СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСОМ ГРИППА С ТИПОМ ПОВЕРХНОСТОГО АНТИГЕНА Н1N1 И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСОМ ГРИППА С ТИПОМ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА Н1N1 Российский патент 2014 года по МПК A61K31/395 A61P31/16 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для эффективного лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у детей и взрослых.

Из уровня техники известен способ лечения гриппа путем использования препарата «Интерферон таблетки 4000 МЕ» (RU 2005132848 A, A61K 39/395, 2008). Однако этот способ малоэффективен при лечении инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1.

Известно также противовирусное лекарственное средство препарат «Тамифлю» (международное непатентованное название действующего вещества: озельтамивира фосфат), производитель: F.HOFFMANN-LA ROCHE Ltd., рекомендованное Всемирной Организацией Здравоохранения для лечения гриппа A с типом поверхностного антигена H1N1 (см. Clinical management of human infection with new influenza A (H1N1) virus: initial guidance. 21 May 2009.

http://www.emro.who.int/csr/h1n1/pdf/clinical_management_21_5_2009.pdf). К недостаткам данного препарата можно отнести наличие побочных эффектов.

Также известно противовирусное лекарственное средство в виде капель потенцированного водного раствора моноклональных антител к гамма-интерферону С12, которое может быть использовано для лечения ОРВИ (RU 2181297 C2, A91K 39/395, 2002), но его эффективность для лечения гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, как у человека.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является способ лечения гриппа типа H1N1 у человека путем введения индуктора интерферона - препарата анаферон, который представляет собой активированную потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека, полученную путем последовательного разведения матричного раствора в нейтральном растворителе с многократным встряхиваем каждого полученного разведения (В.К. Веревщиков и др., «Оценка эффективности и переносимости иммунотропной терапии острых респираторных заболеваний у больных с отягощенным кардиологическим анамнезом», 2008). Однако эффективность лечения гриппа типа H1N1 определяется выбором концентрации матричного раствора, что не следует из уровня техники.

Изобретение направлено на создание универсального, эффективного и безопасного способа лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа A с типом поверхностного антигена H1N1, и препарата с противовирусной и иммуномодулирующей активностью, обеспечивающего эффективное лечение и профилактику инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа A с типом поверхностного антигена H1N1, как у детей и взрослых.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 у человека, согласно изобретению, используют действующую субстанцию в виде активированной потенцированной формы, полученной путем последовательного разведения и промежуточного многократного встряхивания каждого полученного разведения из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в нейтральном растворителе с концентрацией составляет 0,3÷5,0 мг/мл.

Причем в способе лечения используют активированную потенцированную форму действующей субстанции, которая получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл.

Заявленный выбор диапазона концентрации матричного (первичного) раствора обусловлен тем, что при концентрации менее 0,3 мг/мл антитела к гамма-интерферону человека резко снижают свою специфическую активность (эффективность), стабильность и срок хранения, а использование антител с концентрацией выше 5,0 мг/мл технологически сложно.

При этом действующая субстанция включает смесь различных гомеопатических разведений, предпочтительно, сотенных C 12, С 30, С 50 или C 12, С 30, С 200.

Кроме того, решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что лекарственное средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, согласно изобретению, включает действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека.

При этом гомеопатически активированная потенцированная форма действующей субстанции лекарственного средства получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл.

Причем лекарственное средство может включать смесь различных гомеопатических разведений, предпочтительно, сотенных C 12, С 30, С 50 или C 12, С 30, С 200.

Терапевтическая эффективность заявленного решения в отношении вирусов гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 для лечения человека обусловлена иммуномодулирующим и противовирусным действием гомеопатически активированной потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека. При этом лекарственное средство заявленного состава снижает концентрацию вируса в пораженных тканях, влияет на систему эндогенных интерферонов и сопряженных с ними цитокинов, индуцирует образование эндогенных «ранних» интерферонов (ИФН α/β) и гамма-интерферонов (ИФН γ). Кроме того, препарат стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ, повышает продукцию антител (включая секреторный IgA), активирует функции Т-эффекторов, Т-хелперов (Тх), нормализует их соотношение, повышает функциональный резерв Тх и других клеток, участвующих в иммунном ответе, является индуктором смешанного Tx1 и Тх2-типа иммунного ответа: нормализует выработку цитокинов Tx1 (ИФН γ, ИЛ-2) и Тх2 (ИЛ-4, ИЛ-10), нормализует (модулирует) баланс Тх1/Тх2 активностей, повышает активность фагоцитов и естественных клеток-киллеров (ЕК клеток), что обуславливает противовирусную активность препарата в отношении вирусов гриппа с типом поверхностного антигена H1N1.

Причем в отличие от действия терапевтических доз известных препаратов, в том числе и на основе интерферона, применение сверхмалых доз разведений активированной потенцированной формы антител к гамма-интерферону человека не вызывает побочных эффектов, к заявленному препарату не развивается резистентность, что обуславливает возможность его использования для длительной безопасной и эффективной противовирусной профилактики. Кроме того, заявленный препарат характеризуется отсутствием побочных эффектов при сохранении терапевтического действия, экологической чистотой и низкой себестоимостью и расширяет арсенал лекарственных средств, предназначенных для лечения гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 у человека.

Лекарственный препарат может быть приготовлен на основе поликлональных или моноклональных антител к гамма-интерферону человека, полученных по известным методикам.

Методика получения поликлональных и моноклональных антител описана, например, в книге: Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля, М., Медицина, 1987, с.9-33, или, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Методика получения рекомбинантных антител описана, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Методика получения антител к гамма-интерферону человека описана, например, в статье Monoclonal antibodies to human-γ: production, affinity, purification and radioimmunoassay. - The EMBO Journal, Vol.2, No. 9, pp.1527-1530, 1983.

Для получения поликлональных иммунных антител, а также в гибридомной технологии для получения рекомбинантных моноклональных и поликлональных антител в качестве иммуногена для иммунизации лабораторных животных может быть использован гамма-интерферон человека, в том числе рекомбинантный, или фрагмент или смесь различных фрагментов гамма-интерферона человека.

Полученные по известным методикам антитела к гамма-интерферону человека очищают, преимущественно, методом аффинной хроматографии.

При реализации заявленного решения, например, для исследовательских целей могут быть также использованы готовые антитела к гамма-интерферону человека, производимые различными фирмами, например:

- Anti-Interferon-gamma antibody produced in goat; species reactivity: human (см. Каталог «Продукты для исследований в области естественных наук» (SIGMA) на 2008-2009 гг., стр.2153);

- Rabbit polyclonal antibodies to Interferon gamma (Immunogen: Highly pure (>98%) recombinant human Interferon-gamma (см. http://www.abcam.com/Interferon-gamma-antibody-ab9657.html);

Mouse monoclonal antibodies to Interferon gamma (Immunogen: Recombinant full length protein (Human)) (см. http://www.abcam.com/Interferon-gamma-antibody-ab9658.html);

Chicken Anti-Human Interferon gamma Polyclonal Antibody, Unconjugated (см. http://www.biocompare.com/ProductDetails/1269192/Chicken-Anti-Human-Interferon-gamma-Polyclonal-Antibody,-Unconjugated.html);

Rabbit Anti-Human Interferon gamma Monoclonal Antibody, Unconjugated, Clone EP1109Y (см. http://www.biocompare.com/ProductDetails/880680/Rabbit-Anti-Human-Interferon-gamma-Monoclonal-Antibody,-Unconjugated,-Clone-EP1109Y.html) и др.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного препарата является использование поликлональных антител к гамма-интерферону человека.

Полученные после очистки методом аффинной хроматографии антитела в фосфатно-солевом буферном растворе с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл (предпочтительно 1,0÷3,0 мг/мл) используют в качестве матричного раствора для приготовления действующей субстанции в виде гомеопатически активированной потенцированной формы, которую получают путем многократного последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека и промежуточного внешнего воздействия, предпочтительно по гомеопатической технологии (см., например, Гомеопатические лекарственные средства. Руководство по описанию и изготовлению. В. Швабе. Москва, 1967, с.12-38).

При этом производят равномерное уменьшение концентрации путем последовательного разведения 1 объемной части матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в 9 объемных частях (для десятичного разведения D) или в 99 объемных частях (для сотенного разведения С) или в 999 объемных частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием каждого полученного разведения и использованием преимущественно отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой сверхмалой дозы (потенции). Причем первое гомеопатическое разведение производят на нейтральном растворителе: предпочтительно на 10÷15% водном растворе этилового спирта или дистиллированной воде, следующие разведения на 20÷30% водном растворе этилового спирта и конечные (последние два-три) разведения производят на 35÷75% водном растворе этилового спирта или дистиллированной воде.

При использовании в качестве действующей биологически активной потенцированной субстанции смеси различных, преимущественно сотенных, разведений (потенций) каждый компонент состава (например, С 12, С 30, С 50 или C 200) приготовляют по отдельности по приведенной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С49 или С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения).

Внешнее воздействие в процессе уменьшения концентрации можно осуществлять как в виде многократного вертикального встряхивания, так и, например, ультразвуком, электромагнитным или иным подобным физическим действием.

Заявленный диапазон концентрации матричного раствора является оптимальным для получения лекарственного препарата с повышенной противовирусной активностью и обусловлен тем, что при концентрации матричного раствора менее 0,5 мг/мл антитела к гамма-интерферону человека при их дальнейшей обработке-потенцировании резко снижают свою специфическую активность (эффективность), стабильность и срок хранения, а использование антител с концентрацией выше 5,0 мг/мл технологически сложно и дорого.

Приготовленная таким образом действующая субстанция в виде гомеопатически активированной потенцированной формы может быть использована в общепринятых лекарственных формах как в виде водоспиртовых растворов, так и для приготовления твердых лекарственных форм.

Пример 1

Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=80) проводилось на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (летальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 20 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 21 дня после инфицирования в комбинации с добавлением препарата в поилки к животным. Препарат сравнения озельтамивир вводили 20 мышам интрагастрально за 25 и 1 час до инфицирования в дозе 10 мг/кг, затем в течение 3 суток после инфицирования - 2 раза в сутки по 10 мг/кг (в объеме 0,2 мл/мышь); начиная с 4 суток после инфицирования вместо озельтамивира животным вводили воду дистиллированную 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. 20 мышей не инфицировали, для оценки состояния животных на протяжении всего эксперимента (интактный контроль). Оценивали выживаемость животных.

В результате эксперимента обнаружено, что сверхмалые дозы антител к гамма-интерферону человека в условиях летального инфицирования мышей вирусом гриппа A/H1N1 повышали выживаемость животных в 3,7 раза по сравнению с контрольной группой. На 10 сутки после инфицирования в контрольной группе выжило 17,5% мышей, в группе озельтамивира - 30% мышей, в группе сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека - 65% мышей. В группе интактного контроля все мыши были живы до конца эксперимента.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/California/07/2009swl, превосходящей эталонный препарат для лечения гриппа A - озельтамивир.

Пример 2

Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=96) проводилось на базе ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Кольцово). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)v в дозе 10ИД50 (нелетальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 5,0 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 32 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 8 дней после инфицирования. Препарат сравнения озельтамивир вводили 32 мышам интрагастрально за 1 час до инфицирования в дозе 20 мг/кг, затем в течение 5 суток после инфицирования - 2 раза в сутки по 10 мг/кг (в объеме 0,2 мл/мышь); начиная с 6 суток после инфицирования вместо озельтамивира животным вводили воду дистиллированную 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. Оценивали титр вируса гриппа в легких мышей (на 2, 4, 6, 8-е сутки после инфицирования).

В результате эксперимента обнаружено, что применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону у мышей, инфицированных A/California/07/2009(H1N1)v, было сравнимо по эффективности с применением озельтамивира и способствовало достоверному, более чем в 10 раз по сравнению с контрольной группой, снижению продукции вируса гриппа в легких мышей на 4, 6 и 8 сутки после инфицирования (см. Таблицу 1).

Таблица 1 Динамика наработки вируса гриппа в легких у мышей, получавших сверхмалые дозы антител к интерферону гамма или озельтамивир, при заражении 10ИД50 штамма вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1)v Группы Средние значения титров (lg ТЦД₅₀/мл±m) вируса гриппа A(H1N1)v в гомогенатах легких у инфицированных животных через: 2 сут. 4 сут. 6 сут. 8 сут. Сверхмалые дозы антител к интерферону гамма 0,54±0,03, n=8 0,59±0,03, n=8, * 1,63±0,19, n=8, * 0,98±0,17, n=8, * Озельтамивир 0,52±0,02, n=8 0,54±0,03, n=8,* 1,77±0,09, n=8,* 1,10±0,16, n=8, * Контроль 0,56±0,03, n=8 1,96±0,14, n=8 2,86±0,11, n=8 2,65±0,23, n=8 Примечание: * - p=<0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/California/07/2009(H1N1)v, не уступающей эталонному препарату для лечения гриппа А - озельтамивиру.

Пример 3

Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=80) проводилось в компании APcis (г. Мезон-Альфорт, Франция). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1) в дозе 10ЛД50 (летальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 1,5 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 20 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 21 дня после инфицирования в комбинации с добавлением препарата в поилки к животным. Эффективность заявленного препарата сравнивали с озельтамивиром в дозе 4 мг/кг/сут. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. 20 мышей не инфицировали, для оценки состояния животных на протяжении всего эксперимента (интактный контроль). Оценивали выживаемость животных.

В результате эксперимента обнаружено, что применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях летального инфицирования мышей вирусом гриппа A/H1N1 обеспечило более позднее начало заболевания: на 5 сутки после инфицирования количество погибших мышей было на 25% (p<0,05) меньше, чем в группе плацебо.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/New Caledonia/20/99, не уступающей озельтамивиру (4 мг/кг/сут).

Пример 4

Исследование эффективности и безопасности сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека в лечении гриппа (А, В, микст) и ОРВИ у детей проводилось на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). В двойном слепом плацебоконтролируемом исследовании принимали участие 105 детей обоего пола в возрасте от 1 до 10 лет, поступавшие на 1÷2 сутки от начала заболевания, с температурой тела не ниже 37,5°C и не получавшие иммуномодулирующую или противовирусную терапию до начала исследования.

Гриппозная моноинфекция была лабораторно подтверждена у 53,4% детей, из которых у 21,1% был определен вирус гриппа A/H1N1 (A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/269/95). Дети получали сверхмалые дозы антител к интерферону гамма человека в виде твердой лекарственной формы - таблетки, насыщенной смесью гомеопатических разведений С12, С30, С50, приготовленной из матричного раствора с концентрацией 3,0 мг/мл, (по 3÷8 табл./сут) для рассасывания во рту или плацебо (пустой таблетки, не содержащей гомеопатически активированной потенцированной формы действующей субстанции) в сочетании с симптоматической терапией в течение 7÷14 дней. У детей оценивали длительность основных клинических симптомов, частоту и выраженность осложнений.

В результате эксперимента обнаружено, что сверхмалые дозы антител к гамма-интерферону человека значительно сокращали, по сравнению с плацебо, общую длительность заболевания (с 7,5±0,28 до 5,8±0,24 сут.) и длительность основных симптомов заболевания: лихорадки с 3,67±0,12 до 2,25±0,13 сут; симптомов интоксикации в среднем более чем на 1 сутки; катаральных симптомов - на 1,5 суток. Нежелательных явлений, связанных с приемом препарата, не зарегистрировано. Также показано, что заявленный препарат сокращает длительность вирусовыделения - через 1÷2 суток после начала лечения количество выявленных вирусных антигенов сократилось в 3 раза по сравнению с исходным данными, в группе плацебо - в 2,2 раза; на 4÷5 сутки терапии, в отличие от группы плацебо, в группе заявленного препарата антигены не обнаруживались.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой клинической эффективностью и безопасностью в терапии ОРВИ и гриппа, в том числе вызванного вирусом гриппа A/H1N1.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии и вирусологии, и касается лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1. Для этого вводят лекарственное средство, включающее действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной потенцированной формы, полученной путем многократного последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл. Введение такого лекарственного средства обеспечивает эффективное лечение и профилактику указанных выше инфекционных заболеваний. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 табл.

1. Способ лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у человека, характеризующийся тем, что используют действующую субстанцию в виде активированной потенцированной формы, полученной путем последовательного разведения и промежуточного многократного встряхивания каждого полученного разведения из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в нейтральном растворителе с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл.

2. Способ лечения по п.1, характеризующийся тем, что используют лекарственное средство, включающее смесь различных гомеопатических разведений.

3. Способ лечения по п.1, характеризующийся тем, что используют лекарственное средство, включающее смесь гомеопатических разведений C 12, С 30, С 50 или C 12, С 30, С 200.

4. Лекарственное средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, характеризующееся тем, что включает действующую субстанцию в виде активированной потенцированной формы, полученной путем последовательного разведения и промежуточного многократного встряхивания каждого полученного разведения из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в нейтральном растворителе с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл.

5. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что включает смесь различных гомеопатических разведений.

6. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что включает смесь гомеопатических разведений C 12, С 30, С 50 или C 12, С 30, С 200.