СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСОМ ГРИППА С ТИПОМ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА H1N1, У ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ, И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСОМ ГРИППА С ТИПОМ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА H1N1 Российский патент 2015 года по МПК A61K39/395 A61P31/16 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для эффективного лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц.

Из уровня техники также известно лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний домашних животных и способ лечения (RU 2326694 C1, A61K 39/395, 2008). Однако данное решение при сложности приготовления лекарственного средства малоэффективно при лечении инфекционных заболеваний у животных, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, а его пригодность для лечения человека не очевидна.

Изобретение направлено на создание универсального, эффективного и безопасного способа лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа А с типом поверхностного антигена H1N1, и препарата с противовирусной и иммуномодулирующей активностью, обеспечивающего эффективное лечение и профилактику инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа А с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц согласно изобретению используют действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы, полученной путем многократного последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека и промежуточного внешнего воздействия.

Причем в способе лечения используют активированную - потенцированную форму действующей субстанции, которая получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

При этом действующая субстанция включает смесь различных гомеопатических разведений, предпочтительно, сотенных С 12, С 30, С 50 или С 12, С 30, С 200.

Кроме того, решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что лекарственное средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, согласно изобретению, включает действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека.

При этом гомеопатически активированная - потенцированная форма действующей субстанции лекарственного средства получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Причем лекарственное средство может включать смесь различных гомеопатических разведений, предпочтительно, сотенных С 12, С 30, С 50 или С 12, С 30, С 200.

Терапевтическая эффективность заявленного решения в отношении вирусов гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 для лечения животных и птиц обусловлена иммуномодулирующим и противовирусным действием гомеопатически активированной - потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека. При этом лекарственное средство заявленного состава снижает концентрацию вируса в пораженных тканях, влияет на систему эндогенных интерферонов и сопряженных с ними цитокинов, индуцирует образование эндогенных «ранних» интерферонов (ИФН α/β) и гамма-интерферонов (ИФН γ). Кроме того, препарат стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ, повышает продукцию антител (включая секреторный IgA), активирует функции Т-эффекторов, Т-хелперов (Tx), нормализует их соотношение, повышает функциональный резерв Tx и других клеток, участвующих в иммунном ответе, является индуктором смешанного Tx1- и Tx2-типа иммунного ответа: нормализует выработку цитокинов Tx1 (ИФН γ, ИЛ-2) и Tx2 (ИЛ-4, ИЛ-10), нормализует (модулирует) баланс Tx1/Tx2 активностей, повышает активность фагоцитов и естественных клеток-киллеров (ЕК клеток), что обуславливает противовирусную активность препарата в отношении вирусов гриппа с типом поверхностного антигена H1N1.

Причем в отличие от действия терапевтических доз известных препаратов, в том числе и на основе интерферона, применение сверхмалых доз разведений активированной - потенцированной формы антител к гамма-интерферону человека не вызывает побочных эффектов, к заявленному препарату не развивается резистентность, что обуславливает возможность его использования для длительной безопасной и эффективной противовирусной профилактики. Кроме того, заявленный препарат характеризуется отсутствием побочных эффектов при сохранении терапевтического действия, экологической чистотой и низкой себестоимостью и расширяет арсенал лекарственных средств, предназначенных для лечения гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 у животных и птиц.

Лекарственный препарат может быть приготовлен на основе поликлональных или моноклональных антител к гамма-интерферону человека, полученных по известным методикам.

Методика получения поликлональных и моноклональных антител описана, например, в книге: Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля, М., Медицина, 1987, с.9-33, или, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Методика получения рекомбинантных антител описана, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Методика получения антител к гамма-интерферону человека описана, например, в статье Monoclonal antibodies to human-γ: production, affinity, purification and radioimmunoassay. - The EMBO Journal, Vol.2, No.9, pp.1527-1530, 1983.

Для получения поликлональных иммунных антител, а также в гибридомной технологии для получения рекомбинантных моноклональных и поликлональных антител в качестве иммуногена для иммунизации лабораторных животных может быть использован гамма-интерферон человека, в том числе рекомбинантный, или фрагмент или смесь различных фрагментов гамма-интерферона человека.

Полученные по известным методикам антитела к гамма-интерферону человека очищают, преимущественно, методом аффинной хроматографии.

При реализации заявленного решения, например, для исследовательских целей могут быть также использованы готовые антитела к гамма-интерферону человека, производимые различными фирмами, например:

- Anti-Interferon-gamma antibody produced in goat; species reactivity: human (см. Каталог «Продукты для исследований в области естественных наук» (SIGMA) на 2008-2009 гг., стр.2153);

- Rabbit polyclonal antibodies to Interferon gamma (Immunogen: Highly pure (>98%) recombinant human Interferon-gamma (см. http://www.abcam.com/Interferon-gamma-antibody-ab9657.html);

- Mouse monoclonal antibodies to Interferon gamma (Immunogen: Recombinant full length protein (Human)) (см. http://www.abcam.com/Interferon-gamma-antibody-ab9658.html);

- Chicken Anti-Human Interferon gamma Polyclonal Antibody, Unconjugated (см. http://www.biocompare.com/ProductDetails/1269192/Chicken-Anti-Human-Interferon-gamma-Polyclonal-Antibody,-Unconjugated.html);

- Rabbit Anti-Human Interferon gamma Monoclonal Antibody, Unconjugated, Clone EP1109Y (см. http://www.biocompare.com/ProductDetails/880680/Rabbit-Anti-Human-Interferon-gamma-Monoclonal-Antibody,-Unconjugated,-Clone-EP1109Y.html) и др.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного препарата является использование поликлональных антител к гамма-интерферону человека.

Полученные после очистки методом аффинной хроматографии антитела в фосфатно-солевом буферном растворе с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл (предпочтительно 1,0÷3,0 мг/мл) используют в качестве матричного раствора для приготовления действующей субстанции в виде гомеопатически активированной потенцированной формы, которую получают путем многократного последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека и промежуточного внешнего воздействия, предпочтительно по гомеопатической технологии (см., например, Гомеопатические лекарственные средства. Руководство по описанию и изготовлению, В. Швабе, Москва, 1967, с.12-38).

При этом производят равномерное уменьшение концентрации путем последовательного разведения 1 объемной части матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в 9 объемных частях (для десятичного разведения D) или в 99 объемных частях (для сотенного разведения С) или в 999 объемных частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием каждого полученного разведения и использованием преимущественно отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой сверхмалой дозы (потенции). Причем первое гомеопатическое разведение производят на нейтральном растворителе: предпочтительно на 10÷15% водном растворе этилового спирта или дистиллированной воде, следующие разведения на 20÷30% водном растворе этилового спирта и конечные (последние два-три) разведения производят на 35÷75% водном растворе этилового спирта или дистиллированной воде.

При использовании в качестве действующей биологически активной - потенцированной субстанции смеси различных, преимущественно, сотенных, разведений (потенций), каждый компонент состава (например, С 12, С 30, С 50 или С 200) приготовляют по отдельности по приведенной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С49, или С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения).

Внешнее воздействие в процессе уменьшения концентрации можно осуществлять как в виде многократного вертикального встряхивания, так и, например, ультразвуком, электромагнитным или иным подобным физическим действием.

Заявленный диапазон концентрации матричного раствора является оптимальным для получения лекарственного препарата с повышенной противовирусной активностью и обусловлен тем, что при концентрации матричного раствора менее 0,5 мг/мл антитела к гамма-интерферону человека при их дальнейшей обработке - потенцировании резко снижают свою специфическую активность (эффективность), стабильность и срок хранения, а использование антител с концентрацией выше 5,0 мг/мл технологически сложно и дорого.

Приготовленная таким образом действующая субстанция в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы может быть использована в общепринятых лекарственных формах как в виде водоспиртовых растворов, так и для приготовления твердых лекарственных форм.

Пример 1

Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=80) проводилось на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (летальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 20 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 21 дня после инфицирования в комбинации с добавлением препарата в поилки к животным. Препарат сравнения озельтамивир вводили 20 мышам интрагастрально за 25 и 1 час до инфицирования в дозе 10 мг/кг, затем в течение 3 суток после инфицирования - 2 раза в сутки по 10 мг/кг (в объеме 0,2 мл/мышь); начиная с 4 суток после инфицирования вместо озельтамивира животным вводили воду дистиллированную 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. 20 мышей не инфицировали, для оценки состояния животных на протяжении всего эксперимента (интактный контроль). Оценивали выживаемость животных.

В результате эксперимента обнаружено, что сверхмалые дозы антител к гамма-интерферону человека в условиях летального инфицирования мышей вирусом гриппа A/H1N1 повышали выживаемость животных в 3,7 раза по сравнению с контрольной группой. На 10 сутки после инфицирования в контрольной группе выжило 17,5% мышей, в группе озельтамивира - 30% мышей, в группе сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека - 65% мышей. В группе интактного контроля все мыши были живы до конца эксперимента.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/California/07/2009swl, превосходящей эталонный препарат для лечения гриппа А - озельтамивир.

Пример 2

Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=96) проводилось на базе ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Кольцово). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)v в дозе 10ИД50 (нелетальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 5,0 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 32 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 8 дней после инфицирования. Препарат сравнения озельтамивир вводили 32 мышам интрагастрально за 1 час до инфицирования в дозе 20 мг/кг, затем в течение 5 суток после инфицирования - 2 раза в сутки по 10 мг/кг (в объеме 0,2 мл/мышь); начиная с 6 суток после инфицирования вместо озельтамивира животным вводили воду дистиллированную 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. Оценивали титр вируса гриппа в легких мышей (на 2, 4, 6, 8-е сутки после инфицирования).

В результате эксперимента обнаружено, что применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону у мышей, инфицированных A/California/07/2009(H1N1)v, было сравнимо по эффективности с применением озельтамивира и способствовало достоверному, более чем в 10 раз по сравнению с контрольной группой, снижению продукции вируса гриппа в легких мышей на 4, 6 и 8 сутки после инфицирования (см. Таблицу 1).

Таблица 1 Динамика наработки вируса гриппа в легких у мышей, получавших сверхмалые дозы антител к интерферону гамма или озельтамивир, при заражении 10ИД50 штамма вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1)v Группы Средние значения титров (lg ТЦД50/мл±m) вируса гриппа A(H1N1)v в гомогенатах легких у инфицированных животных через: Сверхмалые 2 сут. 4 сут. 6 сут. 8 сут. 0,54±0,03, 0,59±0,03, 1,63±0,19, 0,98±0,17, дозы антител к интерферону гамма n=8 n=8,* n=8,* n=8,* Озельтамивир 0,52±0,02, n=8 0,54±0,03, n=8, * 1,77±0,09, n=8,* 1,10±0,16, n=8,* Контроль 0,56±0,03, n=8 1,96±0,14, n=8 2,86±0,11, n=8 2,65±0,23, n=8 Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/California/07/2009(H1N1)v, не уступающей эталонному препарату для лечения гриппа А - озельтамивиру.

Пример 3

Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=80) проводилось в компании APcis (г. Мезон-Альфорт, Франция). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1) в дозе 10ЛД50 (летальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 1,5 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 20 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 21 дня после инфицирования в комбинации с добавлением препарата в поилки к животным. Эффективность заявленного препарата сравнивали с озельтамивиром в дозе 4 мг/кг/сут. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. 20 мышей не инфицировали для оценки состояния животных на протяжении всего эксперимента (интактный контроль). Оценивали выживаемость животных.

В результате эксперимента обнаружено, что применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях летального инфицирования мышей вирусом гриппа A/H1N1 обеспечило более позднее начало заболевания: на 5 сутки после инфицирования количество погибших мышей было на 25% (р<0,05) меньше, чем в группе плацебо.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/New Caledonia/20/99, не уступающей озельтамивиру (4 мг/кг/сут).

Пример 4

Исследование эффективности и безопасности сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека в лечении гриппа (А, В, микст) и ОРВИ у детей проводилось на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). В двойном слепом плацебоконтролируемом исследовании принимали участие 105 детей обоего пола в возрасте от 1 до 10 лет, поступавших на 1÷2 сутки от начала заболевания с температурой тела не ниже 37,5°C и не получавших иммуномодулирующую или противовирусную терапию до начала исследования.

Гриппозная моноинфекция была лабораторно подтверждена у 53,4% детей, из которых у 21,1% был определен вирус гриппа A/H1N1 (A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/269/95). Дети получали сверхмалые дозы антител к интерферону гамма человека в виде твердой лекарственной формы - таблетки, насыщенной смесью гомеопатических разведений С12, С30, С50, приготовленной из матричного раствора с концентрацией 3,0 мг/мл, (по 3÷8 табл./сут.) для рассасывания во рту или плацебо (пустой таблетки, не содержащей гомеопатически активированной - потенцированной формы действующей субстанции) в сочетании с симптоматической терапией в течение 7÷14 дней. У детей оценивали длительность основных клинических симптомов, частоту и выраженность осложнений.

В результате эксперимента обнаружено, что сверхмалые дозы антител к гамма-интерферону человека значительно сокращали, по сравнению с плацебо, общую длительность заболевания (с 7,5±0,28 до 5,8±0,24 сут.) и длительность основных симптомов заболевания: лихорадки с 3,67±0,12 до 2,25±0,13 сут.; симптомов интоксикации в среднем более чем на 1 сутки; катаральных симптомов - на 1,5 суток. Нежелательных явлений, связанных с приемом препарата, не зарегистрировано. Также показано, что заявленный препарат сокращает длительность вирусовыделения - через 14-2 суток после начала лечения количество выявленных вирусных антигенов сократилось в 3 раза по сравнению с исходным данными, в группе плацебо - в 2,2 раза; на 4÷5 сутки терапии, в отличие от группы плацебо, в группе заявленного препарата антигены не обнаруживались.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой клинической эффективностью и безопасностью в терапии ОРВИ и гриппа, в том числе вызванного вирусом гриппа A/H1N1.

Изобретение относится к области медицины, а именно к вирусологии, и касается лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц. Для этого вводят эффективное количество лекарственного средства, представляющего собой гомеопатически активированную потенцированную форму, полученную равномерным уменьшением концентрации путем последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в нейтральном растворителе с многократным встряхиванием каждого полученного разведения. Введение такого лекарственного средства обеспечивает эффективную профилактику, а в случае развившегося заболевания - уменьшения тяжести симптомов. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Способ лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц, характеризующийся тем, что используют действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы, полученной равномерным уменьшением концентрации путем последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в нейтральном растворителе с многократным встряхиванием каждого полученного разведения.

2. Способ лечения по п.1, характеризующийся тем, что используют лекарственное средство, включающее смесь различных гомеопатических разведений.

3. Способ лечения по п.1, характеризующийся тем, что используют лекарственное средство, включающее смесь гомеопатических разведений С 12, С 30, С 50 или С 12, С 30, С 200.

4. Способ лечения по п.1, характеризующийся тем, что используют инактивированную - потенцированную форму действующей субстанции, которая получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл.

5. Лекарственное средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, характеризующееся тем, что включает действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека, полученной равномерным уменьшением концентрации путем последовательного разведения матричного раствора с многократным встряхиванием каждого полученного разведения.

6. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что гомеопатически активированная - потенцированная форма действующей субстанции получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,3÷5,0 мг/мл.

7. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что включает смесь различных гомеопатических разведений.

8. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что включает смесь гомеопатических разведений С 12, С 30, С 50 или С 12, С 30, С 200.