СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/70 C12Q1/02 

Изобретение относится к медицине, к разделам: эпидемиологии и микробиологии. Может быть использовано для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам.

Известен способ оценки специфической активности бактериофагов (патент РФ №2296163, опубл. 27.03.2007 г.), сущность которого сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом. Специфическую активность бактериофага оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя по сравнению с контролем (монослой клеток и тест-штамм без бактериофага).

Недостатки этого метода состоят в том, что методика очень трудоемка, имеет высокую себестоимость, большой расход дорогостоящих расходных материалов - пробирки Лейтона, кожно-мышечные или легочные фибробласты эмбриона человека, бактериофага (1,8 мл), многокомпонентная среда Игла (многократная отмывка), окраска по Романовскому-Гимза, этиловый спирт 96°. Оценка интенсивности адгезии также трудоемка и при этом субъективна, проводится по трем показателям, один из которых определяется микроскопически.

Известен способ нанесения капли бактериофаговой культуры (0,01 мл) на бактериальный газон на чашке Петри - Spot-test. Учет степени лизиса микроорганизмов регистрируется по четырехкрестовой схеме: 4 и 3 креста - высокая чувствительность - полный лизис или незначительный вторичный рост; 1 и 2 креста - низкая чувствительность - полусливной рост, от 50 до 10 колоний; отрицательный - отсутствие лизиса (Н.В. Алексанина. Изучение чувствительности к бактериофагам условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей раннего возраста. / Журнал «Инфекция и иммунитет». - 2014 г. - специальный выпуск. - С. 62-63).

Следует отметить, что данная методика на твердой питательной среде не позволяет достигнуть максимально возможного взаимодействия в комплексе микроорганизм - бактериофаг, как это происходит в жидкой среде. Соответственно полученные результаты чувствительности микроорганизмов к бактериофагу интерпретировать на процессы, проходящие в человеческом организме, не совсем корректно.

Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам является методика, основанная на специфичности литического действия бактериофагов. Суточную агаровую культуру микроорганизмов засевают в пробирки с жидкой питательной средой. В одну из них добавляют специфический бактериофаг от 1 до 10 капель в зависимости от литической силы фага. Пробирки ставят в термостат на 18-20 часов, после чего по густоте роста (мутности) учитывают полное или частичное воздействие фага на бактерии по сравнению с ростом в контрольной пробирке. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под редакцией М.О. Биргера, Москва, «Медицина», 1982. - С. 118-119).

Недостатками способа является субъективная оценка результатов постановки теста - определение мутности раствора «на глаз», отсутствие возможности оценить умеренную чувствительность исследуемых микроорганизмов к бактериофагу, а также большой расход дорогостоящего бактериофага, увеличивающего стоимость исследования.

Общее для всех методов определения чувствительности микроорганизмов к специфическим бактериофагам то, что необходимо совместное культивирование микроорганизма с бактериофагом в питательной среде - микроорганизмы + бактериофаг + питательная среда (плотная или жидкая), инкубирование при температуре 37°С.

Сравнение двух методик определения чувствительности бактерий к специфическим бактериофагам (на плотной и в жидкой питательных средах) показало значительное расхождение результатов. Этот факт свидетельствует о несовершенстве существующих методик определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам. Указанные методы определения устойчивости к бактериофагам, применяемые в настоящее время бактериологическими лабораториями в практическом здравоохранении, не позволяют объективно оценить литические свойства бактериофагов, так как результаты оцениваются очень субъективно - в «крестах». Кроме того, широкое применение фаготерапии в лечении и профилактике бактериальных инфекций требует определения чувствительности к специфическим бактериофагам. Это выдвигает приоритетную задачу разработки способа, позволяющего количественно определять и оценивать чувствительность микроорганизмов к бактериофагам.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение надежности способа, достижение достоверности полученного результата за счет количественной оценки чувствительности микроорганизмов к фаговым препаратам, разработка четких цифровых значений для определения литической способности бактериофагов.

Для достижения указанного результата в заявляемом способе количественной оценки литической активности бактериофагов, включающем приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма в концентрации 1,5*10⁸ КОЕ/мл, выращенной в течение 18-24 часов при температуре 37°С, соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом, согласно изобретению, для постановки реакции применяют плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа и оценку литической активности бактериофага осуществляют по среднему значению многократных измерений оптической плотности с вычетом оптической плотности фона реакции взаимодействия компонентов, а именно при значении показателя не более 0,045±0,025 испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу, при этом значения оптической плотности контроля роста микроорганизма должны превышать средний показатель оптической плотности более чем в 2 раза, при значении показателя литической активности выше указанного, микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу.

Решение указанной задачи в предлагаемом способе заключается в совместном культивировании испытуемых микроорганизмов и специфических бактериофагов в мясо-пептонном бульоне в лунках микропланшета в пятикратной повторности. Ставят контроли: в одну лунку вносят мясо-пептонный бульон + бактериофаг - контроль стерильности и определение оптической плотности фона; в две лунки - мясо-пептонный бульон + микроорганизмы - контроль роста исследуемого микроорганизма. Культивирование проводят при температуре 37°С в течение 10-12 часов. Далее измеряют оптическую плотность на микропроцессоре Multiscan, вычисляют показатель по формуле и сравнивают с контролем роста культуры.

Для приготовления рабочей суспензии исследуемого микроорганизма используют чистую суточную агаровую культуру. Микробную массу берут бактериологической петлей с плотного питательного агара и помещают в стеклянную пробирку, содержащую 4,5 мл стерильного физиологического раствора, и тщательно гомогенизируют. Плотность инокулята, измеряя на денсиляметре, точно доводят 0,5 ЕД по МакФарланду, что соответствует 1,5*10⁸ КОЕ/мл. Исследование литической активности бактериофагов проводят в стерильных пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа. На исследование одной культуры микроорганизма (включая контроли) отводится 8 лунок одного ряда (по вертикали). В лунки A, B, C D, E, вносят 150 мкл мясо-пептонного бульона, 50 мкл испытуемого специфического бактериофага и 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов. Таким образом, испытуемый микроорганизм и специфический бактериофаг исследуют пятикратно. В лунку F вносят 150 мкл мясо-пептонного бульона и 50 мкл бактериофага - фон реакции взаимодействия этих компонентов и контроль стерильности, и в лунки G и H - 150 мкл мясо-пептонного бульона и 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов - контроль роста испытуемого микроорганизма. Планшет заклеивают пленкой и инкубируют в термостате при 37°C в течение 10-12 часов. Измеряют оптическую плотность на фотометре микропланшетного формата Multiscan FC при длине волны 450/620 нм после удаления пленки. Показатель литической активности (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) - в лунках A, B, C, D, E и вычитают оптическую плотность фона среды (ОП фона) - лунки F.

ЛА = ОП средняя - ОП фона

Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, и значения ОП контроля роста микроорганизма (лунки G, H) должны превышать показатель ОП средняя более чем в 2 раза, при этом бактериофаг оценивается как обладающий высокой литической активностью. При значении показателя ЛА выше указанного - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу, а его литическую активность - низкой.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Определение литической активности стафилококкового бактериофага к микроорганизмам Staphylococcus aureus: 2891, 2879, 2887, 2917, 2904, 2902, 2898, 2838, 2841, 2929, 2880, 2897.

Расходные материалы: мясо-пептонный бульон, испытуемый бактериофаг, стерильный 96-луночный микропланшет для иммунологических реакций, автоматический пипеточный дозатор со стерильными наконечниками, физиологический раствор.

Готовят бактериальную суспензию испытуемых штаммов микроорганизмов, физиологическим раствором доводят ее концентрацию до 0,5 ЕД по МакФарланду, что соответствует 1,5*10⁸ КОЕ/мл. С учетом количества исследуемых микроорганизмов во все лунки вносят 150 мкл мясо-пептонного бульона (можно использовать автоматический дозатор для разлива жидкостей), затем в лунки A, B, C, D, E, F, вносят 50 мкл испытуемого специфического бактериофага. Далее закапывают 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов штамма 2891 в лунки A, B, C, D, E и G, H - первого столбца; 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов штамма 2879 в лунки A, B, C, D, E и G, H - второго столбца и т.д. Лунки ряда F - контроль фона мясо-пептонного агара с бактериофагом, лунки G, H каждого столбца служат контролем роста испытуемого микроорганизма. Планшет заклеивают пленкой и инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 10-12 часов. Измеряют оптическую плотность на фотометре микропланшетного формата Multiscan FC при длине волны 450/620 нм после снятия пленки. Результаты исследования литической активности стафилококкового бактериофага в отношении испытуемых микроорганизмов Staphylococcus aureus представлены в таблице 1.

Показатель литической активности (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) - в лунках A, B, C, D, E и вычитают оптическую плотность фона среды (ОП фона) - лунки F.

ЛА = ОП средняя - ОП фона

Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, и значения ОП контроля роста микроорганизма (лунки G, H) должны превышать показатель ОП средняя более чем в 2 раза, при этом бактериофаг оценивают как обладающий высокой литической активностью. При значении показателя ЛА выше указанного (>0,07) - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу, а его литическую активность - низкой.

Таким образом, микроорганизмы Staphylococcus aureus: 2891, 2879, 2887, 2902, 2898, 2838, 2841, 2929, 2880 - чувствительные к стафилококковому бактериофагу, а микроорганизмы 2917, 2904, 2897 - устойчивые к данному фагу и не могут быть рекомендованы для фаготерапии.

Для подтверждения значимости оценки литической активности бактериофага по оптической плотности проведено экспериментальное исследование - из каждой опытной лунки микропланшета сделан высев на мясо-пептонный агар в чашки Петри. После инкубации при температуре 37°C в течение 10-12 часов подсчитано количество выросших колоний. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что штаммы, указанные как чувствительные к бактериофагу, высевались в единичных количествах, в то время как штаммы, устойчивые к действию бактериофага, давали массивный рост.

Пример 2. Определение литической активности коли-протейного бактериофага к микроорганизмам Escherichia coli: 2841, 2056, 2907, 2910, 2785, 2902, 2785, 2784, 2923, 2908, 2920, 2098.

Расходные материалы и порядок постановки реакции, аналогичный примеру 1.

Результаты исследования литической активности коли-протейного бактериофага в отношении испытуемых микроорганизмов Escherichia coli представлены в таблице 2.

Показатель литической активности бактериофага (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) - значения оптической плотности лунках A, B, C, D, E, и вычитают оптическую плотность фона среды (ОП фона) (значение оптической плотности лунки F).

ЛА = ОП средняя - ОП фона

Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, и значения ОП контроля роста микроорганизма (лунки G, H) должны превышать показатель ОП средняя более чем в 2 раза, при этом бактериофаг оценивают как обладающий высокой литической активностью. При значении показателя ЛА выше указанного (>0,07) - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу, а его литическую активность - низкой.

Таким образом, микроорганизмы Escherichia coli 2841, 2056, 2907, 2785, 2902, 2785, 2784, 2923, 2908 - чувствительные к коли-протейному бактериофагу, а микроорганизмы Escherichia coli 2910, 2920, 2098 - устойчивые к данному фагу и не могут быть рекомендованы для фаготерапии.

Для подтверждения значимости оценки литической активности бактериофага по оптической плотности также проведено экспериментальное исследование - из каждой опытной лунки микропланшета сделан высев на мясо-пептонный агар в чашки Петри. После инкубации при температуре 37°C в течение 10-12 часов подсчитано количество выросших колоний. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что микроорганизмы, указанные как чувствительные к бактериофагу, высевались в единичных количествах, в то время как устойчивые к действию бактериофага давали массивный рост.

Преимущества способа

1. Способность в жидкой питательной среде (мясо-пептонный бульон) максимально достигать условий взаимодействия комплекса «микроорганизм - бактериофаг».

2. Объективность оценки результата исследования за счет измерения оптической плотности.

3. Минимальный расход питательной среды (мясо-пептонного бульона) и бактериофага.

Способ относится к микробиологии и может применяться для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам. Способ количественной оценки литической активности бактериофагов предусматривает приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, выращенной при заданных условиях и соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом. Оценку литической активности бактериофага осуществляют по среднему значению многократных измерений оптической плотности с вычетом оптической плотности фона реакции взаимодействия компонентов. При полученном значении показателя не более 0,045±0,025 испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу. При полученном значении показателя литической активности выше указанного микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу. Изобретение позволяет повысить достоверность результата. 4 табл., 2 пр.

Способ количественной оценки литической активности бактериофагов, включающий приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма в концентрации 1,5*10⁸ КОЕ/мл, выращенной в течение 18-24 часов при температуре 37°C, соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом, отличающийся тем, что для постановки реакции применяют плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа и оценку литической активности бактериофага осуществляют по среднему значению многократных измерений оптической плотности с вычетом оптической плотности фона реакции взаимодействия компонентов, а именно, при значении показателя не более 0,045±0,025 испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу, при этом значения оптической плотности контроля роста микроорганизма должны превышать средний показатель оптической плотности более чем в 2 раза, при значении показателя литической активности выше указанного микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу.