Способ определения остаточных количеств феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Российский патент 2021 года по МПК G01N1/34 A01N47/12 B01D11/02 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для определения массовой концентрации феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Феноксикарб - белый кристаллический порошок, температура плавления 53-54°С, температура кипения 100°С, температура разложения 248°С. Давление паров при 25°С: 8,67×10^-4 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log Р= -4,07. Растворимость (г/л) при 25°С: ацетон - 770, этанол - 510, этилацетат - 500, толуол - 630, гексан - 5,3, н-октанол -130, вода - 0,008. Вещество стабильно на свету и не гидролизуется в водных растворах при рН 3-9. Феноксикарб - инсектицид, относящийся к регуляторам роста насекомых ювеноидного типа с контактно-кишечным действием. Применяется против вредителей из отряда чешуекрылых на хлопчатнике, виноградниках, фруктовых деревьях и декоративных культурах. Применяется в России для борьбы с яблонной и сливовой плодожоркой, гроздевой листоверткой на семечковых, косточковых культурах и винограде путем одно-трехкратного опрыскивания в течение вегетационного сезона с нормой расхода 0,4-0,6 кг/га. Согласно ГН 1.2.3539-18 ориентировочные допустимые концентрации феноксикарба в почве (ОДК) составляют 0,003 мг/кг.

Для количественной оценки содержания пестицидов в объектах исследования применяются ТСХ (тонкослойная хроматография), ГХ (газовая хроматография), КЭ/МС (капиллярный электрофорез с МС-детектором), ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Количественное определение используют для мониторинга концентрации пестицидов в почве, источниках воды, реках, воздухе и пищевых продуктах. В некоторых странах введен законодательный контроль за допустимым уровнем пестицидов в окружающей среде.

Известен способ определения феноксикарба в почве методом газожидкостной хроматографии или тонкослойной хроматографией (ВМУ 6176-91 Временные методические указания по определению феноксикарба (Инсегара, ВДГ) в растительном материале, воде и почве хроматографическими методами). Метод основан на извлечении феноксикарба из исследуемого объекта ацетоном или хлороформом и последующем определении методом реакционной газожидкостной хроматографии в виде ацильного производного (Мурашко С.В., Щербакова И.П., ВНИИГИНТОКС, Киев). Недостатком способа является то, что используемый хлороформ относится к сильнодействующим ядовитым веществам, класс 6 списка ООН. Яд. ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия. Использование ацетона предусматривает специальные требования, для хранения необходимо оборудованное помещение. Ацетон обладает наркотическим действием и легко воспламеняется. Класс 3 списка ООН. Все работы с ацетоном должны проводиться с использованием приточно-вытяжной вентиляции вдали от огня и источников искрообразования. При отборе проб, проведении анализа и обращении в процессе транспортных и производственных операций с ацетоном применяются индивидуальные средства защиты по нормам выдачи специальной одежды, специальной обуви и других средств защиты, утвержденным в установленном порядке. ГОСТ 2768-84 Ацетон технический. Технические условия.

Известен способ измерения концентраций феноксикарба в атмосферном воздухе населенных мест методом капиллярной газожидкостной хроматографии МУК 4.1.3461-17 (ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора Н.Е. Федорова, О.Е. Егорченкова, Д.Н. Соболев). Для измерения показателей применяется хроматограф (ГЖХ) с масс-селективным детектором (МСД). Определяемый диапазон массовой концентрации феноксикарба - 0,0004-0,004 мг/м³. Концентрирование вещества из воздуха осуществляют на пробоотборные трубки, заполненные пористым полимерным сорбентом, экстракцию с трубок проводят ацетоном. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 0,01 нг. Средняя полнота извлечения с трубок: 92,5%. Недостатком способа является применение ацетона, относящегося к вредным веществам (4 класс опасности).

Известен способ определения 25 комбинированных пестицидов (неоникотиноидов, производных имидазола, производных мочевины, сим-триазинов, триазолов, карбаматов, фосфорорганических соединений, пиретроидов) в воде, овощах и плодах в диапазоне концентраций 0,005-10 мг/л (мг/кг) методом ВЭЖХ с диодной матрицей детектирования при 220 Нм. Определение осуществляют по методу «QuEChERS» (быстрый, простой, дешевый, эффективный, прочный и безопасный). Исследуемые овощи и фрукты измельчали с помощью миксера. В центрифужную пробирку вместимостью 50 мл вносили навеску измельченного образца массой 10,0 г, добавляли 10 мл ацетонитрила, закрывали пробирку и энергично взбалтывали в течение одной минуты. Затем вносили следующие соли: 4,0 г безводного сульфата магния, 1,0 г хлорида натрия, 1,0 г натрия лимоннокислого тризамещенного двойного гидрата и 0,5 г натрия лимоннокислого двузамещенного полуторного гидрата. Затем смесь взбалтывали в течение одной минуты (во избежание образования комков) и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин, отбирали 4 мл верхней части экстракта и переносили в центрифужную пробирку (15 мл), которая содержала смесь сорбента Bondesil-PSA (0,5 г) и сульфата магния (0,5 г). Пробирку энергично встряхивали в течение 30 с и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин, затем отбирали экстракт и пропускали через хроматограф. Недостаток этого метода неточность анализа, плохая очистка образца.

Наиболее близким к заявленному является способ определения остаточных количеств феноксикарба в яблоках, сливах и винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МУК 4.1.2272-07 (Талалакина Т.Н., науч. сотр; Макеев A.M., зав. лаб., канд. биол. наук. ВНИИ фитопатологии). Методика основана на определении феноксикарба с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль феноксикарба в образцах яблок, сливы, ягод и сока винограда осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из сока гексаном, из яблок, слив и ягод метанолом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8. К недостаткам способа можно отнести применение сильнодействующего ядовитого вещества - метанола (ГОСТ 2222-95 Метанол технический. Технические условия). Это особо опасная легковоспламеняющаяся жидкость. Температура вспышки 6°С, температура воспламенения 13°С. При работе с продуктом, сливно-наливных операциях должны соблюдаться требования электростатической искробезопасности по ГОСТ 12.1.018. Производственные и лабораторные помещения, в которых проводятся работы с метанолом, должны быть снабжены приточно-вытяжной вентиляцией и местной вентиляцией, соответствующими требованиям ГОСТ 12.4.021, обеспечивающими состояние воздуха рабочей зоны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности показателя феноксикарба при определении его микроколичеств в почве посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом способ позволяет повысить безопасность работников токсикологических лабораторий.

Технический результат достигается за счет замены на этапе экстракции растворителя сильнодействующих ядовитых метанола, ацетона или хлороформа на менее токсичный растворитель - тетрахлорметан, при применении которого отмечается полное разделение пиков, высокая точность результата. На стадии фильтрации экстракта для почвы вместо воронки Бюхнера (ГОСТ 0147) применяли гофрофильтр, который удерживает на своей поверхности частички почвы. Стандартное отклонение 4,8%, доверительный интервал среднего при n=5 и d=0,95±4,95%.

Предлагаемый способ может быть использован для контроля качества почвы многолетних насаждений (яблоня, слива, виноград). Контроль содержания феноксикарба в почве осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из почвы тетрахлорметаном, последующей очистке экстракта в системе несмешивающихся растворителей, на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки с помощью программы ClarityChrom.

Способ осуществлялся следующим образом. На первом этапе подбирали растворитель для экстракции для определения остаточных количеств феноксикарба в почве. Для испытания были взяты следующие растворители: тетрахлорметан, гексан, этилацетат, для стандартного варианта метанол. В почву вводили феноксикарб в количестве 10 мг/кг. Далее проводили исследование на определение концентрации после экстракции и очистки образца. За результаты брали среднее арифметическое трех параллельных измерений (таблица 1).

Из полученных данных видно, что наибольшей экстрагируемой способностью обладает метанол и тетрахлорметан. Так как метанол относится к сильнодействующим ядовитым веществам, следующие исследования проводились с тетрахлорметаном.

При подготовке проб и выполнении измерений соблюдали следующие условия: температура окружающего воздуха (23±5)°С; атмосферное давление (97±10) кПа; относительная влажность воздуха не более 80% при 25°С; частота переменного тока (50±0,4) Гц; напряжение в сети (220±22). Для выполнения определения потребовались следующие реактивы и материалы: Феноксикарб, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,5% (Сингента, Швейцария), для анализа готовят 2 стандартных раствора основной 1 мг/кг и рабочий 10 мкг/мл, ацетонитрил для хроматографии, хч (ТУ 2634-002-54260861-2013), вода бидистиллированная или деионизованная (ГОСТ 6709-72), н-Гексан, хч (ТУ 6-09-3375-78), кислота орто-фосфорная, хч, 85% (ГОСТ 6552-80), тетрахлорметан (четыреххлористый углерод), хч (ГОСТ 20288-74), натрий сернокислый, безводный, хч (ГОСТ 4166-76), натрий хлористый, хч (ГОСТ 4233-77), натрий двууглекислый, хч (ГОСТ 83-79), этиловый эфир уксусной кислоты, ч (ГОСТ 22300-76).

В навеску (20 г) почвы вводили феноксикарб с заданными концентрациями, помещали в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, приливали 100 см³ тетрахлорметана и гомогенизировали 5 минут при 8000 об/мин. Гомогенат фильтровали через гофрированный бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывали 50 см³ тетрахлорметана. Экстракт и промывную жидкость переносили в химический стакан, перемешивали, измеряли объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносили в кругло донную колбу вместимостью 100 см³.

Отобранные аликвоты упаривали при температуре 40°С на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка экстракта - 1-2 см³. Дальнейшая очистка экстракта феноксикарба проводится в системе несмешивающихся растворителей: гексан + насыщенный раствор хлорида натрия + 0,5%-ный водный раствор двууглекислого натрия.

К водному остатку экстракта приливали 15 см³ деионизованной воды, 25 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивали и переносили в делительную воронку вместимостью 100 см³. В воронку вносили 30 см³ гексана, интенсивно встряхивали несколько раз с промежутками в полминуты; перед каждым очередным встряхиванием стравливали давление в делительной воронке. После разделения фаз верхний органический слой собирали в делительную воронку вместимостью 250 см³, а нижнюю водную фазу экстрагировали еще дважды, используя по 25 см³ гексана. Гексановые фракции объединяли, в воронку вносили 40 см³ 0,5%-ного водного раствора двууглекислого натрия и содержимое интенсивно встряхивали в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний водный слой отбрасывали, а гексановую фракцию повторно обрабатывали 30 см³ 0,5%-ного водного раствора двууглекислого натрия при встряхивании. После разделения фаз гексановую фракцию фильтровали через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и затем упаривали досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30°С.

Сухие остатки в круглодонной колбе, растворяли в 2,4 см³ гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляли 0,6 см³ этилацетата, перемешивали, вновь помещали в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносили на колонку содержащую слой стекловаты, суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 см³ гексана и слой безводного натрия. Колбу обмывали 5 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), которые также наносили на колонку. Колонку промывали 15 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек., элюат отбрасывали. Феноксикарб элюировал с колонки 45 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), собирали элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривали досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30°С.

Сухой остаток в круглодонной колбе растворяли в 1,2 см³ ацетонитрила, помещали в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляли 1,8 см³ деионизованной воды, перемешивали, вновь помещали в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносили на концентрирующий патрон Диапак С8, элюат отбрасывали. Колонку промывали 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), элюат отбрасывали. Феноксикарб промывали с патрона 5 см³ ацетонитрила, собирали элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривали досуха при температуре не выше 40°С. Остаток в колбе растворяли в 1 см³ подвижной фазы, помещали в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализировали на содержание феноксикарба.

Определение остаточных количеств феноксикарба в почве определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с помощью жидкостного хроматографа с ультрафиолетовым детектором (фирмы Knauer, Германия), с колонкой стальной длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащей в качестве неподвижной фазы Диасфер 110-С18, зернением 5 мкм. Температура колонки: 22-25°С, рабочая длина волны: 230 нм, чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу. Объем вводимой пробы: 20 мм³, линейный диапазон детектирования 1-10 нг, подвижная фаза: ацетонитрил-0,005 М Н₃РО₄ (65:35, по объему), скорость потока элюента: 0,8 см³/мин, время удерживания феноксикарба: 4-5 минут.

Примеры конкретного применения

Пример 1. В лабораторных условиях в образцы почвы весом 20 г, в дозировках: 1, 2, 5 и 10 мг/кг был введен феноксикарб. Количественные показатели феноксикарба определяли после его экстракции из почвы метанолом. На следующей затем стадии фильтрации экстракта использовали воронку Бюхнера. Очистку экстракта проводили в системе несмешивающихся растворителей, на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8. Обработка данных проводилась с помощью программы ClarityChrom.

За результаты было принято среднее арифметическое трех параллельных измерений. В результате проведенных анализов выявлено, что максимальный процент извлечения феноксикарба посредством метанола отмечен при введении концентрации 1 и 10 мг/кг и составила 97,9-99,1%, что отражено в фигурах 1 и 2.

Пример 2. В лабораторных условиях в разные образцы почвы весом 20 г был введен феноксикарб в дозировках: 1, 2, 5, 7 и 10 мг/кг. В качестве растворителя был применен тетрахлорметан. На стадии фильтрации экстракта был использован бумажный гофрофильтр. Дальнейшая пробоподготовка была проведена аналогично примеру 1.

Обработка данных проводилась аналогично примеру 1. Процент извлечения феноксикарба в исследовании, где в качестве растворителя применен менее токсичный в сравнении с метанолом тетрахлорметан оказался близким к результатам исследования, где в качестве растворителя применялся метанол, что отражено в фигурах 3 и 4.

Изобретение относится к способу определения остаточных количеств феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающему пробоподготовку: экстракцию его из почвы, последующую очистку экстракта в системе несмешивающихся растворителей гексан, насыщенный раствор хлорида натрия, водный раствор двууглекислого натрия и непосредственно количественное определение феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, причем на этапе экстракции в качестве растворителя используется менее токсичный тетрахлорметан, а на стадии очистки экстракта применен гофрофильтр. 2 пр., 3 табл., 4 ил.

Способ определения остаточных количеств феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий пробоподготовку: экстракцию его из почвы, последующую очистку экстракта в системе несмешивающихся растворителей гексан, насыщенный раствор хлорида натрия, водный раствор двууглекислого натрия и непосредственно количественное определение феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что на этапе экстракции в качестве растворителя используется менее токсичный тетрахлорметан, а на стадии очистки экстракта применен гофрофильтр.