон хорошо растворяет остатки тиаклоприда и не смывает со дна колбы налет коэкстрактивных веществ, при этом потери тиаклоприда минимальны, что повышает чувствительность и избирательность метода, снижает его продолжительность.

Использование жидкостного хроматографа «Хромоc - ЖХ 301» с детектором спектрофотометрическим UVV 104M и колонки Диасфер - 110С - 16 (150×4) мм с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода в соотношении 30:70, позволяет получить острый симметричный пик тиаклоприда, коэффициент ассиметрии которого близок к 1, а также сократить время удерживания его в колонке, что повышает чувствительность, избирательность метода и сокращает время проведения анализа в 2 раза.

Способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом. Берут, например, 100 мг органов или тканей, измельчают и экстрагируют ацетоном по 4 мл трижды по 15 минут. Объединенный экстракт фильтруют через воронку с бумажным фильтром «красная лента», заполненным натрия сульфатом безводным, в грушевидную колбу для выпаривания и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани 40°С досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл вводят в жидкостный хроматограф «Хромос - ЖХ 301» с детектором спетрофотометрическим UVV 104M и программным обеспечением «Хромоc». Рабочая длина волны 150 нм. Колонка Диасфер - 110С - 16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм. В качестве элюента используют подвижную фазу ацетонитрил-вода в соотношении 30:70. Скорость потока 1 мл/мин. Время удерживания имидаклоприда 5,186±0,046 мин. Объем вводимой пробы 20 мкл. Линейный диапазон детектирования 0,1-2,0 мкг/см³. Обработку результатов анализа проводят методом абсолютной градуировки, содержание тиаклоприда в биологических объектах (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{Cx{S}_{2}xV}{S_{1}xP}$$ ,

где

Х - содержание тиаклоприда в пробе, мг/кг;

С - концентрация стандартного раствора тиаклоприда, мкг/мл;

S₁ - площадь пика тиаклоприда в стандартном растворе, мм;

S₂ - площадь пика тиаклоприда в анализируемой пробе, мм;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Метрологическая характеристика метода определения представлена в таблице 1.

Таблица 1. Метрологическая характеристика метода определения тиаклоприда в биологических объектах (n=5, Р=0,95) Анализируемая проба Предел количественного определения, мг/кг Среднее значение определения, % Стандартное отклонение S, % Доверительный интервал при α=0,05, % Кровь 0,0002 98,2 0,84 97.16-99,24 Содержимое желудка 0,001 98,0 1,0 96,76-99,24 Почка 0,001 98,4 0,55 97,72-99,08 Легкое 0,001 98,6 0,55 97,92-99,28 Мышечная ткань 0,001 98,8 0,45 98,24-99,36

Анализ метрологических характеристик способа определения тиаклоприда в биологических объектах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показывает высокую чувствительность и избирательность за счет уменьшения навески пробы и точного подбора экстрагента - ацетона. Исключение этапов очистки, использование колонки Диасфер - 110С - 16 (150×4) мм с размером частиц сорбента 5 мкм, а также подвижной фазы ацетонитрил-вода в соотношении 30:70 позволяет сократить продолжительность проведения анализа в два раза.

Способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии прост и экономичен в осуществлении.

Предлагаемый способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии может быть применен в лабораториях для контроля качества продуктов животного происхождения, а также осуществления прижизненной или посмертной диагностики при отравлении животных.

Предлагаемый способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии был апробирован в химико-токсикологическом отделе БУ 00 «Омская областная ветеринарная лаборатория».

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии. Способ состоит из отбора пробы, экстракции, фильтрации, дегидратации натрия сульфатом безводным, упаривания, введения растворенного сухого остатка в жидкостный хроматограф, обработки результатов анализа, в качестве пробы берут навеску органов или тканей животных массой от 50 до 200 мг, экстракцию проводят ацетоном, растворенный сухой остаток вносят в жидкостный хроматограф «Хромос - ЖХ301» с детектором спетрофотометрическим UVV 104M, используют колонку Диасфер - НОС-16 (150×4) мм с размером пор сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 30:70. Достигается повышение чувствительности и селективности анализа. 1 табл.

Способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор пробы, экстракцию, фильтрацию, дегидратацию натрия сульфатом безводным, упаривание, введение растворенного сухого остатка в хроматограф, обработку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве пробы берут навеску органов или тканей животных массой от 50 до 200 мг, экстракцию проводят ацетоном, растворенный сухой остаток вносят в жидкостный хроматограф «Хромос - ЖХ 301» с детектором спетрофотометрическим UVV 104M и колонкой Диасфер - 110С - 16 (150×4)мм с размером частиц сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 30:70.