ШТАММ Gluconacetobacter sucrofermentans -ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в медицине, пищевой и фармацевтической промышленностях.

Известен штамм бактерий Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547), образующий при культивировании в статических условиях в течение 7 суток на среде HS 2,17 г/л бактериальной целлюлозы, на селективных средах 4,73-6,67 г/л бактериальной целлюлозы [Патент №2464307].

Предлагается применение штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 в качестве продуцента бактериальной целлюлозы для использования в медицине, пищевой и фармацевтической промышленностях.

Техническим результатом изобретения является штамм Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 (ВКПМ В-11267), продуцент бактериальной целлюлозы.

Штамм Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 (ВКПМ В-11267) получен из чайного гриба с последующей селекцией на основе естественного отбора в ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева».

Штамм Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 идентифицирован по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Штамм - облигатный аэроб, клетки цилиндрические с закругленными концами размерами 0,6-1,2×1-3 мкм, некоторые слегка изогнуты, расположены одиночно, попарно и в коротких цепочках; спор не образуют; грамотрицательные, подвижные. На фиг.1 представлены клетки бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110, окрашенные по Граму.

Штамм идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК.

При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, получена собранная нуклеотидная последовательность для штамма. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. По данным анализа генов, кодирующих 16S рРНК, построено филогенетическое дерево Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 с гомологичными штаммами, представленное на фиг.2. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, штамм наиболее близок к виду Gluconacetobacter sucrofermentans.

Штамм хорошо растет на агаризованных средах. На агаризованной среде с глюкозой (состав (г/л): глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 10,0; пептон - 7,0; лимонная кислота - 0,2; уксусная кислота - 1,5 мл; агар - 15,0; мел - 0,5; этанол -10,0 мл. pH среды 5,0-6,0) и среде YE (состав (г/л): дрожжевой экстракт - 30,0; этанол - 20,0, агар - 20,0. pH среды 5,0-6,0) на третьи сутки роста колонии мелкие круглые диаметром 1 мм светло-бежевого цвета. На пятые сутки культивирования диаметр колоний увеличивается до 2-4 мм. На агаризованной среде с мелом колонии круглые, диаметром 1 мм, белого цвета, окруженные прозрачным ореолом. На жидких питательных средах с сахарозой и глюкозой в статических условиях образуется гель-пленка бактериальной целлюлозы, в динамических условиях - хлопьевидные структуры.

Штамм культивируют в статических и динамических условиях на качалке при 250 об/мин и температуре 30°C в среде HS (Hestrin, Schramm, 1954) следующего состава, г/л: D-глюкоза - 20,0; дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 5,0; Na₂PHO₄ - 2,7; лимонная кислота - 1,15. pH среды - 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Количество бактериальной целлюлозы, образующееся на пятые сутки культивирования на среде HS в статических условиях - 2,75 г/л, в динамических условиях - 3,1 г/л. На среде с мелассой образуется 2,5 г/л БЦ в статических условиях и 4,0 г/л БЦ в динамических условиях. На фильтрате нативной барды образуется 3,5 г/л БЦ в статических условиях и 6,8 г/л БЦ в динамических условиях.

Культура Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 может расти без добавления уксусной кислоты. Штамм растет при pH от 2,5 до 6,5, оптимальным pH является интервал от 4,0 до 6,0.

Пример 1: Культуру штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 выращивают в течение 3-5 суток в статических условиях в открытых емкостях на среде HS (Hestrin, Schramm, 1954) следующего состава, г/л: D-глюкоза - 20,0; дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 5,0; Na₂PHO₄ - 2,7; лимонная кислота - 1,15. pH среды - 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывали 0,1 н. раствором NaOH при 80°C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяли 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80°C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяли весовым методом. Масса сухой БЦ составляет 2,75 г/л.

Пример 2: Культуру штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 выращивают в течение 3-5 суток в статических условиях открытых емкостях на среде с мелассой следующего состава, г/л: свекловичная меласса - 70,0; пептон - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; этанол - 7,0. pH среды - 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывали 0,1 н. раствором NaOH при 80°C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяли 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80°C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяли весовым методом. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой БЦ составляет 2,5 г/л.

Пример 3: Культуру штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 выращивают в течение 3-5 суток в статических условиях открытых емкостях на фильтрате послеспиртовой барды. pH среды - 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывали 0,1 н. раствором NaOH при 80°C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяли 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80°C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяли весовым методом. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой БЦ составляет 3,5 г/л.

Пример 4: Культуру штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 выращивают в течение 3-5 суток в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды HS следующего состава, г/л: D-глюкоза - 20,0; дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 5,0; Na₂PHO₄ - 2,7; лимонная кислота - 1,15. pH среды - 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывали 0,1 н. раствором NaOH при 80°C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяли 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80°С до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяли весовым методом. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой БЦ составляет 3,1 г/л.

Пример 5: Культуру штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 выращивают в течение 3-5 суток в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30°С в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды среды с мелассой следующего состава, г/л: свекловичная меласса - 70,0; пептон - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; этанол - 7,0. pH среды - 6,0. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывали 0,1 н. раствором NaOH при 80°C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяли 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80°C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяли весовым методом. После удаления клеток и культуральной среды масса сухой БЦ составляет 4,0 г/л.

Пример 6: Культуру штамма Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 выращивают в течение 3-5 суток в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл фильтрата послеспиртовой барды. pH среды - 6,0. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывали 0,1 н. раствором NaOH при 80°C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяли 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80°C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяли весовым методом. После удаления клеток и культуральной среды масса сухой БЦ составляет 6,8 г/л.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 является продуцентом бактериальной целлюлозы. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером штамм Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 и может быть использован в медицине, пищевой и фармацевтической промышленностях. Изобретение позволяет повысить выход бактериальной целлюлозы. 2 ил., 6 пр.

Штамм бактерии Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 - продуцент бактериальной целлюлозы.