СПОСОБ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИНФЕКЦИИ МОЧЕВЫДЕЛЯЮЩИХ ПУТЕЙ У ДЕТЕЙ 3-7 ЛЕТ ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно педиатрии, и может быть использовано для скрининга детей дошкольного возраста и раннего выявления у них инфекции мочевыводящих путей.

В качестве прототипа авторы выбрали способ определения уреазной активности, предложенный в 1997 году сотрудниками клинико-биохимической лаборатории Научного Центра Урологии им. Б.У. Джарбусынова («Урология и нефрология», 1997, №4, с.13-14).

Способ основан на том, что микробы в процессе жизнедеятельности выделяют в мочу фермент - уреазу, которая имеет различную степень активности в зависимости от вида микроорганизма. При инфицировании мочи образуются микроколонии на уроэпителиальной поверхности, создающие благоприятные условия для кристаллообразования и способствующие росту камней.

Суть способа в том, что в две пробирки помещают по 2 мл исследуемой мочи. В пробирку №1 добавляют 0,4 мл 10% хлористого кальция, перемешивают, замеряют экстинкцию (оптическую плотность) против воды при 691 нм на КФК-3. В пробирку №2 добавляют 0,4 мл дистиллированной воды. Обе пробирки термостатируют при 37 градусах Цельсия в течение часа. Проводят измерение пробирок №1 и №2 сразу после термостатирования при тех же условиях.

Расчеты ведут по формуле УА=((Е2-Е1)*K*10)/100, где

Е1 - экстинкция пробы до термостатирования,

Е2 - экстинкция пробы после термостатирования в течение часа,

K - коэффициент соотношения концентрации углекислого кальция (СаСО₃) в мг % к его экстинкции (находится опытным путем по калибровочной кривой для серии разведении),

10 - коэффициент перевода мг % в ммоль/л,

100 - ММ СаСО₃.

Полученный показатель уреазной активности сравнивают с показателем нормы (0-50 ммоль/л) и при его превышении говорят о присутствии уреазообразующей микрофлоры.

Недостатком данного способа является то, что:

данная методика выполняется в пробирках и пропускная способность лаборатории достаточно низкая и не может быть использована для скрининга - профилактических и диспансерных обследований больших групп населения.

В предлагаемом авторами способе данный недостаток устранен.

Задачей настоящего изобретения явилось создание нового неинвазивного и пригодного для скрининга способа раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет фотометрическим методом.

Технический результат изобретения заключается в том, что:

с целью увеличения пропускной способности лаборатории авторами предложено выполнять исследование в 96-луночном микропланшете, что позволяет исследовать 92 пробы мочи (контроль и опыт) у 46 пациентов одновременно и восьмикратно сократить расход реактивов, таким образом снизить себестоимость анализа (фото №1).

Уреазную активность определяли у 46 детей одновременно в 96-луночном микропланшете фотометрически на микропланшетном ридере.

Для количественного определения уреазной активности мочи использовали международные единицы активности ферментов - Е/л.

Заявленный технический результат достигается путем измерения значений оптических плотностей каждой лунки после взаимодействия мочи с 10% водным раствором хлорида кальция после термостатирования в течение 1 час при температуре 37°, в 96-луночном микропланшете фотометрически на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм. Уреазную активность определяли у 46 детей одновременно.

Для исследования берется утренняя моча в сухую стерильную банку. Анализ мочи проводится не позднее 1 часа с момента взятия.

1 2 17 18 33 34 49 50 65 66 81 82 3 4 19 20 35 36 51 52 67 68 83 84 5 6 21 22 37 38 53 54 69 70 85 86 7 8 23 24 39 40 55 56 71 72 87 88 9 10 25 26 41 42 57 58 73 74 89 90 11 12 27 28 43 44 59 60 75 76 91 92 13 14 29 30 45 46 61 62 77 78 93 94 15 16 31 32 47 48 63 64 79 80 95 96

В лунку 1 вносят 0,275 мл дистиллированной воды (контроль планшета).

В лунку 2 вносят 0,25 мл дистиллированной воды+0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция (контроль реактивов).

Лунки 1 и 2 - это отрицательный контроль.

В лунку 3 вносят 0,25 мл оксалата натрия+0,025 мл дистиллированной воды; в лунку 4 вносят 0,25 мл оксалата натрия +0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция.

Лунки 3 и 4 - это положительный контроль (стандарт). На основании значений оптических плотностей строится калибровочная кривая.

Во все последующие лунки вносят пробы мочи пациентов: 5 и 6 - пробы пациента №1, 7 и 8 - №2 и т.д. (всего 46 обследованных за 1 раз).

Мочу вносят по 0,25 мл во все лунки, затем в нечетные вносят по 0,025 мл дистиллированной воды, а во все четные - по 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция. Содержимое лунок микропланшета осторожно перемешивают. Затем измеряют значение оптических плотностей фотометрически на микропланшетном ридере (микропланшетном мультидетекторе Zenyth 1100 (Австрия)) при длине волны 620 нм (фото №2).

Микропланшет заклеивают пленкой и содержимое лунок термостатируют в течение 1 часа при температуре 37°. После чего снова перемешивают содержимое лунок и измеряют значения оптических плотностей на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм. Затем рассчитывают уреазную активность мочи в Е/л по формуле

УА(Е/л)=ΔD*11655, где

УА (Е/л) - уреазная активность в (Е/л);

ΔD - разница оптической плотности опыта и контроля пробы мочи пациента после термостатирования;

11655 - коэффициент перевода на уреазную активность (получен опытным путем).

Для определения коэффициента перевода на уреазную активность мочи использовался раствор уреазы (с активностью 10000 Е/л) из коммерческого набора реагентов для определения мочевины в биологических жидкостях уреазным фенол/гипохлоритным методом (Мочевина-02-ВИТАЛ, LOT серия 0349, REF B08.02). Для расчета коэффициента перевода на уреазную активность провели опыты с пробами мочи (моча одного пациента в трехкратном повторе) в микропланшете:

Проба №1 - 0,25 мл мочи пациента №1+0,050 мл дистиллированной Н₂О;

Проба №2 - 0,25 мл мочи пациента №1+0,025 мл дистиллированной. Н₂О+0,025 мл CaCl₂;

Проба №3 - 0,25 мл мочи пациента №1+0,025 мл уреаза+0,025 мл 10% CaCl₂.

Результаты проведенного опыта приведены в таблице №1.

Таблица №1 Проведение опыта по расчету коэффициента перевода на уреазную активность мочи         Среднее D             до термостатирования D1 D2 D3 ΔD Проба №1 0,042 0,058 0,047 0,049   Проба №2 0,06 0,056 0,051 0,056   Проба №3 0,489 0,539 0,424 0,484   после термостатирования           Проба №1 0,046 0,06 0,053 0,053 0,004 Проба №2 0,242 0,164 0,180 0,195 0,139 Проба №3 1,458 1,464 1,522 1,481 0,997

Формула расчета коэффициента: K=10000/(0,997-0,139)=11655 Е/л.

Формула расчета уреазной активности в Е/л

УА(Е/л)=ΔD*11655, где

УА - уреазная активность в (Е/л);

ΔD - разница оптических плотностей проб мочи пациента после термостатирования;

11655 - коэффициент перевода на уреазную активность (получен опытным путем).

Определение биологических нормальных (референтных) величин осуществлялось в группе пациентов с медицинского осмотра в детском дошкольном учреждении (случайный выбор). Всего было обследовано 112 клинически здоровых детей 3-7 лет.

Норма 0-1621,73 Е/л (рассчитанные авторами референтные величины).

Полученный показатель уреазной активности сравнивают с показателем нормы и при его превышении говорят о присутствии уреазообразующей микрофлоры, что свидетельствует о возможности инфекции мочевыводящих путей.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1

Амбулаторная карта №19

Зелинская Ксения, 5 лет, обратилась по поводу рецидивирующего вульвита. После термостатирования проб мочи оптическая плотность контроля 0,283, оптическая плотность опыта 0,875.

УА мочи - (0,875-0,283)*11655=6889,75 Е/л

6889,75 Е/л>1621,73 Е/л

Заключаем, что инфекция мочевыводящих путей возможна.

Ребенок обследован в условиях нефрологического отделения детской областной больницы г.Твери. При бактериологическом посеве мочи высеяны микроорганизмы: кишечная палочка и энтеробактерии в диагностически значимых количествах. Ребенку был выставлен диагноз:

Вторичный дисметаболический пиелонефрит.

Пример 2

Амбулаторная карта №7

Васильева Наташа, 6 лет, обратилась по поводу резей при мочеиспускании.

После термостатирования проб мочи оптическая плотность контроля - 0,063, оптическая плотность опыта - 0,104.

УА мочи=(0,104-0,063)*11655=0,041*11655=477,855 Е/л

477,855 Е/л<1621,73 Е/л

Заключаем, что инфекция мочевыводящих путей маловероятна. Ребенок обследован у нефролога. При бактериологическом посеве мочи микрофлора высеяна не была. Клинический анализ мочи, моча по Нечипоренко в пределах нормы. УЗИ почек: без патологии. У ребенка выявили пищевую сенсибилизацию на белок яиц. Проходит лечение у аллерголога.

Список литературы

1. Меркушева, Н.В. Уреазная активность мочи у больных мочекаменной болезнью / Меркушева, Н.В., Юшина Л.В., Махонина И.А. // Урология и нефрология, 1997. С.13-14.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для скрининга детей дошкольного возраста с целью раннего выявления у них возможности инфекции мочевыводящих путей. Способ основан на методике подготовки проб мочи в лунках микропланшета, включающей термостатирование, и заключается в количественном определении уреазной активности мочи на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм, построении калибровочной кривой и вычислении уреазной активности мочи в Е/л по формуле: УА=ΔD*11655, где УА (Е/л) - уреазная активность в (Е/л); ΔD - изменение оптической плотности проб мочи пациента после термостатирования; 11655 - коэффициент перевода на уреазную активность. При значении уреазной активности мочи выше 1621,73 Е/л ребенка относят к группе риска формирования инфекции мочевыводящих путей. Использование способа позволяет увеличить пропускную способность лаборатории. 1 табл., 2 пр., 2 ил.

Способ раннего выявления инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет, заключающийся в том, что исследуют пробы мочи от 46 детей одновременно, в 96-луночный микропланшет в лунку 1 вносят 0,275 мл дистиллированной воды - отрицательный контроль планшета, в лунку 2 вносят 0,25 мл дистиллированной воды + 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция - отрицательный контроль реактивов; в лунку 3 вносят 0,25 мл оксалата натрия + 0,025 мл дистиллированной воды, а в лунку 4 вносят 0,25 мл оксалата натрия + 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция, где лунки 3 и 4 - положительный контроль; во все последующие лунки вносят пробы мочи по 0,25 мл, затем в нечетные лунки вносят по 0,025 мл дистиллированной воды, а во все четные - по 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция, содержимое лунок микропланшета перемешивают, затем измеряют значения оптических плотностей фотометрическим методом при длине волны 620 нм на микропланшетном ридере, микропланшет заклеивают пленкой и содержимое лунок термостатируют в течение 1 ч при температуре 37°C, после чего содержимое лунок снова перемешивают и измеряют оптическую плотность проб мочи, далее строят калибровочную кривую и вычисляют уреазную активность мочи в Е/л по формуле
УА(Е/л)=ΔD*11655, где
УА (Е/л) - уреазная активность в (Е/л);
ΔD - разница оптической плошости опытной пробы и контрольной пробы после термостатирования,
11655 - коэффициент перевода на уреазную активность, при значении уреазной активности мочи выше 1621,73 Е/л относят конкретного ребенка к группе риска формирования инфекции мочевыводящих путей.