ШТАММ БАКТЕРИИ CLUCONACETOBACTER HANSENII GH-1/2008 - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии, касается нового штамма GH-1/2008 Gluconacetobacter hansenii и может быть использовано в медицине, в пищевой и фармацевтической промышленностях.

Целлюлоза синтезируется не только растениями, водорослями, но и некоторыми прокариотами, в том числе и родам Gluconacetobacter [M.Shoda, Y.Sugano. Recent advances in bacterial cellulose production, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10 (2005), 1-8].

Молекулы бактериальной целлюлозы соединены между собой β-1,4-гликозидными связями в виде длинной цепочки. Структура бактериальной целлюлозы очень похожа на структуру целлюлозы растений, но меньше по числу глюкозных остатков, а следовательно, меньше по длине самих молекул [W.Czajia, A.Krystynowicz, S. Bielecki, R.M. Brown Jr. Microbial cellulose - The natural power to heal wounds, Biomaterials, 27 (2006), 145-151].

С помощью рентгеноструктурного анализа установлено, что молекулы бактериальной целлюлозы, синтезируемые бактериями из рода Gluconacetobacter, имеют нитевидную форму. Эти нитевидные молекулы объединяются в мицеллы и формируют микрофибриллы с диаметром 1,5-2 нм. Микрофибриллы объединяются в макрофибриллы с диаметром 50-100 нм. Макрофибриллы бактериальной целлюлозы меньше по размеру в сравнении с таковыми молекулами растений. Длина бактериальной целлюлозы от 1 до 9 µм [Stanislaw Bielecki. Bacterial cellulose/ Alina Krystynowicz, Halina Kalinowska. Institute of Technical Biochemistry, Technical University of Lodz, Stefanowskiego, 2005, c.41].

В настоящее время известно много продуктов на основе бактериальной целлюлозы. В пищевой промышленности на основе целлюлозы получают традиционный продукт "Nata-de Coco", известный в Азии [A. Budhiono, В. Rosidi, H. Taher, M.Iguchi, Kinetic aspects of bacterial cellulose formation in Nata-de-coco culture system, Carbohydra. Polym. 40 (1999) 137 - 143], а также пищевые волокна [S.R. Stephens, J.A. Westland, A.N. Neogi, Method of using bacterial cellulose as a dietary fiber component. US patent 4960763 (1990)]. В медицине используют для получения искусственной кожи [L.F.X. Farah, Process of the preparation of cellulose film, cellulose film produced thereby, artificial skin graft and its use. US patent 4912049 (1990)]. Известны и другие направления использования бактериальной целлюлозы: продукт компании Xylos Corp. (США) - Prima Cel^TM, продукты Biofill^TM и Bioprocess^TM компании Fzmb GmbH Германии [P.R. Chawla et al.: Fermentative Production of Microbial cellulose, Food Technol. Biotechnol. 47 (2) 107-124 (2009)].

В настоящее время микробиологической промышленностью не освоено производство пищевых и фармацевтических препаратов на основе штаммов Gluconacetobacter hansenii. Отсутствие работ по созданию биотехнологии на основе штаммов вида Gluconacetobacter hansenii сдерживает возможности получения на их основе пищевых и фармацевтических препаратов.

Предлагается применение штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 в качестве продуцента бактериальной целлюлозы, используемый в медицине, в пищевой и фармацевтической промышленностях.

Техническим результатом изобретения является штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547), продуцент бактериальной целлюлозы.

Штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547) получен путем многоступенчатого скрининга в ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ) из культуры «чайного кваса».

Штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 идентифицирован по морфологическим, культурально-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки:

Штамм - облигатный аэроб, клетки цилиндрические размерами 0,6-1,2×1-3 мкм, расположенные поодиночке, в парах, в коротких цепочках или в небольших кластерах [Фиг.1]; спор не образуют; грамотрицательный, клетки подвижные; колонии бледные, пигменты не продуцирует.

Штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 ВКПМ В-10547 на различных питательных средах лучше образует бактериальную целлюлозу на среде, содержащей сахарозу, чем на среде, содержащей глюкозу. Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 не растет на среде с 3% этанола и в присутствии 4-8% уксусной кислоты. Этанол является стимулятором синтеза целлюлозы при концентрации 0,3-1,5%, но при более высоких концентрациях ингибирует процесс биосинтеза целлюлозы. Стимулятором синтеза целлюлозы является кокосовое молоко при концентрации менее 0,5%.

Клетки штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 могут расти без добавления уксусной кислоты. Штамм растет при рН от 2.5 до 6.5, оптимальным рН является интервал от 4.0 до 6.0.

Штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 ВКПМ В-10547 плохо растет на плотных питательных средах, содержание агара в плотной среде не должно быть выше 15 г/л [Фиг.2].

Оптимальной средой для роста и размножения штамма является питательная среда следующего состава (г/л): сахароза - 30 г, (NH₄)₂SO₄ - 3 г, K₂НРO₄ - 2 г, дрожжевой экстракт - 5 г, Na₂HPO₄ - 2,7 г, моногидрат лимонной кислоты - 1,15 г, спирт 1%, кокосовое молоко - 0,1%, вода - 1000 мл.

Штамм идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК.

При секвенировании вариабельных участков 16S РНК получена собранная нуклеотидная последовательность для штамма:

Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК штамм наиболее близок к виду Gluconacetobacter hansenii (99%).

Штамм растет на известных средах, рекомендуемых для рода Gluconacetobacter: HS (глюкоза: 20 г, пептон: 5 г, дрожжевой экстракт: 5 г, Na₂HPO₄: 2,7, моногидрат лимонной кислоты: 1,15, вода 1000 мл), GY (глюкоза: 100 г, дрожжевой экстракт: 10 г, вода: 1000 мл) [Don J. Brenner, Noel R.Krieg, James T.Staley. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology - second edition - volume 2 - part C- The Alpha -, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria. - Spinger 2005 - p.41-96.]. При культивировании в течение 7 суток на среде HS биомасса сухой полученной пленки составляет 2,17 г/л, на среде GY составляет 6,83 г/л.

Методом атомно-силовой микроскопии изучена структура пленки бактериальной целлюлозы, синтезируемой штаммом Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008. Установлено, что штамм способен образовывать тонкие нити полимера целлюлозы размером 0,5-3 нм с иммобилизованными на них клетками продуцента [Фиг.3].

Для получения пленок с различными биомассами можно использовать следующие селективные среды:

Среда Н0: сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, уксусная кислота 9%: до рН 4.62, вода: 1000 мл.

Среда H1: сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, вода: 1000 мл.

Среда Н2: сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, уксусная кислота 9% до рН 4.62, спирт 1%, вода: 1000 мл.

Среда Н3: фруктоза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, вода: 1000 мл.

Среда Н4: сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, кокосовое молоко: 1 г, вода: 1000 мл.

Среда Н5: сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, кокосовое молоко: 1 г, спирт 1%, вода: 1000 мл.

Среда Т1: cахароза: 30 г, черный чайный экстракт: 4 г, вода 1000 мл.

Среда А1: сахароза: 30 г, трутовик лакированный (Линьчжи) 65%+ кодонопсис мелковолосистый 35%: 4 г, вода 1000 мл.

Среда А5 сахароза: 30 г, Adenosma glutinosum 90%+ лакрица 10%: 4 г, вода 1000 мл.

Среда А7: сахароза: 30 г, горец многоцветковый: 4 г, вода 1000 мл.

Среда А12: сахароза: 30 г, кукурузные рыльца: 4 г, вода 1000 мл.

На фиг.1-8 представлены следующие иллюстрации:

Фиг.1. Морфология клетки и микроструктура волокна целлюлозы штамма под атомно-силовым и световым микроскопами

1a - под световым микроскопом

1б, 1в - под атомно-силовым микроскопом

А - клетки бактерии Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 ВКПМ В-10547;

Б - волокна целлюлозы.

Фиг.2. Характер роста штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 В-10547 на полужидкой и жидкой средах

2а - на полужидкой среде

2б - на жидкой среде.

Фиг.3. Микроструктура волокна целлюлозы штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 В-10547 в 2D и 3D моделях

3а - 2D модель

3б - 3D модель.

Фиг.4. Пленка Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, полученная при культивировании на среде А 12 в течение 7 суток.

Фиг.5. Пленка Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, полученная при культивировании на среде А7 в течение 7 суток.

Фиг.6. Пленка Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, полученная при культивировании на среде H1 в течение 7 суток.

Фиг.7. Пленка Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, полученная при культивировании на среде Н4 в течение 7 суток.

Фиг.8. Пленка Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, полученная при культивировании на среде Н5 в течение 7 суток.

Пример 1: Культуру штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 выращивают в течение 3-7 суток на среде А12 (сахароза: 30 г, кукурузные рыльца: 4 г, вода 1000 мл) при 28±2°С. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при 0.5 атм (110°С) в течение 20 минут. После окончания культивирования полученную пленку отделяют от питательной среды, добавляют дистиллированную воду в отношении 1:10 (1 г сырой пленки:10 мл дистиллированной воды) и стерилизуют в автоклаве при 1 атм (121°С) в течение 5 минут. Пленки могут долго сохраняться в дистиллированной воде. При такой форме хранения пленки питательную среду, на которой выращивали штамм, не используют. Биомасса полученной пленки составляет 4.73 г/л [Фиг.4].

Пример 2: Культуру штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 выращивают в течение 3-7 суток на среде А7 (сахароза: 30 г, горец многоцветковый: 4 г, вода 1000 мл.) при 28±2°С. Питательную среду стерилизуют в автоклаве при 0.5 атм (110°С) в течение 20 минут. После окончания культивирования полученную пленку отделяют от питательной среды, добавляют дистиллированную воду в отношении 1:10 (1 г сырой пленки:10 мл дистиллированной воды) и стерилизуют в автоклаве при 1 атм (121°С) в течение 5 минут. Пленки могут долго сохраняться в дистиллированной воде. При такой форме хранения пленки питательную среду, на которой выращивали штамм, не используют. Биомасса полученной пленки составляет 4.93 г/л при культивировании в течение 7 суток [Фиг.5].

Пример 3: Культуру штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 выращивают в течение 7-21 суток на среде H1 (сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, вода: 1000 мл) при 28±2°С. Питательную среду стерилизуют в автоклаве при 0.5 атм (110°С) в течение 20 минут. После окончания культивирования полученную пленку отделяют от питательной среды, промывают под проточной водой. После промывания полученные пленки нагревают в растворе NaOH 0,5H в течение 20 минут при температуре 80°С для уничтожения и удаления клеток. Для нейтрализации NaOH 0.5H используют 0.5H уксусную кислоту. Рекомендуется стерилизовать полученные пленки в автоклаве при 1 атм (121 градусов) в течение 15 минут. До стерилизации добавляют дистиллированную воду в отношении 1:10 (1 г сырой пленки:10 мл дистиллированной воды). Пленки сохраняют в дистиллированной воде или высушивают до постоянной массы. Биомасса полученной пленки составляет 5.57 г/л при культивировании в течение 7 суток [фиг.6].

Пример 4: Культуру штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 выращивают в течение 7-21 суток на среде Н4 (сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, кокосовое молоко: 1 г, вода: 1000 мл) при 28±2°С. Питательную среду стерилизуют в автоклаве при 0.5 атм (110°С) в течение 20 минут. После окончания культивирования полученную пленку отделяют от питательной среды, промывают под проточной водой. После промывания полученные пленки нагревают в растворе NaOH 0,5H в течение 20 минут при температуре 80°С для уничтожения и удаления клеток. Для нейтрализации NaOH 0,5Н используют раствор 0.5Н уксусной кислоты. Рекомендуют стерилизовать полученные пленки в автоклаве при 1 атм (121°С) в течение 15 минут. До стерилизации добавляют дистиллированную воду в отношении 1:10 (1 г сырой пленки:10 мл дистиллированной воды). Пленки сохраняют в дистиллированной воде или высушивают до постоянной массы. Биомасса полученной пленки составляет 5.17 г/л при культивировании в течение 7 суток [фиг.7].

Пример 5: Культуру штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 выращивают в течение 7-21 суток на среде Н5 (сахароза: 30 г, Nа₂НРO₄: 2.7 г, K₂НРO₄: 2 г, (NH₄)₂SO₄: 3 г, дрожжевой экстракт: 5 г, лимонная кислота: 1,15 г, кокосовое молоко: 1 г, спирт 1%, вода: 1000 мл) при 28±2°С. Спирт добавляют после стерилизации. Питательную среду стерилизуют в автоклаве при 0.5 атм (110°С) в течение 20 минут. После окончания культивирования полученную пленку отделяют от питательной среды, промывают под проточной водой. После промывания полученные пленки нагревают в растворе NaOH 0,5Н в течение 20 минут при температуре 80°С для уничтожения и удаления клеток. Для нейтрализации NaOH 0,5Н используют раствор 0,5Н уксусной кислоты. Рекомендуют стерилизовать полученные пленки в автоклаве при 1 атм (121°С) в течение 15 минут. До стерилизации добавляют дистиллированную воду в отношении 1:10 (1 г сырой пленки:10 мл дистиллированной воды). Пленки сохраняют в дистиллированной воде или высушивают до постоянной массы. Биомасса полученной пленки составляет 6.67 г/л при культивировании в течение 7 суток [фиг.8].

Штамм бактерий Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 получен путем многоступенчатого скрининга из культуры «чайного кваса». Штамм депонирован в ВКПМ под номером В-10547. Штамм продуцирует бактериальную целлюлозу. При культивировании в течение 7 суток на селективных средах выход бактериальной целлюлозы составляет 4,73-6,67 г/л. 12 ил., 5 пр.

Штамм бактерии Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 ВКПМ В-10547 - продуцент бактериальной целлюлозы.