Биофармацевтическая композиция с антибактериальной и пробиотической активностью и лекарственная форма на её основе Российский патент 2023 года по МПК A61K35/74 A61K35/745 A61K35/747 A61K35/76 A61K47/02 A61K47/06 A61K9/02 A61K9/10 A61K9/20 A61P31/04 

Изобретение относится к медицине и биофармацевтической промышленности, а именно к комплексным лекарственным средствам, содержащим бактериофаги и пробиотики, с широким спектром антибактериальной и пробиотической активности, которые могут быть использованы для восстановления симбиотного равновесия микрофлоры кишечника и других биотопов организмов человека.

Наиболее близкой к предлагаемой биофармацевтической композиции является композиция на основе пробиотика и бактериофага (см. патент RU №2453320, опубл. 20.06.2012)

Недостатком известной композиции является:

- низкий уровень совместимости фагового и клеточного пробиотического компонентов по значениям рН (менее 6,5 и более 7,0 соответственно) и стабильности при хранении;

- невозможность получения стабильной лекарственной формы биофармацевтической композиции со сроком годности более 3-6 месяцев на основе жидкого пробиотического клеточного компонента и со сроком годности более 12-18 месяцев на основе лиофилизированного пробиотического клеточного компонента;

- низкая устойчивость пробиотического компонента по сохранению жизнеспособности клеток лакто- и бифидобактерий при воздействии желудочного сока и желчи при попадании биофармацевтической композиции в желудочно-кишечный тракт;

- ограниченность линейки лекарственных форм биофармацевтической композиции, связанная с технологическими свойствами пробиотических бактериальных культур;

- необходимость использования дорогостоящего процесса лиофилизации для получения сухой пробиотической субстанции при изготовлении любой лекарственной формы биофармацевтической композиции со сроком годности не менее 12 месяцев;

- необходимость учитывать совместимость (возможный антагонизм) бактериальных штаммов при конструировании пробиотической составляющей биофармацевтической композиции;

Технической задачей предлагаемой биофармацевтической композиции является:

- повышение уровня совместимости фагового и пробиотического компонентов;

- возможность изготовления лекарственных форм биофармацевтических композиций с продолжительным (не менее 12 мес.) сроком годности без применения процесса лиофилизации пробиотического компонента;

- повышение устойчивости пробиотического компонента (из-за отсутствия живых клеток) при бактерицидном воздействии желудочного сока и желчи при попадании биофармацевтической композиции в желудочно-кишечный тракт;

- исключение необходимости подбора совместимых штаммов и отказ от использования живых бактериальных культур;

- возможность получения лекарственных форм со сроком годности не менее 12 месяцев без использования лиофилизации;

- расширение линейки лекарственных форм.

Для решения поставленной технической задачи предлагается биофармацевтическая композиция со специфической антибактериальной и пробиотической активностью на основе бактериофага и пробиотика, выполненная в виде лекарственной формы, причём она содержит в качестве пробиотического компонента экзометаболиты пробиотических культур, полученные из культуральной жидкости бактерий рода Lactobacillus и/или бактерий рода Bifidobacterium с плотностью популяции 10⁷ – 10¹⁰ КОЕ/мл, смешанные в нативном или концентрированном виде с видоспецифическими вирулентными бактериофагами и/или видоспецифическими бактериофагами с индуцированной вирулентностью с литической активностью не ниже 10^-5 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выполнена в виде лекарственной формы для внутреннего и/или наружного и/или местного применения.

Предлагаемое решение отличается тем, что она содержит в качестве пробиотического компонента экзометаболиты пробиотических культур, полученные из культуральной жидкости бактерий рода Lactobacillus и/или бактерий рода Bifidobacterium с плотностью популяции 10⁷ – 10¹⁰ КОЕ/мл, смешанные в нативном или концентрированном виде с видоспецифическими вирулентными бактериофагами и/или видоспецифическими бактериофагами с индуцированной вирулентностью с литической активностью не ниже 10^-5 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выполнена в виде лекарственной формы для внутреннего и/или наружного и/или местного применения.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих возможность осуществления при использовании биофармацевтической композиции и соответствующим соотношением фармацевтически приемлемых целевых добавок для различных лекарственных форм. При этом приведенные в примерах комбинации ингредиентов биофармацевтической композиции показывают конкретную реализацию заявленного изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде жидкой лекарственной формы для внутреннего, наружного и местного применения. Для препарата используют пробиотический компонент (метабиотик) на основе бесклеточной фракции культуральной жидкости пробиотических штаммов (например: Lactobacillus plantarum 8Р-А3 и/или Lactobacillus acidophilus K₃Ш₂₄ и/или Bifidobacterium bifidum 1 и/или Bifidobacterium bifidum 791), полученный методом ультрафильтрации с последующей стабилизацией ультрафильтрата (экзометаболитов пробиотических культур) термической обработкой и

• Монобактериофаг (например: Стафилококковый, представляющий собой стерильный очищенный фаголизат соответствующих бактерий Staphylococcus spp.); или

• Комплексный поливалентный бактериофаг Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) представляющий собой смесь стерильных очищенных фаголизатов бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aerugenosa, энтеропатогенными Escherichia coli различных серогрупп, Klebsiella pneumoniae; или

• Комплексный поливалентный бактериофаг Интести-бактериофаг представляющий собой смесь стерильных очищенных фаголизатов бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp.,Pseudomonas aerugenosa, энтеропатогенными Escherichia coli различных серогрупп, Salmonella групп А, В, С, D, Shigella (Sh.flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, Sh. sonnei).

Для приготовления биофармацевтической композиции метабиотик в нативном или сконцентрированном в 2-10 раз виде с рН (7,0±0,3) смешивают со стерильными фильтратами фаголизатов бактериофагов с титром не менее 10^-5 по Аппельману в соотношении соответственно 1:9.

Полученную биофармацевтическую композицию разливают по 20 мл во флаконы вместимостью 20 мл, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками. Получаемая лекарственная форма для внутреннего, наружного и местного применения содержит биологически активную субстанцию в жидком виде в количестве 100,0 мас.% со сроком годности не менее 12 месяцев.

Пример 2. Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде лиофилизата во флаконах.

Смешивание компонентов биофармацевтической композиции проводят как описано в примере 1.

К полученной биофармацевтической композиции добавляют защитную среду для лиофилизации (например: сахарозо-желатиновую) и после тщательного перемешивания разливают по 2 мл во флаконы вместимостью 5 мл. Флаконы помещают в кассеты, замораживают при температуре не выше минус 40°С и высушивают в сублимационной установке до остаточной влажности 1-4%. Флаконы с лиофилизатом укупоривают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками.

Лекарственная форма для внутреннего, наружного и местного применения в виде лиофилизата во флаконах содержит биологически активную субстанцию в количестве до 85,0 мас.% и фармацевтически приемлемые целевые добавки (защитная среда) в количестве до 15,0 мас.% от массы единицы лекарственной формы со сроком годности более 12 месяцев.

Пример 3 Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде твердых капсул.

Смешивание компонентов биофармацевтической композиции проводят как описано в примере 1.

К биофармацевтической композиции добавляют фармацевтически приемлемые целевые добавки, предварительно стерилизованные в сушильно-стерилизационном шкафу (метилцеллюлозу и/или лактозу, и/или сорбит, и/или кальция карбонат, и/или натрия альгинат, и/или пектин или др.) до/после процесса лиофилизации, в количестве 15-30 мас.% от массы единицы лекарственной формы. После гомогенизации полученной массой наполняют кассеты, замораживают при температуре не выше -40°С и высушивают в сублимационной установке до остаточной влажности 1-4%. Сухую массу гранулируют, опудривают стерильной массой фармацевтически приемлемых целевых добавок (вспомогательных антифрикционных веществ), тщательно перемешивают и расфасовывают в твердые капсулы для внутреннего применения со сроком годности не менее 24 месяцев.

Пример 4 Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде суппозиториев.

Смешивание компонентов биофармацевтической композиции проводят, как описано в примере 1.

Биофармацевтическую композицию смешивают с суппозиторной основой (например: витепсол, эмульгатор Т-2) составляющей 80,0-85,0 мас.% от массы единицы лекарственной формы. После гомогенизации полученную суппозиторную массу используют для формования суппозиториев со сроком годности не менее 12 мес.

Полученные варианты биофармацевтической композиции на основе пробиотика и бактериофага испытывали на антимикробную и пробиотическую активность.

Исследование специфической и неспецифической антимикробной активности биофармацевтической композиции

Неспецифическую антимикробную активность исследовали дискодиффузионным методом (МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам») в отношении тест-штаммов Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, энтеропатогенными Escherichia coli различных серогрупп, Klebsiella pneumoniae, Salmonella групп А, В, С, D, Е, Shigella (Sh. flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, Sh. sonnei).

Бактериальную культуру засевали газоном на питательный агар Мартена в чашке Петри. На газон культуры на равных расстояниях друг от друга размещали диски, пропитанные соответствующим предлагаемым препаратом, затем инкубировали при температуре (37±1) ºС в течение (18±2) ч.

Исследуемые препараты: Биофармацевтическая композиция I (экзометаболит пробиотической культуры штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ + Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Биофармацевтическая композиция II (экзометаболит пробиотической культуры штамма Lactobacillus acidophilus K₃Ш₂₄ + Секстафаг® в соотношении 1:9); Экзометаболит I (экзометаболит пробиотической культуры штамма L. plantarum 8Р-АЗ), Экзометаболит II (экзометаболит пробиотической культуры штамма L. acidophilus K₃Ш₂₄ + экзометаболит пробиотической культуры штамма Bifidobacterium bifidum 1, Интести-бактериофаг, Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный), коммерческий препарат Хилак-форте – все препараты были приведены к значению рН, равному 6,5 – 6,8. Диффузия препарата в агар приводила к формированию зоны подавления роста тест-культуры вокруг дисков. Результаты учитывали путем измерения зоны ингибирования роста тест-штамма.

Определение антимикробной активности дискодиффузионным методом

Таблица 1

Образец Зона ингибирования роста, мм Биофармацевтическая композиция I* 18,7±0,2 Биофармацевтическая композиция II* 18,2±0,1 Экзометаболит I 6,5±0,2 Экзометаболит II 2,6±0,2 Хилак-форте Отсутствие зоны ингибирования Интести-бактериофаг 15,1±0,2 Секстафаг® 14,6±0,3

Примечание:

* Величина зоны ингибирования рассчитана как среднее значение зон ингибирования на восьми газонах культур Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, энтеропатогенными Escherichia coli различных серогрупп, Klebsiella pneumoniae, Salmonella групп А, В, С, D, Е, Shigella (Sh. flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, Sh. sonnei).

Полученные данные свидетельствуют что, биофармацевтические композиции I и II в данном тесте обладают более выраженным антибактериальным действием в сравнении с комплексными бактериофагами, экзометаболитами пробиотических культур и коммерческим препаратом Хилак-форте.

Специфическая антимикробная активность комплексного препарата

Специфическую антимикробную активность определяли титрованием по методу Аппельмана путем наибольшего разведения, при котором препарат проявляет антимикробный эффект в отношении тест-штаммов Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, энтеропатогенными Escherichia coli различных серогрупп, Klebsiella pneumoniae, Salmonella групп А, В, С, D, Е, Shigella (Sh. flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, Sh. Sonnei).

Исследуемые препараты: Биофармацевтическая композиция I (экзометаболит пробиотической культуры штамма L. plantarum 8Р-АЗ + Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Биофармацевтическая композиция II (экзометаболит пробиотической культуры штамма L. acidophilus K₃Ш₂₄ + Секстафаг® в соотношении 1:9); Интести-бактериофаг, Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) – все препараты были приведены к значению рН 6,5 – 6,8.

Специфическая антимикробная активность

Таблица 2

Микроорганизм Специфическая активность по Аппельману
(Средний титр по препарату) Интести-бактериофаг Секстафаг® Биофармацевтическая композиция I Биофармацевтическая композиция II Klebsiella pneumoniae -* 10^-6,00±0,00 -* 10^-6,00±0,00 Streptococcus spp. 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 Proteus vulgaris et mirabilis 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 Escherichia coli 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 Staphylococcus spp. 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 Pseudomonas aeruginosa 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 Staphylococcus spp. 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 Salmonella групп А,В,С,D,Е, 10^-6,00±0,00 -* 10^-6,00±0,00 -* Shigella (Sh.flexneri 1,2,3,4,6 сероваров, Sh. sonnei). 10^-6,00±0,00 -* 10^-6,00±0,00 -*

Примечание:

*Отсутствует в составе препарата

Из представленных данных видно, что специфическая антибактериальная активность биофармацевтических композиций сопоставима со специфической активностью коммерческих препаратов бактериофагов.

Пробиотическая активность комплексного препарата

Пробиотическую активность определяли по накоплению биомассы тест-штамов Bifidobacterium bifidum 1, B. bifidum 791, Lactobacillus acidophilus К₃Ш₂₄ и L. plantarum 8Р-А3. В качестве питательной среды использовали 0,5% стерильный раствор глюкозы. В 24 мл питательной среды в пробирке вносили 3 мл испытуемого препарата и такой же объем культуры лакто- или бифидобактерий. В контроле вместо препарата добавляли аналогичное количество физиологического раствора. Посевы выдерживали в термостате при температуре (37±1)ºС в течение (22±2) часа с лактобактериями и (44±4) часа с бифидобактериями. Рост бактериальных культур оценивали по величине оптической плотности (ОD) в контрольном и исследуемом образце на фотоэлектроколориметре «КФК-3» в кювете с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм. Уровень стимуляции бактериальных культур выражали с помощью коэффициента (КС роста)

КС роста= ОD_опыт/ ОD_{контроль}, где

ОD_опыт – средний показатель в опытной пробе,

ОD_{контроль} – средний показатель в контрольной пробе.

Исследуемые препараты: Биофармацевтическая композиция I (экзометаболиты пробиотических культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus K₃Ш₂₄ + Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Биофармацевтическая композиция II (экзометаболиты пробиотических культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus K₃Ш₂₄ + Секстафаг® в соотношении 1:9); Биофармацевтическая композиция III (экзометаболиты пробиотических культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus K₃Ш₂₄ + монобактериофаг Стафилококковый в соотношении 1:9), экзометаболит пробиотической культуры штамма L. acidophilus K₃Ш₂₄ + экзометаболит пробиотической культуры штамма B. bifidum 791, коммерческий препарат Хилак-форте – все препараты приведены к значению рН 6,5-6,8.

Влияние комплексного препарата на накопление

биомассы штамма B. bifidum 1

Таблица 3

Образец Прирост оптической плотности
(ОD, λ=540нм) Опыт Контроль КС
роста Биофармацевтическая композиция I 0,380±0,02 0,085±0,02 4,47 Биофармацевтическая композиция II 0,380±0,02 4,47 Биофармацевтическая композиция III 0,380±0,02 4,47 Экзометаболит пробиотической культуры L. acidophilus K₃Ш₂₄ + экзометаболит пробиотической культуры B. bifidum 791 0,351±0,01 4,13 Хилак-форте 0,228±0,02 2,68

Результаты исследования пробиотической активности показали, что биофармацевтические композиции I, II и III обладают высоким стимулирующим эффектом, сопоставимым с действием экзометаболититов пробиотических культур и коммерческого препарата Хилак-форте, что свидетельствует о наличие у биофармацевтической композиции выраженного пробиотического эффекта.

Оценка стабильности препаратов в процессе хранения

При изучении стабильности полученных препаратов активность бактериофага по методу Аппельмана выражали в титрах (наибольшее его разведение, которое подавляет рост тест-штаммов в условиях данного опыта). В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, энтеропатогенными Escherichia coli различных серогрупп, Klebsiella pneumoniae, Salmonella групп А, В, С, D, Е, Shigella (Sh. flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, Sh. sonnei). А пробиотическую активность выражали коэффициентом стимуляции роста тест-штамма.

Исследуемые препараты: Биофармацевтическая композиция (экзометаболиты пробиотических культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus K₃Ш₂₄ + Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Интести-бактериофаг, Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный), экзометаболит пробиотической культуры штамма L. acidophilus K₃Ш₂₄ + экзометаболит пробиотической культуры штамма B. bifidum 791. Все препараты имели уровень рН 6,5 - 6,8.

Стабильность препаратов в процессе хранения

Таблица 4.

Срок хранения
(мес.) Специфическая активность по Аппельману
(Средний титр по препарату) Пробиотическая активность
(Коэффициент стимуляции роста штамма B. bifidum 1) Интести-бактериофаг Секстафаг® Биофармацевтическая композиция Экзометаболит пробиотической культуры L. acidophilus K₃Ш₂₄ +Экзометаболит пробиотической культуры B. bifidum 791 Биофармацевтическая композиция 0 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 4,13 4,47 6 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 10^-6,00±0,00 4,13 4,47 12 10^-5,80±0,37 10^-5,90±0,27 10^-6,00±0,00 4,13 4,47 18 10^-5,70±0,37 10^-5,80±0,37 10^-6,00±0,00 4,13 4,47 24 10^-5,60±0,20 10^-5,60±0,37 10^-5,80±0,20 4,13 4,47 30 10^-5,40±0,24 10^-5,60±0,20 10^-5,60±0,24 4,13 4,46 36 10^-4,8±0,00 10^-5,0±0,37 10^-5,20±0,23 4,11 4,46

Из представленных данных видно, что специфическая антибактериальная и пробиотическая активность биофармацевтической композиции сохраняется на высоком уровне при хранении в течении 36 мес при температуре от +2°С до +8°С. Наличие метаболитного пробиотического компонента способствует высокой сохраняемости специфической антибактериальной активности композиции.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, медицине, а именно к биофармацевтической композиции с антибактериальной и пробиотической активностью на основе пробиотика и бактериофага. Биофармацевтическая композиция с антибактериальной и пробиотической активностью на основе пробиотика и бактериофага включает активную субстанцию в жидком или лиофилизированном виде в количестве 15,0-100,0 мас.% и фармацевтически приемлемые целевые добавки в количестве 0-85,0 мас.% от массы композиции, при этом активная субстанция содержит в качестве пробиотического компонента экзометаболиты, полученные из культуральной жидкости пробиотических бактерий рода Lactobacillus и/или Bifidobacterium с плотностью популяции 10⁷-10¹⁰ КОЕ/мл, смешанные в нативном или концентрированном виде с бактериофагом с индуцированной вирулентностью и литической активностью не ниже 10^-5 по Аппельману в отношении тест-штаммов в соотношении 1:9 соответственно, а бактерии выбраны из группы: Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, Lactobacillus acidophilus К3Ш24, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791. Заявленная композиция используется в виде лекарственной формы, выбранной из раствора, лиофилизата, твердой капсулы, суппозитория. Вышеописанное изобретение позволяет расширить арсенал лекарственных средств, обладающих наряду с антибактериальной активностью эффектом коррекции микроэкологических нарушений кишечной микрофлоры и имеющих срок годности не менее 12 месяцев. 3 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

1. Биофармацевтическая композиция с антибактериальной и пробиотической активностью на основе пробиотика и бактериофага, включающая активную субстанцию в жидком или лиофилизированном виде в количестве 15,0-100,0 мас.% и фармацевтически приемлемые целевые добавки в количестве 0-85,0 мас.% от массы композиции, при этом активная субстанция содержит в качестве пробиотического компонента экзометаболиты, полученные из культуральной жидкости пробиотических бактерий рода Lactobacillus и/или Bifidobacterium с плотностью популяции 10⁷-10¹⁰ КОЕ/мл, смешанные в нативном или концентрированном виде с бактериофагом с индуцированной вирулентностью и литической активностью не ниже 10^-5 по Аппельману в отношении тест-штаммов в соотношении 1:9 соответственно, а бактерии выбраны из группы: Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, Lactobacillus acidophilus К3Ш24, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791.

2. Биофармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция используется в виде лекарственной формы, выбранной из раствора, лиофилизата, твердой капсулы, суппозитория.

3. Биофармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемые целевые добавки выбраны из защитной среды для лиофилизации композиции и/или веществ для улучшения технологических свойств лиофилизированной субстанции.

4. Биофармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемые целевые добавки представляют собой суппозиторную основу.