СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/513 A61K31/194 A61P9/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и фармакологии и может быть использовано в качестве средства, обладающего эндотелиопротекторной активностью.

Известны цитопротекторы с антиоксидантным механизмом действия, способные уменьшить негативное воздействие окислительного стресса на эндотелий сосудистой стенки [Голиков А.П., Полумисков В.Ю., Михин В.П. Антиоксиданты - цитопротекторы в кардиологии // Нижегородский медицинский журнал. - 2006. - №5. - С. 143-147].

Наиболее близким аналогом изобретения является 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, который обладает выраженным эндотелиопротекторным действием на модели L-NAME (N-нитро-L-аргинин метиловый эфир) индуцированного дефицита оксида азота [Якушев В.И., Стабровская Н.В., Рагулина В.А. и др. Влияние антиоксидантов на эндотелиальную дисфункцию при моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №9. - С. 186-190].

Задачей изобретения является расширение арсенала фармакологически активных средств, обладающих способностью улучшать функциональное состояние эндотелия в условиях воздействия факторов, вызывающих эндотелиальную дисфункцию.

Технический результат - получение средства с выраженным эндотелиопротективным действием.

Сущность изобретения: применение комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой формулы

в качестве средства, обладающего эндотелиопротекторным действием.

Известны комплексные соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с сукцинатом натрия и 6-метилурацила с янтарной кислотой, которые обладают выраженной антигипоксической активностью на моделях острой гемической гипоксии, острой гистотоксической гипоксии, острой гипоксии с гиперкапнией, а также низкой токсичностью при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введениях [патент RU 2475482, 2012; патент RU 2259357, 2005].

В настоящем исследовании изучалось комплексное соединение 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой, которое обладает антиоксидантной и антигипоксической активностью на моделях острой гемической гипоксии, острой гипоксии с гиперкапнией и острой гипобарической гипоксии, а также оказывает защитно-восстановительный эффект при токсической гепатопатии, вызванной совтолом и тетрахлорметаном. Для синтеза данного соединения к 7,2 г (0,05 моль) 5-гидрокси-6-метилурацила в 250 мл N,N-диметилформамиде (ДМФА) присыпают 6,0 г (0,05 моль) янтарной кислоты. Реакционную смесь нагревают на водяной бане до 60°C и перемешивают при этой температуре 1 час. При его охлаждении выпадают кристаллы, которые отфильтровывают, промывают 10 мл спирта, сушат в вакууме и получают 10,6 г (81%) комплекса с т.пл. 337-339°C (разд.). Строение полученного соединения доказано ИК-, УФ-спектрами, ТСХ и элементным анализом [Чернышенко Ю.Н. Синтез новых производных 6-метилурацила, обладающих фармакологической активностью: диссертация … кандидата химических наук. - Уфа, 2008. - 149 с.; Чернов В.Н. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита печени в стареющем организме при экспериментальной интоксикации тетрахлорметаном: диссертация … кандидата медицинских наук. - Уфа, 2008. - 161 с.].

Для изучения эндотелиотропных эффектов фармакологических средств используются различные модели эндотелиальной дисфункции: экспериментальный сахарный диабет, экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, стресс, введение асимметричного диметиларгинина, блокаторов эндотелиальной NO-синтазы и др. Выбор патофизиологической модели эндотелиальной дисфункции, связанной с моделированием дефицита оксида азота N-нитро-L-аргинин метиловым эфиром обусловлен тем, что данная модель наиболее приближена к условиям клинической ситуации с развившимся оксидантным стрессом [Якушев В.И., Стабровская Н.В., Рагулина В.А. и др. Влияние антиоксидантов на эндотелиальную дисфункцию при моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №9. - С. 186-190].

Методы исследования.

Исследования проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 200-250 г. Были выделены 4 экспериментальные группы животных. 1-я группа (n=8) - интактные животные без признаков патологии для получения физиологических показателей. 2-я, 3-я и 4-я группы (n=8 в каждой группе) - животные, которым моделировали эндотелиальную дисфункцию. Эндотелиальная дисфункция моделировалась путем введения N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг ежедневно внутрибрюшинно в течение 7 суток. Используемая модель эндотелиальной дисфункции обладает умеренной напряженностью [Васильев А.Г., Трашков А.П., Коваленко А.П. и др. Оценка специфической фармакологической активности препарата «Унифузол» на модели эндотелиальной дисфункции, индуцированной введением N-нитро-L-аргинин метилового эфира // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2016. - Т. 79, №11. - С. 11-14]. Животные 3-й экспериментальной группы дополнительно получали изучаемое комплексное соединение 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой, которое вводили ежедневно перорально с помощью специального зонда в дозе 50 мг/кг на 2% крахмальной слизи в течение 7 суток в утренние часы. Животные 4-й экспериментальной группы дополнительно получали препарат сравнения. В качестве препарата сравнения использовали цитопротектор с антиоксидантным механизмом действия 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, выпускаемый под коммерческим названием мексидол, который вводили ежедневно, перорально в дозе 50 мг/кг в течение 7 суток. Данное соединение обладает эндотелиопротективным действием [Якушев В.И., Стабровская Н.В., Рагулина В.А. и др. Влияние антиоксидантов на эндотелиальную дисфункцию при моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №9. - С. 186-190; Воронков А.В. Эндотелиальная дисфункция и пути ее фармакологической коррекции: автореферат дис. … д-ра. мед. наук. - Волгоград, 2011]. Интактные крысы получали перорально крахмальную слизь и внутрибрюшинно физиологический раствор в соответствующих объемах. Пересчет дозировки препаратов для животных осуществляли с учетом массы и площади поверхности тела согласно рекомендациям, представленным в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (М.; 2005). На 8 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг подкожно) у подопытных животных производили забор крови путем транскутанной пункции сердца в вакуумную систему.

Эндотелиопротективное действие комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой изучали, анализируя гематологические маркеры эндотелиальной дисфункции. Для этого определяли в крови подопытных крыс содержание оксида азота, эндотелина I типа и количество циркулирующих эндотелиальных клеток. За неделю до эксперимента животных переводили на низконитратную диету, с исключением других внешних источников нитратов.

Определение уровня эндотелина-1 в плазме крови проводили иммуноферментным методом с использованием набора Endotelin (1-21), фирмы «Biomedica» (Австрия) на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2100. Собранные образцы крови обрабатывали 7,5-миллимолярным раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли (ЭДТА-Na), помещали пробы на лед и затем центрифугировали в течение 10 минут при 2000 об/мин при температуре 4°С. При необходимости до проведения анализа плазму замораживали и хранили при температуре - 20°C. Набор Endotelin (1-21) включает очищенные поликлональные захватывающие антитела и моноклональные детектирующие антитела, специфичные к эндотелину. На первом этапе проба плазмы и детектирующие антитела одновременно вносятся в ячейки. Эндотелин 1, присутствующий в образце плазмы, связывается с захватывающими антителами в ячейках и образует сэндвич-комплекс с детектирующими антителами. После промывки ячеек и удаления неспецифически связанного материала в ячейки добавляли комплекс из пироксидазы с антителами, который позволяет обнаружить связанные антитела. После удаления несвязавшегося конъюгата в ячейки вносили ферментный субстрат - 3,3-5,5 - Tetramethyl benzidine / Hydrogen Peroxide. По интенсивности развивающейся окраски, которая прямо пропорциональна содержанию эндотелина (1-21) в пробе плазмы крови, судили об уровне эндотелина [Kinugawa Т., Kato М., Ogino К. [et al.] Plasma Endothelin-1 levels and clinical correlates in patients with chronic heart failure // J. Card. Fail. - 2003. - V. 9 (4). - P. 318-324].

О содержании оксида азота (NO) в плазме крови судили по количеству стабильных конечных метаболитов NO, а именно NO₂^-+NO₃^- (UNO_X). Принцип метода заключается в одномоментном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлорида ванадия (VCl₃) и реакции диазотирования образовавшимся нитритом сульфаниламида с развитием розовой окраски. Максимум полосы поглощения образующегося соединения лежит при длине волны 540 им. Определение нитрит иона производили после депротеинизации: к 1 мл плазмы крови добавляли двукратный избыток 96% этилового спирта, образующийся осадок удаляли центрифугированием при 3000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,1 раствор N-нафтил-этилендиамина в воде) и раствора II (2% раствор сульфаниламида в 5% HCl). Полное растворение достигается при нагревании, после которого каждый раствор фильтруют. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°C в течение нескольких месяцев. Раствор I и раствор II объединяются непосредственно перед проведением исследования. Для приготовления раствора хлорида ванадия (III) для предотвращения гидролиза 200 мг VCl₃ растворяли в 25 мл 1М HCl с последующим фильтрованием через мелкопористый стеклянный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор нитрита натрия (NaNO₂). Перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для получения растворов NaNO₂ с концентрациями 5; 10; 20; 30; 50; 60; 70; 80; 90; 100 мкМ. Готовили серию из 10 пробирок, содержащих по 1,0 мл растворов NaNO₂ с вышеприведенными концентрациями, а затем последовательно добавляли 1,0 мл хлорида ванадия и 1,0 мл реактива Грисса. Далее пробы помещали на водяную баню при температуре 37°C на 30 минут. Оптическую плотность измеряли после охлаждения проб до комнатной температуры на спектрофотометре СФ 26 при длине волны 540 нм в кюветах с расстоянием между светопропускающими гранями 1,0 см. По полученным оптическим плотностям и известным концентрациям строили калибровочный график. Определение содержания суммы NO₂^-+NO₃^- в плазме проводили аналогично, соблюдая те же объемы реагентов, последовательность операций, временной и температурный режим, внося 1,0 мл депротеинизированной плазмы вместо стандартного раствора нитрита натрия. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из воды и смеси для депротеинизации. Количество нитрит-иона рассчитывали в мкмолях по калибровочной кривой [Метельская В.А., Туманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №6. - С. 15-18].

Количество циркулирующих десквамированных эндотелиальных клеток (ЦЭК) определяли по методу, основанному на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью аденозиндифосфата (АДФ). Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали 10 минут при 1000 оборотов в минуту. Затем 1 мл плазмы смешивали с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ) в концентрации 1 мг/мл. Полученную смесь перемешивали в течение 10 минут, аккуратно встряхивая пробирки. Затем вновь центрифугировали в прежнем режиме для удаления агрегатов тромбоцитов. Свободный от тромбоцитов поверхностный слой переносили в другую пробирку и центрифугировали при 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут для осаждения эндотелиальных клеток. Надосадочную плазму аккуратно удаляли, а полученный осадок суспендировали в 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и перемешивали стеклянной палочкой. Готовой суспензией заполняли камеру Горяева, количество клеток подсчитывали в 2-х сетках методом фазово-контрастной микроскопии.

Учитывая соотношение между количеством клеток в сетке и объемом камеры Горяева, объема полученной суспензии и объема плазмы, при подсчете количества эндотелиальных клеток результат умножали на 10⁴/л [Hladovec J., Prerovske I., Stanek V. et.al. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris // Klin. Wochenshr. - 1978. - Vol. 56. - P. 1033-1036].

Обработку полученных результатов проводили с применением методов вариационной статистики. После проверки нормальности распределения изучаемых параметров в сравниваемых группах тестом Shapiro-Wilk определяли средние величины (М), ошибку средних величин (m) при соответствии распределения признака закону нормального с расчетом сравнения групп показателей по критерию Стьюдента (t). Минимальный уровень статистической значимости различий верифицировали при р<0,05. Математическую обработку выполняли на компьютере с применением стандартных пакетов программы Statistica 6.0 (Stat Soft).

Результаты исследования

Изучение влияния комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой на гематологические маркеры эндотелиальной дисфункции, вызванной введением L-NAME.

Введение крысам N-нитро-L-аргинин метилового эфира в течение 7 суток вызвало структурно-функциональные нарушения эндотелия сосудов. Система синтеза оксида азота играет ключевую роль в функционировании эндотелия и является наиболее уязвимой к действию различных повреждающих агентов. Продукция оксида азота in vivo достоверно отражает состояние эндотелиозависимой вазомоторной функции и снижение NO-синтазной активности эндотелиальной NO-синтазы неблагоприятно влияет на морфологическое состояние эндотелия [Максимович Н.Е. Роль оксида азота нейронального и экстрнейронального происхождения в повреждении эндотелия и формирования его дисфункции при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2004. - Т.3. - С. 63-68]. Установлено, что L-NAME-индуцированная дисфункция эндотелия у крыс сопровождалась угнетением продукции оксида азота, который является основным вазодилататором, и одновременным увеличением синтеза эндотелина I типа, который является основным вазоконстриктором (таблица). Содержание оксида азота уменьшилось в 2,83 раза (р<0,001), а уровень эндотелина I типа увеличился в 1,87 раза (р<0,001) в сравнении с интактными животными. Данные морфологического анализа крови крыс указывали на активацию процессов клеточной гибели эндотелиоцитов, так как количество ЦЭК на фоне введения L-NAME увеличилось в 4,78 раза (р<0,001). Таким образом, можно заключить, что данная модель дисфункции эндотелия, вызванная введением L-NAME в течение 7 дней, сопровождалась значительным снижением вазодилатирующего потенциала эндотелия и увеличением продукции вазоконстрикторных соединений, а также явлениями десквамации эндотелия и поэтому может быть использована для оценки эндотелиопротекторных свойств фармакологических средств. Проводимая экспериментальная терапия комплексным соединением 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой привела к статистически достоверной нормализации всех изучаемых показателей функционального состояния эндотелия подопытных животных (таблица). На фоне введения комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой продукция оксида азота увеличилась в 1,5 раза (р<0,05) с одновременным ингибированием секреции эндотелина I типа в 1,4 раза (р<0,05), а количество ЦЭК снизилось в 2,01 раза (р<0,05) в сравнении с группой животных, получавших только L-NAME. Мексидол продемонстрировал эндотелиопротекторное действие, увеличивая продукцию оксида азота в 1,78 раза (р<0,05), снижая количество эндотелии I типа в 1,3 раза (р<0,05) и десквамированных клеток в 1,82 раза (р<0,05) в сравнении с группой животных, получавших только L-NAME.

Таким образом, по результатам проведенного исследования было установлено, что комплексное соединение 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой оказывает эндотелиопротекторное действие, сравнимое с эффектом мексидола. Следует отметить, что на фоне применения мексидола изучаемые маркеры эндотелиальной дисфункции не достигали уровня интактных животных, а при использовании комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой уровень эндотелина I типа приближался к показателям интактных животных.

Примечание: * - достоверность по сравнению с интактной группой (* - различие достоверно р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001)

^ - достоверность по сравнению с группой животных получавших L-NAME (^ - различие достоверно р<0,05; ^^ - р<0,01; ^^^ - р<0,001)

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой применение комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой формулы

в качестве средства, обладающего эндотелиопротекторным действием. Изобретение расширяет арсенал биологически активных веществ, обладающих способностью нормализовать функциональную активность эндотелиоцитов. 1 табл.

Применение комплексного соединения 5-гидрокси-6-метилурацила с янтарной кислотой формулы

в качестве средства, обладающего эндотелиопротекторным действием.