Способ получения препарата целлюлолитической ассоциации бактерий рубца Советский патент 1992 года по МПК C12P39/00 A23K1/00 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологический промышленности, а именно к способам получения препаратов на основе бактериальных продуцентов целлтолаз, включающих анаэробное культивирование и сушку препарата.

Известен способ получения препарата целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца жвачных животных, включающий культивирование ассоциатов бактерий коровы и лося Ра пЪГтатёльной среде, содержащей в качестве источника целлюлозы мелкоизмельченную фильтровальную бумагу, в качестве источников минерального и органического азота - сульфат аммония и пептон, в качестве источников фосфорного

питания - одно- и двузамещенный фосфаты калия, в качестве источников летучих жирных кислот (ЛЖК) - отфильтрованную руб- цовую жидкость.

Недостатком этого способа является использование в составе среды дорогих и дефицитных компонентов: пептона, рубцовой жидкости, фосфатов калия, которые эффективны при лабораторных исследованиях, но не могут быть использованы при промышленном производстве.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получе- ния препарата целлюлолитической ассоциации рубца, включающий получение посевного материала на питательной среде, содержащей в качестве источника целлюлозы полоски фильтровальной бумаги, в качестве источника минерального и органического азота - сульфат аммония, пептон, дрожжевой экстракт, в качестве источников фосфорного питания - одно- и дву- замещенные фосфаты калия, в качестве редуктона - цистеин солянокислый, в качестве источника ЛЖК - отфильтрованную рубцовую жидкость, культивирование целлюлолитической ассоциации на питательной среде следующего состава: травяная мука - 1,0г, дрожжевой экстракт - 0,1 г, пептон - 0,1 г, калий фосфорнокислый од- нозамещенный - 0,02г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,05 г, магний сернокислый - 0,01 г, кальций хлористый - 0,001 г, натрий хлористый - 0,1 г, аммоний сернокислый - 0,05г, цистеин солянокислый - 0,02г, натрий углекислый - 0,4 г, натрий уксуснокислый - 0,36 мг, натрий изомаслянокислый - 8,2 мг, натрий изова- лериановокислый - 9,7 мг, натрий вале- риановокислый - 9,7 мг, вода - до 100 мл, рН среды - 7,0-7,2, культивирование в анаэробных условиях, в течение 4-5 суток, отделение клеток целлюлолитической ассоциации бактерий вместе с остатками питательной среды и сушку.

Недостатками данного способа являются высокая стоимость и дефицитность используемых компонентов питательной среды.

Целью изобретения является удешевление препарата активной целлюлолитической ассоциации рубца путем замены дорогих и дефицитных компонентов питательной среды более дешевыми и технологичными, а также создание малоотходной технологии за счет использования отходов собственного производства.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения препарата активной целлюлолитической ассоциации бактерий

рубца, предусматривающем приготовление посевного материала на среде, содержащей источник целлюлозы, минеральные и органические источники азотного и фосфорного питания, сульфат магния, редуктон, ЛЖК или их натриевые соли и воду, культивирование целлюлолитической бактериальной ассоциации на питательной среде, содержащей источники целлюлозы, источники мине- 0 рального и органического азота, источники фосфорного питания, редуктон, источники ЛЖК, и воду, до максимального накопления титра; отделение клеток бактериальной ассоциации от культуральной жидкости и суш- 5 ку осадка; отличием является то, что питательная среда для приготовления посевного материала содержит в качестве источника целлюлозы свекловичный жом, в качестве источника органического азота - 0 автолизат дрожжей, в качестве редуктона - натрий сернистый, источника фосфорного питания - натрий фосфорнокислый двузамещенный, в качестве источников ЛЖК - ацетат, изобутират, изовалериат и валериат 5 натрия, при следующем соотношении компонентов:

свекловичный жом0,4-0,8 г

дрожжевой автолизат0,02-0,06 г 0 натрий фосфорнокислый

двузамещенный0,07-0,11 г

магний сернокислый0,006-0,014 г калий хлористый0,002-0,006 г 5 аммоний сернокислый 0,07-0,11 г натрий сернистый 0,01-0,03 г натрий уксуснокислый 0,05-0,65 мг 0 натрий изомаслянокислый6,0-10,0мг натрий изовалериано- вокислый 7,5-11,5мг натрий валерианово- 5 кислый 7,5-11,5мг

водадо 100 мл

культивирование целлюлолитической ассоциации бактерий рубца ведут на питательной среде, содержащей в качестве 0 источника целлюлозы - жом свекловичный, в качестве источника органического азота - автолизат дрожжей, при соотношении целлюлозы и органического азота от 10:1 до 23:1, в качестве редуктона- натрий 5 сернистый, в качестве источника фосфорного питания - натрий фосфорнокислый двузамещенный, в качестве источника ЛЖК - фильтрат культуральной жидкости целлюлолитической ассоциации бактерий рубца, при следующем соотношении компонентов:

свекловичный жом2,0-4,0 г

дрожжевой автолизат 0,1-0,3 г натрий фосфорнокислый двузамещенный0,4-0,6 г

магний сернокислый 0,006-0,014 г калий хлористый0,03-0,07 г

аммоний сернокислый 0,25-0,45 г натрий сернистый0,01-0,03 г

кальций углекислый 0,1-0,3 г фильтрат культуральной жидкости20-30 мл

водадо 100 мл

с последующим отделением биомассы бактериальных клеток с непотребленными остатками питательной средъгйгвы- сушиванием остатка.

Использование в качестве источника целлюлозы для приготовления noceeMofo материала и культивирования целлюло л и- тической бактериальной ассоциации рубца свекловичного жома вместо фильтровальной бумаги и травяной муки обеспечивает хороший рост и высокий титр и целлюлояи- тическую активность. Свекловичный жом - отход сахарного производства, широко используется как для кормовых целей, так и в микробиологической промышленности при приготовлении питательных сред для быра- щивания микроскопических грибов - продуцентов цел л юл аз. В этом случае для лучшего использования и усвоения микроскопическими грибами свекловичного жома необходим предарительный полный или частичный гидролиз его полисахаридов. Продуценты бактериальных целлюлаз обладают большим сродством к нативной кристаллической целлюлозе, по сравнению с грибными цел- люлазами. Капиллярно-пористая коллоидная структура свекловичного жома, в которой вода химически и физически связана, обеспечивает лучшую адсорбцию бактериальных клеток на лигнино-целлюлозном субстрате. Содержащийся в свекловичном жоме органический азот, микроэлементы и ростовые вещества, при подобранной концентрации его в посевной питательной среде, полностью обеспечивают ассоциацию этими компнонентами.

При конструировании солевого состава питательной среды для приготовления посевного материала исходили из принципа обеспеченности ассоциации необходимыми элементами, но вводимыми в виде до- ступных и недорогих солей. Источники фосфорного питания по способу-прототипу - калий фосфорнокислый однозамещенный и калий фосфорнокислый даузамещенный дорогие и дефицитные, используемые для медицинской промышленности, заменили

более дешевой и доступной солью - натрием фосфорнокислым двузамещенным,

Кальций хлористый,натрий хлористый и натрий углекислый заменили двумя солями 5 калием хлористым и кальцием углекислым. Используемый в качестве редуктона для поддержания анаэробных условий дефицитный цистеин солянокислый заменили натрием сернистым (табл. 1).

0 Для создания условий, аналогичных условиям рубца жвачных животных, в питательные среды вводят источники ЛЖК. Источниками ЛЖК в питательной среде для приготовления посевного материала служат

5 натриевые соли ЛЖК: натрий уксуснокислый -0,05-0,65 мг%, натрий изомаслянокислый - 6,0-10,0 мг%, натрий изовалериановокис- лый - 7,5-11,5 мг%, натрий валерианово- кйслый - 7,5-11,5 мг%.

0 При конструировании питательной среды для культивирования ассоциации исходили из тех же принципов использования дешевых и доступных компонентов. В качестве источника углерода в питательной сре5 де, взамен травяной муки, используют свекловичный жом в концентрации 2,0-4,0 %. Травяная мука производится в хозяйствах для собственных кормовых потребностей, и стоимость ее значительна, поэтому

0 она не может быть использована при промышленном производстве препарата. Источником органического азота в питательной среде для культивирования ассоциации служит дрожжевой автолизат.

5 Используемые в прототипе в качестве органических источников азота дрожжевой экстракт и пептон имеют очень высокую стоимость. Дрожжевой автолизат значительно дешевле и содержит в своем составе

0 значительное количество легкоусвояемого органического азота (не менее, %): сырого протеина - 50,0, растворимого белка - 10,0, аминного азота - 1,5. Внесение в питательную среду для культивирования дрожжево5 го автолизата в концентрации 0,1-0,3 % позволяет обеспечить бактериальные клетки целлюлолитической ассициации растворимым белком и амикным азотом. Оптимальное соотношение свекловичного

0 жома и дрожжевого автолизата-10:1 -23:1.

При конструировании солевого состава

питательной среды для культивирования асс Ш|и1щйи исходили из того же принципа,

что и для посевной питательной среды.

5 Определение оптимальных концентраций компонентов питательных сред для вы- ращивания посевного материала и ферментации целлюлолитической ассоциации1 рубца проводили постановкой экспериментов по методу математического планирования.

Оптимизация концентраций источников углерода и азота в питательных средах и их соотношения проводилась постановкой экспериментов по ортогональному плану для трех факторов (свекловичный жом, дрожжевой автолизат, аммоний сернокислый) на пяти уровнях (соответственно, для посевной питательной среды: .от 0,4 до 0,8%, от 0,02 до 0,06%, от 0,07 до 6,11%,-для ферментационной среды: от 2,0 до 4,0%, от 0,1 до 0,3%, от 0,25 до 0,45%). Оптимизацию концентраций минеральных компонентов питательных сред проводили постановкой экспериментов по ортогональному плану для пяти факторов (натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, калий хлористый, натрий сернистый, кальций углекислый) на пяти уровнях (соответственно, для посевной питательной среды: от 0,07 до 0,11%, от 0,006 до 0,014%, от 0,002 до 0,006%, от 0,01 до 0,03%, от 0 до 0,08%; для ферментационной питательной среды: от 0,4 до 0,6%, от 0,006 до 0,014%, от 0,03 до 0,07%, от 0,01 до 0,03%, от 0,1 до 0,3%).

Результаты экспериментов, подтверждающие установленные оптимальные концентрации каждого компонента питательной среды и их граничные значения, представлены в табл. 3 - для посевной питательной среды и в табл. 2 - для ферментационной питательной среды.

Источником ЛЖК в питательной среде для выращивания посевного материала являются натриевые соли уксусной, изомасля- ной, изовалериановой и валериановой кислот.

Источником ЛЖК в питательной среде для культивирования ассоциации служит фильтрат культуральной жидкости, получаемый после отделения биомассы. Содержание ЛЖК в фильтрате культуральной жидкости через 48 ч находится на уровне 154,5 мг% (табл. 4). При внесении 20-30% об. фильтрата концентрация ЛЖК в питательной среде достигает оптимального уровня - 39,0 - 46,0 мг%.

Способ осуществляется следующим образом:

Посевной материал для анаэробного культивирования целлюлолитических бактериальных ассоциаций рубца готовят на питательной среде следующего состава:

свекловичный жом0,4-0,8 г

натрий фосфорнокислый

двузамещенный0,07-0,11 г

дрожжевой автолизат 0,02-0,06 г

магний сернокислый 0,006-0,014 г

калий хлористый0,002-0,006 г

аммоний сернокислый 0,07-0,11 г натрий сернистый0,01-0,03 г

натрий уксуснокислый 0,05-0,65 мг, натрий изомаслянокислый6,0-10,0мг

натрий изовалериано- вокислый7,5-11,5 мг

натрий валерианово- кислый7,5-11,5мг

0 водадо 100 мл.

рН питательной среды 6,8-7,2. Питательные среды готовят в пробирках объемом 50 мл, коэффициент заполнения 0,8. В пробирки вносят навески свекловичного жома, дрож- 5 жевого автолизата, 20%-ные растворы натрия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого, калия хлористого, аммония сернокислого, натрия сернистого в расчете на 40 мл питательной среды, объем 0 доводят до 20 мл водой и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа 40 минут. Раствор солей ЛЖК стерилизуют при 0,05 МПа 30 минут. Пробирки со средой засевают посевным материалом в количестве 5% об., вно- 5 сят раствор солей ЛЖК и доводят объем стерильной водой до 40 мл, закрывают гидравлическими затворами. Выращивание осуществляют в анаэробных условиях при температуре 38 ± 1°С в течение 2-4 суток. 0 Получают качественный посевной материал с титром 1-2 109 кл/мл.

Культивирование целлюлолитических ассоциаций бактерий рубца проводят на среде следующего состава: 5 свекловичный жом2,0-4,0 г

дрожжевой автолизат 0,1-0,3 г аммоний сернокислый 0,25-0,45 г натрий фосфорнокислый двузамещенный0,4-0,6 г

0 магний сернокислый 0,006-0,014 г калий хлористый0,03-0,07 г

натрий сернистый0,01-0,03 г

кальций углекислый 0,1-0,3 г фильтрат культуральной 5 жидкости20,0-30 мл

водадо 100 мл

Среду готовят в колбах обьемом 500 мл, коэффициент заполнения питательной средой - 0,8. В колбы вносят навески свекйо- 0 вичного жома, дрожжевого автолизата мела, 20%-ные растворы натрия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого, аммония сернокислого, калия хлористого, натрия сернистого в расчете на 5 400 мл питательной среды, доводят объем водой до 200 мл, стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 40 мин. Отдельно стерилизуют фильтрат культуральной жидкости при 0,05 МПа 30 минут Засев производят посевным материалом в количестве

5-10 % об. В колбы вносят стерильный фильтрат культуральной жидкости (80-120 мл) и доводят объем стерильной водой до 400 мл. Колбы закрывают гидравлическими затворами и выдерживают в анаэробных условиях при температуре 38 ± 1°С в течение 2-3 суток. По окончании культивирования КМЦ-осахаривающая активность культуральной жидкости составляет 2-4 ед/мл, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона в модификации Чюрлиса 10-15 %, титр продуцента - 10 -1011 кл/мл. Бактериальную массу с непотребленными остатками питательной среды отделяют и высушивают известными способами. Полученный сухой препарат имеет следующие характеристики: содержание жизнеспособных бактериальных клеток не менее 400х хЮ6 кл/г, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона не менее 8%, КМЦ - осахаривающая активность - 35 ± 2 ед/г.

П р и м е р 1, Посевной материал целлю- лолитической ассоциации бактерий рубца, состоящей из культур Ruminococcus albus, Clostridlum lochheadli, Cl. Chermocellulolyticus (ассоциация № 1), готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,5 г, дрожжевой автолизат- 0,03 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,08 г, магний сернокислый - 0,008 г, калий хлористый - 0,003 г, аммоний сернокислый.- 0,08 г, натрий сернистый-0,015 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,2 мг, натрий изомаслянокислый -7,0мг, натрийизовалериановокислый-8,5 мг, натрий валериановокислый -8,5 мг, вода

-до 100 мл. Предварительно готовят 20%- ные растворы солей: натрия фосфорнокислого двузамещенного, натрия сернистого, магния сернокислого, калия хлористого, аммония сернокислого; а также раствор солей ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,02 г, натрий изомаслянокислый - 0,7 г, натрий изовалериановокислый - 0,85 г, натрий валериановокислый -0,85 г, натрий валериановокислый - 0,85 г в 100 мл воды. Среду готовят в пробирках вместимостью 50 мл, коэффициент заполнения питательной средой - 0,8. В пробирки вносят навески свекловичного жома (0,2 г), дрожжевого автолизата (0,012 г), 20%-ные растворы солей: натрия фосфорнокислого двузамещенного-0,16 мл, магния сернокислого -0,016 мл, калия хлористого - 0,006 мл, аммония сернокислого - 0,16 мл, натрия сернистого

-0,03 мл в расчете на 40 мл питательной среды, объем доводят до 20 мл водой и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа 40 мин. Раствор солей ЛЖК стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа 30 мин. Засев питательной среды производят в стерильных условиях жидкой культурой ассоциации бактерий в количестве 5 % об. (2,5 мл). После засева в

пробирки стерильно вносят раствор солей ЛЖК (0,4 мл) и стерильную воду до объема 40 мл. Пробирки закрывают гидравлическими затворами и помещают в термостат с температурой 38 ± 1°С. Длительность выращивания посевного материала - 2 суток. Готовый посевной материал имеет титр (1 ± 0,5) 10s кл/мл и целлюлолитическую активность по КМЦ (КМЦ-осах.) - (0,3 ± 0,05) ед/мл.

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 2,5 г, дрожжевой автолизат - 0,15 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,45 г, магний сернокислый - 0,008 г, калий хлористый - 0,04 г, аммоний сернокислый - 0,3 г, натрий сернистый - 0,015 г, кальций углекислый - 0,15 г, фильтрат культуральной жидкости - 20,0 мл, вода

-до 100 мл. Предварительно готовят 20%- ные растворы минеральных солей. Среду готовят в колбах объемом 500 мл. В колбы вносят навески свековичного жома (10 г), дрожжевого автолизата (0,6 г), мела (0,6 г),

20%-ные растворы солей: натрия фосфорнокислого двузамещенного - 9 мл, магния сернокислого - 0,16 мл, калия хлористого - 0,8 мл, аммония сернокислого - 6 мл, натрия сернистого - 0,3 мл, воду до 200 мл, закрывают резиновыми пробками, пробки закрепляют, и колбы стерилизуют при 0,1 МПа 40 минут. Фильтрат культуральной жидкости, полученный после культивирования бактериальной целлюлолитической ассоциации и

отделения центрифугированием клеток вместе с остатками питательной среды, стерилизуют при 0,05 МПа 30 мин и вносят стерильно в готовую питательную среду в количестве 80 мл. Затем вносят стерильно

посевной материал (40 мл) из пробирок и стерильную воду до общего объема 400 мл. Колбы закрывают резиновыми пробками с гидравлическими затворами. Культивирование проводят в термостате при температуре

38 ± 1°С, длительность культивирования 3 суток. По окончании культивирования титр клеток составляет (2 ±0,5) 1010 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона - 10 ± 0,5%, КМЦ-осах. активность - 2,0 ± 0,2 ед/мл.

П р и м е р 2. Посе.вной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации № 1 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,7 г, дрожжевой автолизат-0,05 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,1 г, магний сернокислый - 0,012 г, калий хлористый - 0,005 г, аммоний сернокислый - 0,1 г, натрий сернистый - 0,025 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,5 мг, натрий изомаслянокислый

-9,0 мг, натрий изовалериановокислый - 10,5 мг, натрий валериановокислый - 10,5 мг, вода - до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1. Готовый посевной материал имеет титр (1 ± 0,5) 109 кл/мл и КМЦ-осах. активность - 0,3 ± 0,05 ед/мл.

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 3,5 г, дрожжевой автолизат - 0,25 г, аммоний сернокислый - 0,4 г, калий хлористый - 0,06 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,55 г, кальций углекислый - 0,25 г, натрий сернистый - 0,025 г, магний сернокислый - 0,012 г, фильтрат культуральной жидкости -15,0 мл, вода -до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.

По окончании культивирования титр клеток составляет (2 ±0,5) 1010 кл/мл, КМЦ-осах. активность - 2,0 ± 0,2 ед/мл.

П р и м е р 3. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации № 1 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,6 г, дрожжевой автолизат - 0,04 г, аммоний сернокислый - 0,09 г, калий хлористый - 0,004 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,09 г, натрий сернистый - 0,02 г, магний сернокислый - 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,35 мг, натрий изомаслянокислый - 8,0 мг, натрий изовалериановокислый - 9,5 мг, натрий валериановокислый

-9,5, вода - до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1,

Готовый посевной материал имеет титр (1 ±0,5) 109 кл/мл и ШЦ-осах. активность -0,3 ± 0,05 ед/мл.

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 3,0 г, дрожжевой автолизат - 0,2 г, аммоний сернокислый - 0,35 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 г, калий хлористый - 0,05 г, кальций

углекислый - 0,2 г, натрий сернистый - 0,02 г, магний сернокислый - 0,01 г, фильтрат культуральной жидкости - до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной

среды, стерилизации, засева, а также условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.

По окончании культивирования титр клеток составляет (2 ±0,5) 1011 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу Хен- дерсона- 15 ±0,5 %, КМЦ-осах. активность -4,0 ±0,2 ед/мл.

П р и м е р 4. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассиации № 1

готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,4 г, дрожжевой автолизат - 0,02 г, аммоний сернокислый - 0,07 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,07 г, магний сернокислый - 0,006 г, калий хлористый - 0,002 г, натрий сернистый - 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,05 мг, натрий изомаслянокислый - 6,0 мг, натрий изовалериановокислый - 7,5 мг, натрий вэлериановокислый - 7,5 мг, вода - до 100 мл. Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1,

Готовый посевной материал имеет титр (1 ±0,5) 108кл/мл и КМЦ-осах.активность -0,1 ±0,02 ед/мл.

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят

питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 2,0 г, дрожжевой автолизат - 0,1 г, аммоний сернокислый - 0,25 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,40 г, калий хлористый - 0,03 г, кальций

углекислый-0,10 г, натрий сернистый-0,01 г, магний сернокислый - 0,006 г, фильтрат культуральной жидкости - 20,0 мл, вода - до 100мл.

Процедуры приготовления питательной

среды, стерилизации, засева, культивирования аналогичны описанным в примере 1.

По окончании культивирования титр клеток составляет (1 ± 0,5) 1010 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу

Хендерсона - 5-7%, КМЦ-осах. активность - 1,5-0,1 ед/мл.

П р и м е р 5. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации № 1 готовят на питательной среде следующего

состава: свекловичный жом - 0,80 г, дрожжевой автолизат - 0,06 г, аммоний сернокислый - 0,11 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,11 г, магний сернокислый - 0,014 г, калий хлористый - 0,006 г,

натрий сернистый - 0,03 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,65 мг, натрий изо- маслянокислый - 10,0 мг, натрий изовалериановокислый - 11,5 мг, натрий ва- лериановокислый- 11,5мг, вода-до 100мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.

Готовый посевной материал имеет титр (1-2) 108 кл/мл, КМЦ-осах. активность - 0,1 ± 0,02 ед/мл.

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 4,0 г, дрожжевой авто- лизат - 0,30 г, аммоний сернокислый - 0,45 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный

-0,60 г, калий хлористый - 0,07 г, кальций углекислый-0,30 г, натрий сернистый-0,03 г, магний сернокислый - 0,14 г, фильтрат культуральной жидкости - 30,0 мл, вода -до 100мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия куль- тивирования аналогичны описанным в при- мере 1.

По окончании культивирования титр клеток составляет (1 ±0,5) 1010 кл/мл, цел- люлолитическая активность по методу Хен- дерсона- 10 ±0,5%, КМЦ-осах. активность -2,5 ±0,1 ед/мл.

П р и м е р 6. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца, состоящей из культур Bacteroldes succinogenes и Rumlnococ cus flavefaciens (ассоциация № 2), готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,4 г, дрожжевой автолизат - 0,02 г, аммоний сернокислый - 0,07 г, натрий фос- форнокислый двузамещенный - 0,07 г, магний сернокислый - 0,006 г, калий хлористый

-0,002 г, натрий сернистый - 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,05 мг, натрий изомаслянокислый - 6,0 мг, натрий изовалериановокислый - 7,5 мг, натрий ва- лериановокислый - 7,5 мг, вода - до 100 мл.

Процедуры приготовления среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным ранее в примере 1.

Готовый посевной материал имеет титр (5 ±0,5) 107кл/мл и КМЦ-осах, активность -0,05 ±0.02 ед/мл.

Для выращивания ассоциации готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 2,0 г, дрожжевой автолизат - 0,1 г, амоний сернокислый - 0,25 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,40 г, калий хлористый - 0,03 г, кальций углекислый-0,10 г, натрий сернистый-0,01 г, магний сернокислый - 0,006, фильтрат культуральной жидкости - 20,0 мл, вода - до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева, культивирования аналогичны описанным ранее в примере 1.

По окончании культивирования титр клеток составляет (4 ±0,5) 109 кл/мл, цел- люлолитическая активность по методу Хендерсона - 3-4%, КМЦ-осах. активность -0,6 ± 0,1 ед/мл.

Пример. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации № 2 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,6 г, дрожжевой автолизат - 0,04 г, аммоний сернокислый - 0,09 г, калий хлористый - 0,004 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,09 г, натрий сернистый - 0,02 г, магний сернокислый - 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,35 мг, натрий изомаслянокислый - 8,0 мг, натрий изовалериановокислый - 9,5 мг, натрий валериановокислый - 9,5 мг, вода - до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным ранее в примере 1.

Готовый посевной материал имеет титр (1 ±0,5) 108кл/мл и КМЦ-осах. активность 0,1 ±0,05 ед/мл.

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 3,0 г, дрожжевой автолизат - 0,2 г, аммоний сернокислый - 0,35 г натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 г, калий хлористый - 0,05 г, магний сернокислый - 0,01 г, кальций углекислый - 0,2 г, натрий сернистый - 0,03 г, фильтрат культуральной жидкости - 30,0 мл, вода -до 100 мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.

По окончании культивирования титр клеток составляет (3 ± 0,5) 1010 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона - 5 ± 0,5 %, КМЦ-осах. активность -1,1 ±0,2 ед/мл.

ПримерЗ, Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации № 2 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом - 0,80 г, дрожжевой автолизат - 0,06 г, аммоний сернокислый - 0,Т1 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,11 г, магний сернокислый - 0,014 г, калий хлористый - 0,006 г, натрий сернистый - 0,03 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый - 0,65 мг, натрий изо- маслянокислый - 10,0 мг, натрий изовалериановокислый - 11,5 мг, натрий ва- лериановокислый- 11,5мг, вода-до 100мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.

Готовый посевной материал имеет титр (2 ±0,5) 107 кл/мл, КМЦ-осах. активность -0,04 ±0,02 ед/мл,

Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом - 4,0 г, дрожжевой авто- лизат - 0,30 г, аммоний сернокислый - 0,45 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный

-0,60 г, калий хлористый - 0,07 г, магний сернокислый - 0,014 г, кальций углекислый

-0,30 г, натрий сернистый - 0,03 г, фильтрат культуральной жидкости-30,0 мл, вода-до 100мл.

Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1,

По окончании культивирования титр клеток составляет (4 ± 0,5) 109 кл/мл, цел- люлолитическая активность по методу Хен- дерсона-3 ±0,5%, КМЦ-осах. активность - 1,0-0,1 ед/мл.

Применение изобретения позволит значительно удешевить препарат активной целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца. Так, только затраты на приготовление 1,0 м3 питательной среды сокращаются от 85,12 руб. до 7,17 руб по сравнению со способом - прототипом.

Длительность выращивания сокращается на 1-2 сут, использование фильтрата культуральной жидкости позволит значительно сократить расходы на технологические нужды и объем сточных вод.

Испытания способа получения препарата активной целлюлолитической ассоциации бактерий рубца проведены в опытном цехе НПО Биотехнология в 1989 г. и подтверждены актом испытаний.

Формула изобретения

Способ получения препарата целлюлолитической ассоциации бактерий рубца, предусматривающий приготовление посевного материала на посевной среде, содержащей источники целлюлозы, органического и минерального азота в виде аммония сернокислого, соль фосфорной кислоты, редуктон, магний сернокислый.на- трий уксуснокислый, натрий изомасляно- кислый, натрий валериановокислый, натрий изовалериановокислый и воду, посев полученной культуры на производственную питательную среду, содержащую источники целлюлозы, источник органического и минерального азота в виде сернокислого аммо- ния, магний сернокислый, соль кальция, редуктон и воду, культивирование ассоциации бактерий в анаэробных условиях с последующим отделением биомассы и высушиванием ее, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости продукта, в качестве источников целлюлозы, органического азота и редуктона в питательных средах используют соответственно свекловичный жом, дрожжевой автолизат и натрий сульфид, из солей фосфорной кислоты - натрий фосфорнокислый двузамещенный, из солей кальция - кальций углекислый, при этом в каждую из сред дополнительно вносят калий хлористый, а в производственную среду дополнительно - фильтрат культуральной жидкости ассоциации бактерий, полученной после отделения биомассы в предыдущем процессе, при следующем соотношении компонентов: посевная среда:

свекловичный жом0,4-0,8 г

дрожжевой автолизат 0,02-0,06 г натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,07-0,11 г магний сернокислый 0,006-0,014 г калий хлористый0,002-0,006 г

аммоний сернокислый 0,07-0,11 г натрия сульфид0,01-0,3 г

натрий уксуснокислый 0,05-0,65мг%, натрий изомаслянокислый 6,0-10,0 мг%

натрий изовалериановокислый7,5-11,5 мг% натрий валерианово- кислый 7,5-11,5 мг%

водаДо 100 мл

и производственная среда:

свекловичный жом2,0-4,0 г

дрожжевой автолизат 0,1-0,3 г натрий фосфорнокислый

двузамещенный0,4-0,6 г

магний сернокислый 0,006-0,014 г калий хлористый0,03-0,07 г

аммоний сернокислый 0,25-0,45 г натрий сульфид0,01-0,03 г

кальций углекислый 0,1-0,3 г фильтрат культуральной жидкости20,0-30,0 мл

вода,До 100 мл

Таблица 1

Использование: микробиологическая промышленность, получение препаратов на основе бактериальных продуцентов целлю- лаз. Сущность изобретения готовят посевной материал путем культивирования целюлолитической бактериальной ассоциации на среде, содержащей свекловичный жом 0,4-0,8 г, натрий фосфорнокислый дву- замещенный 0,07-0,11 г , дрожжевой авто- лизат 0,02-0,06 г, сернокислый магний 0,06-0,014, калий хлористый 0, 002-0,006 г сернокислый аммоний 0,07-0,11 г, уксуснокислый натрий 0,05-0,65 мг, натрий изомас- лянокислый 0,6-10,0 мг, натрий изовалериановокислый 7,5-11,5 мг, натрий валериановокислый 7,5-11,5 мг, вода до 100 мл в течение 2-4 сут при 37-39°С. Получают посевной материал с титром 1-2 109 кл/мл. Полученный посевной материал пересевают на п ро из во дсТве иную среду, содержащую свекловичный жом 2,0-4,02, дрожжевой автолизат 0,01-0,3 г, аммоний сернокислый 0,25-0,45 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,4-0,6 г, магний сернокислый - 0,006-0,014 г, калий хлористый 0,03-0,07 г, натрий сернистый 0,01- 0,03 г, кальций углекислый 0,1-0,3 г, фильтрат культуральный жидкости 20,0- 30,0 мл, вода до 100 мл, и культивируют в анаэробных условиях при температуре 37- 39°С в течение 2-3 сут. Получают культу- ральную жидкость с титром 10 -1011 кл/мл, которую затем в ысушиваТот/с ухбй препарат содержит не менее 400 106кл/г, целлюлоли- тическая активность (по методу Хендерсона) - не менее 8%, КМЦ - осахаривающая активность - 35 ± 2 ед/г. 4 табл. сл С со -- кэ Ю -ч

Таблица 2

Относительные эффекты влияния уровней исследованных факторов питательной среды для

ферментации ассоциации рубца.

Таблица 3

Относительные эффекты влияния уровней исследованных факторов питательной среды для

выращивания посевного материала.

Таблица 4

Накопление ЛЖК в культуральной жидкости в процессе выращивания целлюлолитической

ассоциации бактерий рубца

Примечание, ел - кислота обнаружена в следовых количествах (менее 0,1 %).

Продолжение табл. 3