ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI Российский патент 1994 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к питательным средам для выделения микроорганизмов, вызывающих острые и хронические гастродуоденальные заболевания.

Известно, что основой питательных сред для выделения Helicobacter pylori (H. p. ) служат обычно коммерческие среды (brucella agar, GG agar/2/, triptic soy agar, brain heart infusion agar), к которым добавляют 5% крови, прогретой при 80^оС. На некоторых средах (GG agar, Mueller-Hinton agar) H.p. вырастает и без добавления крови, но число колоний в таких случаях в 2-4 раза меньше, чем на тех же средах с кровью. Добавление в среду активированного угля, муцина, целлюлозы, 5% лошадиной сыворотки существенно не влияет ни на количество вырастающих колоний, ни на их размер.

В последние годы для выделения H.p. в качестве основы кровяного агара используют brucella agar, предназначенный для выделения требовательных к составу питательной среды микроорганизмов (бруцеллы, анаэробы, бактероиды), а также для кампилобактеpов еюни и коли, сходных по морфологии и условиям культивирования с H.p.

Отечественные исследователи для выделения H.p. используют импортные среды, авторские среды, эритрит агар.

Прототипом изобретения является эритрит агар с добавкой 5% крови: на 1 л эритрит агара добавляют 50 мл крови.

Такой состав среды не обеспечивает ростовые потребности H.p.

Цель изобретения - улучшение ростовых свойств среды.

Цель изобретения достигается тем, что в состав среды, включающей эритрит агар и 5% крови в качестве дополнительных источников питания добавляют гемин и стимулятор роста чумного микроба при следующем соотношении компонентов, г/л:
Стимулятор роста чумного микроба 0,5-0,7 Гемин 0,005-0,015 Кровь 48-52 Эритрит агар 1 л
Добавление таких количеств гемина и стимулятора роста чумного микроба значительно улучшают ростовые свойства исходной среды: возрастает чувствительность среды, увеличивается размер колоний и скорость роста H.p.

П р и м е р 1. Растопленный стерильный эритрит агар остужают до 80^оС, добавляют 5% (50 мл) дефибринированной крови, тщательно перемешивают, остужают до 50^оС, добавляют 0,005 г гемина в виде 0,5%-ного раствора (1 мл) и 0,5 г стимулятора роста чумного микроба в виде 10%-ного раствора (5 мл). Перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри по 20-25 мл.

Приготовление 0,5% -ного раствора гемина: 0,5 г гемина растворяют в 10 мл 1 Н NaOH, добавляют дистиллированной воды до 100 мл, автоклавируют при 121^оС 15 мин.

Приготовление 10% -ного раствора стимулятора роста чумного микроба (Научно-исследовательский противочумный институт г.Ростов-на-Дону): содержимое ампулы (1 г) растворяют в 10 мл стерильной дистилированной воды.

Для определения чувствительности среды проводят количественный посев трех штаммов H.p. по 0,1 мл 1 млрд взвеси из разведений 10^-5, 10^-6 и 10^-7. Чашки инкубируют в микроаэрофильных условиях при 37^оС. Результаты учитывают через 5 сут (табл.1, средние данные 10 опытов).

Расчетное число КОЕ на этой среде составило 170 млн. Колонии H.p. - влажные блестящие полупрозрачные круглые с ровными краями. В мазках по Граму представляют собой грамотрицательные изогнутые палочки. H.p. продуцируют оксидазу и уреазу, не ферментируют углеводы.

П р и м е р 2. Осуществляют аналогично примеру 1. Гемин и стимулятор роста чумного микроба добавляют в количестве 0,010 и 0,6 г соответственно. Такой состав среды оптимален: чувствительность по сравнению с примером 1 возросла в 2,2 раза.

П р и м е р 3. Осуществляют аналогично примеру 1. Гемина добавляют 0,015 г, стимулятора роста чумного микроба 0,7 г. Чувствительность среды аналогична примеру 2.

П р и м е р 4. Среду готовят аналогично примеру 1, но не добавляют гемин и стимулятор роста чумного микроба. Колонии H.p. на этой среде мельче, чувствительность значительно ниже, чем в примерах 1, 2, 3.

П р и м е р 5. Среду готовят аналогично примеру 1, но добавляют один из двух дополнительных источников питания: 0,005 г гемина или 0,5 г стимулятора роста чумного микроба. Такой состав среды не достаточно обеспечивает ростовые потребнoсти H.p.: чувствительность ниже, чем в примерах 1, 2, 3, колонии мельче. Только сочетание двух указанных веществ позволяет получить ожидаемый результат.

Для выбора оптимальной дозы компонентов среды и определения их значимости проведена серия опытов, результаты которых приведены в табл.1. Из таблицы следует, что наилучшие результаты получены при использовании 5% кровяного эритрит агара с добавлением 0,010-0,015 гемина и 0,6-0,7 г стимулятора роста чумного микроба. Колонии H.p. на этой среде крупнее, чувствительность в 2,2-7,8 раз превышает чувствительность других исследуемых сред.

Предлагаемая среда испытана также для первичного выделения H.p. из биоптатов слизистой оболочки желудка. Каждый биоптат стерильно растирают в 0,6 мл физиологического раствора и высевают по 0,1 мл взвеси на чашку с 5% кровяным эритрит агаром с теми или иными добавками (табл.2). Чашки инкубируют в микроаэрофильных условиях при 37^оС. Результаты учитывают на 3, 5 и 7-е сутки инкубации. Оптимальные результаты получены также при использовании 5% кровяного эритрит агара с добавлением 0,005-0,015 г гемина и 0,5-0,7 г стимулятора роста чумного микроба. На этой среде колоний H.p. вырастало больше и формировались они раньше, чем на других испытуемых средах.

Таким образом, среда на основе 5% кровяного эритрит агара с добавлением 0,005-0,015 г гемина и 0,5-0,7 г стимулятора роста чумного микроба обеспечивает максимальную интенсивность роста высокотребовательных к условиям культивирования H.p.

В сравнении с прототипом (5% кровяной эритрит агар) в предлагаемой среде улучшены ростовые свойства: возросла скорость роста, H.p., чувствительность повысилась в 7,8 раз, размер колоний увеличился в 2-3 раза.

Использование: микробиология, питательные среды. Сущность изобретения: в питательную среду для выделения Helicobacter pylori содержащую эритрит агар и 5% крови, добавляют стимулятор роста чумного микроба и гемин. Состав среды с улучшенными ростовыми свойствами /в г/л/ стимулятор роста чумного микроба 0,5 - 0,7; гемин 0,005 - 0,015; кровь 0,048 -0,052 л; эритрит агар 1 л. 2 табл.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI, содержащая эритрит агар, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит кровь, гемин и стимулятор роста чумного микроба при следующем соотношении компонентов:
Стимулятор роста чумного микроба 0,5 - 0,7 г
Гемин 0,005 - 0,015 г
Кровь 0,048 - 0,052 л
Эритрит агар 1 л