СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОСТАТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА В ЖИДКОЙ СРЕДЕ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 G01Q60/24 

Изобретение относится к области биофизики и касается способа определения простат-специфического антигена (ПСА) в жидкой среде, который может быть использован, например, для раннего обнаружения рака предстательной железы человека (РПЖ).

Известен способ определения ПСА в жидкой среде путем определения изменения резонансной частоты колебаний плоской гибкой консоли у которой одна из плоскостей покрыта бычьим сывороточным альбумином (БСА), а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит антитела, специфические к ПСА, химически связанные с предыдущим слоем (Jeong Hoon Lee, Kyo Seon Hwang, Jaebum Park, Ki Hyun Yoon, Dae Sung Yoon, Tae Song Kim // Immunoassay of prostate-specific antigen (PSA) using resonant frequency shift of piezoelectric nanomechanical microcantilever, Biosensors and Biolectronics, 20, 2005, 2157-2162).

Известен способ определения ПСА в жидкой среде путем использования метода классического иммуноферментного анализа ПСА в жидкой среде с помощью сэндвич-метода на стеклянной пластинке, у которой поверхность содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью панели, а другой содержит антитела, специфические к ПСА, химически связанные с предыдущим слоем (Rick Wiese, Yuri Belosludtsev, Tom Powdrill, Patricia Thompson and Mike Hogan // Simultaneous Multianalyte ELISA Performed on a Microarray Platform, Clinical Chemistry 47:8, 2001, 1451-1457).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ определения ПСА в жидкой среде путем взаимодействия жидкой среды с сенсором, выполненным в виде плоского гибкого кантилевера, содержащего, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния, и способного отражать световое излучение, у которого одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью кантилевера, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, с последующим определением изменения изгиба кантилевера путем освещения поверхности кантилевера лучом света и измерения отклонения луча света, отраженного от поверхности кантилевера (Guanghua Wu, Ram H. Datar, Karolyn M. Hansen, Richard J. Cote and Arun Majumbar // Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilever/ Nature biotechnology, V.19, 2001, 856-860) - прототип. В данном способе кантилевер представляет собой плоскую консоль толщиной 0,5 микрометров (мкм), выполненную из кремния, одна из плоскостей которого покрыта слоем БСА, а другая покрыта слоем напыленного золота. При хранении такого кремниевого кантилевера на воздухе неизбежно происходит образование диоксидной пленки на поверхности кремния. Позолоченная плоскость консоли содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью кантилевера и представляет собой слой дитиобис-(сульфосукцинимидилпропионата). Другой слой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА. При этом в данном способе качестве жидкой среды используют модельные системы, аналогичные сыворотке крови человека.

Недостатком известного способа является его недостаточная чувствительность, зависящая от состава жидкой среды и составляющая для модельной системы, аналогичной сыворотки крови человека, 0,2 нанограмм/миллилитр (нг/мл), не позволяющая достоверно регистрировать низкие концентрации ПСА в жидкой среде и, тем самым, не позволяющая выявлять ранние стадии заболевания РПЖ.

Технической задачей изобретения является повышение чувствительности способа определения ПСА в жидкой среде, а также расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы в качестве способов определения ПСА в жидкой среде.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения ПСА в жидкой среде путем взаимодействия жидкой среды с сенсором, выполненным в виде плоского гибкого кантилевера, содержащего, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния и способного отражать световое излучение, у которого одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью кантилевера, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, с последующим определением изменения изгиба кантилевера путем освещения поверхности кантилевера лучом света и измерения отклонения луча света, отраженного от поверхности кантилевера, в качестве сенсора используют кантилевер, у которого слой, ковалентно связанный с поверхностью кантилевера, выполнен из 3-аминопропилсилатрана (АПС).

Предлагаемый способ определения ПСА в жидкой среде не описан в научно-технической литературе и является новым.

В предлагаемом техническом решении в качестве жидкой среды могут быть использованы как природные биологические жидкости, например, такие как сыворотка крови человека, моча и т.д., так и модельные водные растворы, содержащие ПСА.

Предлагаемый способ может быть реализован с использованием плоского гибкого кантилевера, выполненного в виде консоли, геометрические размеры которой могут быть различны в пределах размеров кантилеверов, используемых в атомно-силовой микроскопии, что обусловлено тем, что полезным сигналом на присутствие ПСА в исследуемой жидкой среде является механическая деформации кантилевера - изгиб, о степени которого можно судить, например, по отклонению луча света, отраженного от поверхности кантилевера. При этом форма кантилевера может быть различной. Следует отметить, что используемый кантилевер обязательно должен быть достаточно гибким, что обусловлено способом регистрации присутствия ПСА в исследуемой жидкой среде, и плоским, что повышает гибкость кантилевера.

В предлагаемом способе используют кантилевер, у которого, по крайней мере, поверхность одной из плоскостей должна содержать диоксид кремния, что обусловлено тем, что именно с диоксидом кремния можно осуществить ковалентное связывание АПС. В предлагаемом техническом решении кантилевер может быть выполнен как из кремния, так и из других материалов, например, из металла, из пластика и т.д. При использовании для изготовления кантилевера других материалов кроме кремния, необходимо дополнительно осуществить напыление на поверхность кантилевера кремния или диоксида кремния. При выдерживании на воздухе кантилевера, содержащего на поверхности атомы кремния, самопроизвольно происходит их частичное или полное окисление с образованием на поверхности диоксида кремния.

В предлагаемом изобретении используют кантилевер, у которого поверхность должна быть способна отражать световое излучение, направленное на поверхность кантилевера, что обусловлено особенностями регистрации изгиба кантилевера, свидетельствующего о присутствии ПСА в исследуемой жидкой среде. В качестве отражательной поверхности кантилевера может быть использована, например, полированная поверхность кремния или напыленный слой другого материала с хорошими отражательными свойствами. В качестве такого материала, как правило, используют золото. В предлагаемом способе при использовании кантилевера, содержащего напыленный материал, необходимо осуществлять термостатирование исследуемой жидкой среды, чтобы избежать побочного изгиба кантилевера, вызванного разными коэффициентами расширения используемых материалов.

В качестве светового излучения можно использовать, например, луч лазера или фокусированный луч от любого источника света. Если поверхность кантилевера не будет способна отражать световое излучение, то предлагаемый способ становится неработоспособным.

В предлагаемом техническом решении у кантилевера одна из плоскостей должна быть покрыта БСА, а другая должна содержать два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью кантилевера, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела (белка), специфически распознающего ПСА. Если у кантилевера обе плоскости будут содержать два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, то способ становится неработоспособным вследствие того, что при взаимодействии ПСА со специфическими антителами, закрепленными на кантилевере, не будет происходить изгиб кантилевера из-за уравновешивания сил, действующих на каждую из плоскостей кантилевера. Таким образом, в предложенном изобретении одна из плоскостей содержит закрепленные специфические антитела к ПСА, а поверхность другой плоскости, обработанной БСА, не может специфически связываться с ПСА. Наличие в предлагаемом техническом решении на одной из плоскостей кантилевера двух слоев обусловлено тем, что без этого химически закрепить антитела, специфически распознающие ПСА, на поверхности кантилевера невозможно.

В предлагаемом способе используют кантилевер, у которого слой, ковалентно связанный с поверхностью консоли, выполнен из АПС. Экспериментально было установлено, что данное соединение способно ковалентно связываться с поверхностью кантилевера, содержащей диоксид кремния, с образованием монослоя, позволяющего химически связывать на модифицированной поверхности кантилевера молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, в качестве которых в предложенном техническом решении используют молекулы антитела к ПСА. Также экспериментально было установлено, что с поверхностью кантилевера, не содержащей диоксид кремния, АПС ковалентно не связывается. Следует отметить, что в предлагаемом техническом решении молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, должны быть обязательно химически связаны с модифицированной поверхностью кантилевера. Это достигается обработкой модифицированной поверхности кантилевера раствором, содержащим антитела к ПСА, с последующей отмывкой не вступивших в реакцию антител. После этого на поверхности кантилевера остаются только антитела, химически связанные с поверхностью кантилевера. Если на поверхности кантилевера кроме связанных также будут присутствовать молекулы антител к ПСА, несвязанные с кантилевером, то результаты анализа с использованием таких кантилеверов будут недостоверными. Используемый в предлагаемом техническом решении кантилевер фактически является сенсором на ПСА.

Используемый в предлагаемом техническом решении кантилеверный сенсор на ПСА может быть получен, например, путем использования плоского гибкого кремниевого кантилевера, содержащего на одной из плоскостей напыленный слой золота, обеспечивающий хорошее отражение светового излучения. При хранении такого кантилевера на воздухе на его не модифицированной поверхности неизбежно образуется слой диоксида кремния. После этого вышеуказанный кантилевер обрабатывают водным раствором АПС. При этом продолжительность такой обработки может варьироваться в широких пределах и составлять, например, 15-60 минут (мин), затем кантилевер промывают дистиллированной водой для удаления не вступившего в реакцию АПС. После такой обработки получают кантилевер, содержащий на одной из плоскостей ковалентно связанный с поверхностью кантилевера слой АПС. При этом позолоченная плоскость кантилевера остается не модифицированной. Модифицированную АПС поверхность полученного кантилевера после этого обрабатывают в течение ночи при 4°C раствором моноклональных антител, специфических к ПСА, взятых в концентрации 100 мкг/мл в 0,01 молярном (М) К-фосфатном водном буферном растворе с pH 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, после чего кантилевер промывают дистиллированной водой. После этого полученный кантилевер обрабатывают 1%-ным раствором БСА в том же буферном растворе в течение 1 часа (ч), в результате чего только на позолоченной поверхности кантилевера сорбируются молекулы БСА, затем кантилевер промывают дистиллированной водой. После таких обработок получают плоский гибкий кантилевер, способный отражать световое излучение, у которого одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит диоксид кремния, кроме того, имеет два слоя, один из которых, выполненный из АПС, ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА.

Определение ПСА в жидкой среде с помощью предлагаемого способа проводят следующим способом. Вышеописанный кантилевер закрепляют одним концом в жидкостной ячейке системы для определения положения кантилевера. В ячейку вводят сначала жидкую среду, не содержащую ПСА. затем на позолоченную плоскость кантилевера направляют световое излучение. По отклонению светового излучения от отражательной поверхности кантилевера определяют положение кантилевера. Отклонение отраженного луча света регистрируют с помощью позиционно-чувствительного фотодетектора. После того, как система придет в состояние равновесия, раннее используемую жидкую среду вытесняют анализируемой жидкой средой. Изменение отклонения кантилевера свидетельствует о присутствии ПСА в анализируемой жидкой среде. Таким методом можно осуществлять качественное определение ПСА. Если произвести предварительную градуировку системы, то можно осуществлять количественное определение ПСА в жидкой среде. Чувствительность определения (предел обнаружения) ПСА с помощью предложенного способа определяют путем последовательного снижения концентрации ПСА в анализируемой жидкой среде. Чувствительность предложенного способа может варьироваться в зависимости от состава жидкой среды.

Преимущества предложенного способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Опыт проводят с использованием исходного кремниевого кантилевера, представляющего собой, плоскую гибкую консоль прямоугольной формы, содержащего на одной плоскости напыленный слой золота, поверхность которого обладает хорошими отражательными способностями. На другой поверхности кантилевера содержится диоксид кремния. Кантилевер обрабатывают водным раствором АПС в течение 30 мин, затем кантилевер промывают дистиллированной водой для удаления не вступившего в реакцию АПС. После такой обработки получают кантилевер, содержащий на одной из плоскостей ковалентно связанный с поверхностью кантилевера слой АПС. При этом позолоченная плоскость кантилевера остается не модифицированной. После этого полученный кантилевер в течение ночи при 4°C обрабатывают раствором моноклональных антител к ПСА с концентрацией 100 мкг/мл в 0,01 M колий-фосфатном водном буферном растворе с pH 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, после чего кантилевер промывают дистиллированной водой и обрабатывают в течение 1 ч 1%-ным раствором БСА в том же буферном растворе. В результате на позолоченной поверхности кантилевера сорбируются молекулы БСА, затем кантилевер промывают дистиллированной водой. Получают кантилеверный сенсор на ПСА. Сенсор способен отражать световое излучение и у него одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит два слоя, один из которых выполнен из АПС и ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит специфические антитела к ПСА, химически связанные с предыдущим слоем.

Полученный кантилевер закрепляют одним концом в жидкостной ячейке системы для определения положения кантилевера. В ячейку вводят сначала модельный буферный раствор (0,01 M калий-фосфатный водный буферный раствор с pH 7,2, содержащий 0,15 M NaCl), аналогичный сыворотки крови человека, затем на позолоченную плоскость кантилевера направляют луч лазера. По отклонению луча от отражательной поверхности кантилевера определяют положение кантилевера. Отклонение отраженного луча лазера регистрируют с помощью позиционно-чувствительного фотодетектора. Измерения проводит при постоянной температуре 25°C. После того как система прилет в равновесие производят ввод в жидкостную ячейку того же буферного раствора, содержащего различные концентрации ПСА (от 0 до 100 кг/мл), который вытесняет ранее введенную жидкую среду. Изменение отклонения предложенного кантилеверного сенсора, составляющее от 15 нм до 200 нм, свидетельствует о присутствии ПСА в анализируемом растворе. Таким образом, данный кантилеверный сенсор позволяет производить качественный анализ на ПСА в модельной системе, аналогичной сыворотки крови человека, с чувствительностью определения 0,1 нг/мл.

Пример 2 (контрольный, с использованием жидкой среды, не содержащей ПСА).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют модельную жидкую среду, не содержащую ПСА. Нулевое изменение отклонения предложенного кантилеверного сенсора свидетельствует об отсутствии ПСА в анализируемой жидкой среде.

Пример 3

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве исходного кантилевера используют плоский гибкий кремниевый кантилевер с полированной поверхностью, способной отражать световое излучение, на каждой из плоскостей которого содержится диоксид кремния. При этом только одна плоскость кантилевера обработана раствором АПС, а в качестве жидкой среды используют сыворотку крови человека. В ходе эксперимента на кантилеверный сенсор направляют фокусированный луч света от люминесцентного светодиода. Данный сенсор позволяет проводить качественный анализ сыворотки крови на присутствие ПСА с чувствительностью определения 0,5 нг/мл.

Пример 4

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве исходного кантилевера используют плоскую гибкую консоль, выполненную из полимерного материала марки SU-8, на одну из плоскостей которого напылен слой кремния, а на другую плоскость напылен слой золота. В качестве анализируемой жидкой среды используют модельный буферный раствор с ПСА (0,01 M калий-фосфатный водный буферный раствор с pH 7,2, содержащую 0,15 M NaCl), дополнительно содержащий другом белок - сывороточный альбумин человека в концентрации 1 мг/мл. В ходе эксперимента на кантилеверный сенсор направляют фокусированный луч света от ртутной лампы.

Данный сенсор позволяет проводить качественный анализ жидкой среды на присутствие ПСА с чувствительностью определения 0,1 нг/мл.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный кантилеверный сенсор позволяет проводить качественный анализ различных жидких сред на присутствие ПСА с чувствительностью определения 0,1-0,5 нг/мл.

Пример 5 (количественный анализ ПСА)

Опыт проводят с использованием кантилеверного сенсора на ПСА, описанного в примере 1. Для количественного определения ПСА осуществляют предварительную градуировку системы. Для этого проводят эксперименты с пятью различными стандартными пробами, приготовленными на основе сыворотки крови человека и содержащими различные известные концентрации ПСА. На основе полученных экспериментальных результатов строят градуировочную кривую зависимости изменения отклонения кантилеверного сенсора на ПСА от концентрации ПСА в сыворотке крови.

После этого аналогичным образом определяют изменение отклонения кантилевера для исследуемых образцов сыворотки крови с различными концентрациями ПСА. Изменение отклонения в 16-200 нм свидетельствует о том, что анализируемые сыворотки крови действительно содержат ПСА в концентрации 0,5-100 нг/мл.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ действительно позволяет проводить качественный и количественный анализ жидких сред на содержание ПСА и позволяет повысить чувствительность определения ПСА в модельной системе, аналогичной сыворотки крови человека, с 0,2 нг/мл (прототип) до 0,1 нг/мл. Кроме того, предложенный способ расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для определения ПСА в жидкой среде.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения простат-специфического антигена (ПСА) в жидкой среде. Для этого жидкая среда взаимодействует с сенсором, выполненным в виде плоского гибкого кантилевера. При этом, по меньшей мере, одна из плоскостей кантилевера содержит диоксид кремния и способен отражать световое излучение. Одна из плоскостей покрыта бычьим сывороточным альбумином. Другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью кантилевера, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего простат-специфический антиген. Далее определяют изменения изгиба кантилевера путем освещения поверхности кантилевера лучом света и измерения отклонения луча света, отраженного от поверхности кантилевера. При этом в качестве сенсора используют кантилевер, у которого слой, ковалентно связанный с поверхностью кантилевера, выполнен из 3-аминопропилсилатрана. Изобретение обеспечивает проведение качественного и количественного анализа жидких сред на содержание ПСА и повышает чувствительность определения ПСА до 0,1 нанограмм/миллилитр. 5 пр.

Способ определения простат-специфического антигена в жидкой среде путем взаимодействия жидкой среды с сенсором, выполненным в виде плоского гибкого кантилевера, содержащего, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния и способного отражать световое излучение, у которого одна из плоскостей покрыта бычьим сывороточным альбумином, а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью кантилевера, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего простат-специфический антиген, с последующим определением изменения изгиба кантилевера путем освещения поверхности кантилевера лучом света и измерения отклонения луча света, отраженного от поверхности кантилевера, отличающийся тем, что в качестве сенсора используют кантилевер, у которого слой, ковалентно связанный с поверхностью кантилевера, выполнен из 3-аминопропилсилатрана.