СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНОЙ ПОЧВЫ И ВОДНОЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ ШТАММОМ БАКТЕРИЙ EXGUOBACTERIUM MEXICANUM Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к способам очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Для очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов в загрязненные субстраты вносят суспензию штамма бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011. Изобретение позволяет за короткие сроки добиться высокой степени очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельного топлива, газового конденсата, масла моторного).

Уровень техники

Известны штаммы: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Клюшникова T.M., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С. А.с. SU 1493666-А1. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. Заявка №4280617, 09.07.1987. Опубл. 15.07.1989); Flavobacterium tirrermicum (2. Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И. Штамм бактерий Flavobacterium tirrermicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. А.с. SU 1409594. Заявка №4066152, 24.03.1986. Опубл. 15.07.1988), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (3. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н. Штамм @ @ 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. А.с. СССР 1076446. Заявка №3474745, 22.07.1982. Опубл. 28.02.1984); Acinetronacter sp.НВ-1 (4. Жиркова Н.А, Кобелев B.C., Холоденко В.П. ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент РФ №2077579. Заявка №94043331 от 06.12.1994. Опубл. 20.04.1997), Acinetronacter sp.JN-2 (5. Ушков С.Б., Ильинская Н. ШТАММ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU №2064017. Заявка №93009595 от 23.02.1993. Опубл. 20.07.1996), Pseudomonas alcaligenes Е7 (6. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES Е7, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU №2134723, Заявка №98105707 от 25.03.1998. Опубл. 20.08.1999) и Pseudomonas alcaligenes B-1 (7. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES В-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU №2133770. Заявка №98105709 от 25.03.1998. Опубл. 27.07.1999). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis E-15 (8. Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ. Патент RU №2019527. Заявка №93017464 от 30.04.1993. Опубл. 15.09.1994), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Близким к заявляемому способу является способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis (9. Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова А.М. СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТИ СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ BACILLUS SUBTILIS. Патент RU №2446900. Заявка №2010129158 от 13.07.2010. Опубл. 20.01.2012), обладающих способностью снижать концентрацию нефти до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти только в почве, в условиях модельного эксперимента и не способен осуществлять очистку водной среды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +8 до +37°C.

Задачей изобретения является получение способа очистки мерзлотных почв и водной среды, не только от нефти, но также и от нефтепродуктов (дизельное топливо, газовый конденсат, масло моторное) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +37°C.

Осуществление изобретения

Решение поставленной задачи достигается путем внесения в загрязненные нефтью или нефтепродуктами (дизельное топливо, газовый конденсат, масло моторное) мерзлотные почвы и водную среду микробного препарата на основе штамма бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011.

Технический результат изобретения достигается следующим образом.

Используют суспензию штамма бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 с содержанием живых клеток в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/мл.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 депонирован во Всероссийской коллекции непатогенных промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11011. Штамм бактерий является перспективным для восстановления нефтезагрязненньгх мерзлотных почв и очистки водной среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение бактериальной суспензии штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выращивают на мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) при температуре +30°C в течение 1-2-х суток, затем смывают в 0,9% растворе NaCl в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича. Полученную таким образом бактериальную суспензию штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 используют для очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов.

Пример 2. Определение нефтеокисляющей способности штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Бактериальную суспензию штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011, полученную способом, описанным в примере 1, вносят в минерализованную водную среду следующего состава (г/дм³): KNO₃-4,0; MgSO₄·7H₂O-0,8; NaCl-1,0; K₂ HPO₄-1,4; KH₂ PO₄-0,6; агар-20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³, загрязненную нефтью или нефтепродуктами в количестве 1000 мг на 100,0 см³ субстрата и экспонируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025» (10. ФР.1.31.2007.03234. МВИ 01.02.117. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025).

Данные эксперимента показывают, что в минерализованной водной среде штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 6,38-13,34% - нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C-24,62-54,60%; при температуре +30°C-51,9-69,25%; при температуре +37°C-57,78-81,46% в зависимости от типа ксенобиотика (табл.1).

Таблица 1 Степень утилизации нефти и нефтепродуктов в минерализированной водной среде Вариант опыта t °C Ксенобиотик, мг/дм³ Срок +4 +20 +30 +37 Нефть до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 936,2 502,4 481,0 422,2 % деструкции 6,38 49,76 51,9 57,78 Дизельное топливо до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 902,0 454,8 333,3 185,4 % деструкции 9,8 54,60 66,67 81,46 Масло моторное до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 866,6 753,8 400,6 398,2 % деструкции 13,34 24,62 59,94 60,18 Газовый конденсат до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000.0 после опыта 923,6 533,9 307,5 296,6 % деструкции 7,64 46,61 69,25 70,36

Пример 3. Очистка воды от нефти штаммом Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

В эксикатор объемом 5,0 дм вносят 3,0 дм водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30 000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериальной суспензии штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 (по примеру 1). В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30 000 мг нефти и без внесения бактериальной суспензии.

Таблица 2 Деструкция нефти в воде штаммом Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 Вариант опыта Количество нефти Количество нефти Степень   до внесения клеток штамма, мг/кг через 60 суток после внесения клеток штамма, мг/кг утилизации нефти, % Вода + нефть + клетки штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 30 000 13 443 55,19 Вода + нефть 30 000 29 334,6 2,21

Эксперимент проводят в течение 60-ти суток, поддерживая температуру воды в интервале +15 +20°C.

Полученные результаты (табл.2) показали, что в водопроводной воде деструкция нефти под влиянием штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 за 60 суток составила 55,19%. Деструкция нефти в контрольной емкости существенно не изменилась.

Пример 4. Очистка мерзлотной почвы от нефти с помощью штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной нефтью, проведен в условиях открытой экосистемы на территории аварийного разлива нефти. Средняя температура почвы в течение всего периода постановки эксперимента на горизонте 20 см составляла в среднем +8°C; на горизонте 10 см - +14°C.

Бактериальную суспензию, полученную по примеру 1, содержащую культуру клеток штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011, с титром не менее 1109 КОЕ/см³ вносят в почву, загрязненную нефтью из расчета 1 литр препарата на 1 м³ нефтезагрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают с помощью лопаты и экспонируют в естественных условиях в течение 60-ти суток.

Содержание нефтепродуктов в почве определяют гравиметрическим методом в соответствии с (11. РД 39-0147098-90. Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома.-1990).

Таблица 3 Динамика деструкции нефти в почве, обработанной бактериальной суспензией штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 Вариант опыта Содержание нефти до внесения штамма, мг/кг Содержание нефти, через 60 суток после внесения штамма, мг/кг Деструкция нефти,% Почва + нефть + клетки штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 34675 4517 86,97 Почва + нефть 13771 12762 7,32

Результаты исследований показывают, что после обработки нефтезагрязненной почвы бактериальной суспензией на основе штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ B-11011 через 60 суток при средней температуре почвы +8 +14°C деструкция нефти составила 86,97% (таблица 3).

Таким образом, преимуществом штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 суток до 60-ти суток), в широком диапазоне температур от +4 до +37°C, который может быть использован как для очистки почв, так и для очистки водной среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат).

Предлагаемый способ может быть использован для реабилитации нефтезагрязненных территорий в условиях Крайнего Севера.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при очистке мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Exguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и готовят из него суспензию, которую вносят в мерзлотную почву и водную среду. Выдерживают при заданных параметрах от 7 до 60 суток и определяют количественное содержание нефти и нефтепродуктов в исследуемой почве и водной среде. Изобретение позволяет сократить сроки денатурации нефти и нефтепродуктов и снизить концентрацию нефти и нефтепродуктов в почве и водной среде. 3 табл., 4 пр.

Способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов, отличающийся тем, что для очистки загрязненных субстратов используют бактериальную суспензию штамма Exguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011.