Способ получения бактериальной целлюлозы при совместном культивировании штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides Российский патент 2022 года по МПК C12P19/04 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области микробиологического получения бактериальной целлюлозы, и может быть использовано в медицине, промышленности и технике для получения бактериальной целлюлозы.

Бактериальная целлюлоза является гомополисахаридом, отличающимся от аналога растительного происхождения высокой степенью кристалличности, хорошей биосовместимостью, чистотой и т.д. Однако основной проблемой, не решенной до настоящего времени, остается сравнительно невысокий выход данного полимера.

Согласно литературным данным увеличить выход полимера можно путем совместного культивирования нескольких штаммов. Многие биосинтетические гены сохраняют молчание и не экспрессируются in vitro, тем самым серьезно ограничивая химическое разнообразие микробных соединений, которые могут быть получены путем ферментации. В противоположность этому, совместное культивирование двух или более различных микроорганизмов имитирует реальную «ситуацию», когда микроорганизмы сосуществуют в сложных микробных сообществах. Доказано, что конкуренция или антагонизм, которые возникают во время совместного культивирования, приводят к значительному увеличению существующих соединений и/ или к накоплению новых соединений, которые не обнаруживаются в аксиальных культурах штамма-продуцента.

Так, показано, что совместное культивирование бактерий G. xylinus и полисахаридообразующих молочнокислых бактерий Lactobacillus mali на среде с сахарозой увеличивает количество бактериальной целлюлозы с 1,4 г/л до 4,2 г/л соответственно (Seto A. Effective cellulose production by a coculture of Gluconacetobacter xylinus and Lactobacillus mali / A. Seto, Y. Saito // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – V. 73, № 4. – P. 915-920).

Имеются сведения о положительном влиянии молочной кислоты на синтез бактериальной целлюлозы бактерией A. xylinum ssp. sucrofermentous BPR2001. Лактат стимулирует рост клеток на раннем этапе развития культуры. Предполагается, что он действует как ускоритель цикла Кребса, в результате чего повышается образование целлюлозы и рост клеток (Mikkelsen D. Influence of different carbon sources on bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus strain ATCC 53524 / D. Mikkelsen, B. M.  Flanagan, G. A.  Dykes, M. J. Gidley // J Appl Microbiol. – 2009. – Vol. 107. – P. 576-583).

Из уровня техники известны способы получения бактериальной целлюлозы, включающие культивирование бактерий на непищевых средах и средах, состоящих из отходов биотехнологических производств (RU 2536973, МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01, опубл. 27.12.2014; RU 2597291, МПК C12N 1/22, C12P 19/04, опубл. 10.09.2016).

Известен способ получения бактериальной целлюлозы, заключающийся в том, что штамм бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110 культивируют на нативной молочной сыворотке в течение 3-5 суток при температуре 28-30°C с последующим отделением полученной бактериальной целлюлозы от культуральной среды (RU 253697, МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01, опубл. 27.12.2014).

Масса сухой бактериальной целлюлозы в известном решении составляет 2,6 г/л при статическом культивировании и 5,5 г/л при динамическом культивировании.

Известен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование симбиотической культуры Medusomyces gisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка (RU 2597291, МПК C12N 1/22, C12P 19/04, опубл. 10.09.2016).

Недостатком данного решения является дополнительные расходы на процесс ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья.

Из уровня техники не известно получение бактериальной целлюлозы при совместном культивировании штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides.

Технический результат, при использовании заявленного изобретения, заключается в увеличении в 1,5-2 раза выхода бактериальной целлюлозы, а также обеспечить утилизацию технологического отхода сахарной промышленности – мелассы без внесения дополнительных источников питания.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения бактериальной целлюлозы путем совместного культивирования штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides включает получение бактериальной целлюлозы путем совместного культивирования штаммов штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides ВКМ В-2317Д на мелассной среде в статических и динамических условиях в течение 3-5 суток при температуре 28-30°С, отделение бактериальной целлюлозы от культуральной среды и высушивание при температуры 80°С до постоянной массы.

На чертеже представлена гель-пленка бактериальной целлюлозы, образуемая при совместном культивировании штаммов на поверхности питательной среды.

Способ осуществляют следующим образом.

Особенностью предлагаемого способа является совместное культивирование штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans и штамма продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides.

В качестве питательной среды выбрана жидкая мелассная среда. Меласса представляет собой побочный продукт конечной стадии кристаллизации в процессе производства сахара, она является одним из наиболее экономичных источников углерода в микробной промышленности. Кроме того, выбор среды обусловлен тем, что оба штамма хорошо растут на средах с мелассой, образуя соответствующие им полисахариды.

В настоящее время бактерии группы Gluconacetobacter xylinus перенесены в новый род Komagataeibacter, первоначально названный Komagatabacter (K. xylinus, K. hansenii, K. europaeus, K. oboediens, K. intermedius, K. swingsii, K. rhaeticus, K. saccharivorans, K. nataicola, K. kombuchae, K. sucrofermentans, K. kakiaceti, K. medellinensis, K. maltaceti) (Yamada et al., 2012; Yamada, 2014; Ревин, 2020).

В качестве продуцента бактериальной целлюлозы в заявленном изобретении использовали штамм Komagataeibacter sucrafermentans Н-110, который был выделен на кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии Национального исследовательского Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва и депонирован в ВКПМ под номером В-11267.

В качестве продуцента декстрана в заявленном изобретении использовали штамм Leuconostoc mesenteroides В-2317Д из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ).

Бактерии Komagataeibacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 и Leuconostoc mesenteroides ВКМ В-2317Д культивируют на мелассной среде с pH 5 при температуре 28±2°C в течение 3-5 суток, после чего гель-пленку бактериальной целлюлозы (ГПБЦ) или хлопья бактериальной целлюлозы отделяют от культуральной среды.

Пример 1. Штаммы продуценты бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 и декстрана Leuconostoc mesenteroides ВКМ В-2317Д выращивают в течение 5 суток в статических условиях в открытых емкостях с мелассной средой.

Полученную ГПБЦ обрабатывают 0,1Н раствором NaOH при температуре 80°C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальной целлюлозы отмывают дистиллированной водой, затем обрабатывают 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова отмывают водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее ГПБЦ высушивают при температуре 80°C до постоянной массы. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 4,5 г/л.

Пример 2. Штаммы продуценты бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 и декстрана Leuconostoc mesenteroides ВКМ В-2317Д выращивают в течение 3 суток в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 28±2°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл мелассной среды. Полученную бактериальную целлюлозу обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при температуре 80 °C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальной целлюлозы отмывают дистиллированной водой, затем обрабатывают 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова отмывают водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее бактериальную целлюлозу высушивают при температуре 80°C до постоянной массы. После удаления клеток и культуральной среды масса сухой бактериальной целлюлозы на третьи сутки культивирования составляет 6,0 г/л.

Результаты представлены на чертеже.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет увеличить выхода бактериальной целлюлозы с 2,64 г/л до 6,0 г/л, снизить себестоимость получения полимера и обеспечить утилизацию технологического отхода сахарной промышленности без внесения дополнительных источников питания. Способ позволяет получать бактериальную целлюлозу в статических и динамических условиях в виде гель-пленки и суспензии.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий совместное культивирование штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides ВКМ В-2317Д на мелассной среде в статических и динамических условиях в течение 3-5 суток при температуре 28-30°С, отделение бактериальной целлюлозы от культуральной среды, высушивание при температуре 80°С до постоянной массы. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта в виде гель-пленки и суспензии и утилизацию технологического отхода сахарной промышленности – мелассы. 1 ил., 2 пр.

Способ получения бактериальной целлюлозы путем совместного культивирования штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides, включающий получение бактериальной целлюлозы путем совместного культивирования штаммов - штамма продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 со штаммом продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides ВКМ В-2317Д на мелассной среде в статических и динамических условиях в течение 3-5 суток при температуре 28-30°С, отделение бактериальной целлюлозы от культуральной среды и высушивание при температуре 80°С до постоянной массы.