СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ HELICOBACTER PYLORI Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

В настоящее время в связи с открытием В. Marshall Helicobacter pylori (HP) как основной причины хронического гастрита актуальной стала проблема выделения чистой культуры галикобактера, его идентификации и изучения чувствительности к антибактериальным средствам.

В настоящее время в микробиологии для культивирования HP предлагается использовать селективные среды (Вилкинс-Челдрен агар с 10% овечей крови, Колумбиа агар с 10% лошадиной крови, Среда пилори с лошадиной сывороткой и экстрактом дрожжей), в которых используется селективный набор антибиотиков, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры и неселективные среды (шоколадный агар, Колумбиа агар, агаризованный сердечно-мозговой бульон, хеликобактер агар) с добавлением различных факторов роста и не содержащих ингибиторов роста для других бактерий.

В качестве аналога авторы предлагают хеликобактер агар для выделения чистой культуры HP из биоптатов слизистой оболочки (CO) желудка и двенадцатиперстной кишки.

Питательную основу этой среды составляет Колумбиа агар с добавлением:
бараньи эритроциты - 10%
раствор гемина - 1%
раствор никотин-амидодинуклеотида (НАД) - 1%
раствор викасола - 0,1%
Однако хеликобактер агар обладает определенным недостатком, так как ее компоненты дорогостоящие, дефицитные, а такие как гемин сняты с производства не только в России, но и за рубежом, к тому же сроки культивирования составляют от 3 до 5 суток.

Прототипом авторы предлагают неселективную среду шоколадный агар, который применяется для выделения кокковой флоры.

К расплавленному горячему 2% питательному агару с 0,5% глюкозы pH 7,4 прибавляют очень небольшими порциями при постоянном покачивании колбы с агаром 8% дефибринорованной крови (можно пользоваться кровью любого животного). Агар слегка подогревают на слабом огне, не доводя до кипения. Перед разливкой в чашки агару для подавления роста посторонней микрофлоры прибавляют водный раствор генцианового фиолетового в концентрации 1:50000. Шоколадный агар без добавления красителя используется для культивирования гемофильных бактерий. При приготовлении шоколадного агара следует обратить особое внимание на правильный прогрев его: при слишком слабом прогреве агар будет иметь кирпично-красный цвет, при слишком сильном - темно-коричневый. Шоколадный агар должен иметь светло-коричневую окраску.

Недостатками прототипа на взгляд авторов является то, что в качестве питательной основы для приготовления шоколадного агара используется обычный питательный агар, на котором HP не культивируется.

Авторы предлагают следующий состав питательной среды для культивирования HP. В качестве питательной основы используется Колумбиа агар, коммерческая стоимость которого не выше, чем отечественных питательных сред. Состав Колумбиа агар (Becton Diekinson) на 1 л деминерализованной воды следующий:
Панкреатический гидролизат казеина - 12,0 г
Пептический гидролизат животных тканей - 5,0
Дрожжевой экстракт - 3,0
Бычий экстракт - 3,0
Крахмал - 1,0
Хлористый натрий - 5,0
Агар - 13,5
pH среды 7,3 ± 0,2. На 1 л воды берется 42,5 г порошка этой среды.

К питательной основе Колумбиа агар авторы предлагают добавлять 2,5% донорской человеческой крови и готовить шоколадный агар, после чего охладить до температуры примерно 50^oC и добавить 2,5% гемолизированной донорской крови (группа крови значения не имеет). Среда перемешивается и разливается по чашкам Петри.

Во время приготовления шоколадного агара из эритроцитов экстрагируется гемин, НАД и другие факторы роста, необходимые для культивирования не только гемофильных бактерий, но и для НР.

Таким образом, приготовленная питательная среда содержит все необходимые ростовые факторы для культивирования HP. Модификация среды, выраженная в приготовлении шоколадного агара Колумбиа и в добавлении гемолизированной донорской крови, упрощает и удешевляет технологию ее приготовления.

Модифицированная питательная среда использовалась для выделения HP из биоптатов CO желудка и двенадцатиперстной кишки больных хроническим гастритом и язвенной болезнью. Посев биоптата на поверхность питательной среды производился ватным тампоном по методике F.Megraud. Культивирование производилось в течение 2-3 суток в микроаэрофильных условиях с использованием анаэростата Gas Pak (BBL) и газовых пакетов Campy Pak (BBL) при температуре 37^oC.

В результате культивирования на модифицированной питательной среде минимально в течение 2-х суток появлялись мелкие колонии размером менее 0,5 мм, гладкие, блестящие, выпуклые, прозрачные. На третьи сутки рост был максимальным, колонии имели размер 1 мм. Колонии легко пересеваются на новые питательные среды. Идентификация Helicobacter pylori производилась с помощью французской идентификационной системы API Campy (bio Merieux).

Преимущество модифицированной питательной среды заключается в удешевлении технологии приготовления и в укорочении времени культивирования с 3-5 суток до 2-х суток (минимально).

Изобретение относится к области медицины. Способ культивирования Helicobacter pylori (HP) характеризуется тем, что культивирование идет на основе среды Колумбиа агар с добавлением 2,5% донорской крови и приготовлением шоколадного агара, затем к охлажденной до 50°С среде добавляется 2,5% гемолизированной донорской крови. В результате приготовления шоколадного агара из эритроцитов экстрагируются гемин, НАД, а добавление гемолизированной крови дополнительно обогащает питательную среду необходимыми факторами роста для НР. В результате посева биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки на модифицированной питательной среде выделялись колонии HP уже на 2-е сутки культивирования, максимальный рост на 3-е сутки в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С. Разработанный способ предлагается использовать в бактериологическом методе выделения чистой культуры HP из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Способ обеспечивает более быстрое культивирование на более дешевой среде.

Способ культивирования Helicobacter pylori, включающий изготовление шоколадного агара, отличающийся тем, что его изготовляют на основе Колумбиа агар с добавлением 2,5% гемолизированной донорской крови без учета ее группы, с максимальным ростом Helicobacter pylori на третьи сутки.