СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК A61K38/16 A61K39/395 A61P37/02 

Изобретение относится к области медицины, в частности к новым биологически активным веществам (БАВ) - средствам, обладающим иммунорегуляторным свойством и может быть использовано в практической медицине для лечения аутоиммунных заболеваний, а также в экспериментальной биохимии и ветеринарии.

Известен трофобластический β-1-гликопротеин (ТБГ), обладающий иммунорегуляторным свойством и предназначенный для лечения различных аутоиммунных заболеваний (cм. патент РФ №2056852, кл. A61K 35/50, 1994).

Однако известное средство при его использовании в стадии обострения аутоиммунного заболевания может проявлять свое действие лишь через 4-5 дней после его введения в организм больного.

По технической сущности наиболее близким к заявляемому препарату является средство, обладающее иммунорегуляторным свойством, содержащее трофобластический β-1-гликопротеин (ТБГ) и иммуноглобулин (Ig) (см., например, пат. РФ №2303995, кл. A61K 38/16, от 28.04.2006).

Однако известное средство для лечения аутоиммунных заболеваний требуется использовать как минимум два раза в год. С учетом того, что при каждом приеме данного средства требуется внутривенное введение препарата, возникает необходимость госпитализации больного. Кроме того, при использовании вышеуказанного средства ремиссия происходит непродолжительное время.

Техническим результатом является разработка высококачественного средства, обладающего иммунорегуляторным свойством и ускоренным клиническим эффектом на стадии обострения при лечении аутоиммунных заболеваний.

Достигается это тем, что средство для лечения аутоиммунных заболеваний, содержащее трофобластический β-1-гликопротеин (ТБГ) и иммуноглобулин G (Ig), согласно изобретению, дополнительно содержит тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где X - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, кроме того, ингредиенты взяты в долях, соотношение которых составляет 1:19:20 соответственно, а в качестве иммуноглобулина используют иммуноглобулин класса G (Ig-G), или класса A (Ig-A), или класса M (Ig-M),

Сущность изобретения заключается в том, что заявляемое средство, содержащее ТБГ, Ig и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где X - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, обладает способностью более активно подавлять пролиферативную активность мононуклеарных клеток, индуцировать их супрессорную активность и секрецию ими цитокинов ТФР-В1, ИЛ-10, ИЛ-6. Кроме того, использование заявляемого средства позволяет достичь более высокий клинический эффект, который наступает в 1-е сутки после его введения и продолжается в течение года.

Получение заявляемого средства может быть осуществлено путем смешивания в стеклянной посуде при температуре 1÷10°C исходных составляющих ТБГ, Ig и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где X - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, кроме того, ингредиенты могут быть взяты в долях, соотношение которых составляет 1:19:20.

Лечебный эффект заявляемого средства заключается в том, что оно обладает способностью индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток больных с аутоиммунными заболеваниями и секрецию мононуклеарными клетками цитокинов ТФР-В1, ИЛ-10.

Это позволяет утверждать, что заявляемое средство обладает иммунорегуляторным свойством. Следует отметить, что осуществляли приготовление средства из вышеуказанных составляющих - ТБГ, Ig-G и тетрапептида в различных вышеуказанных долях. Учитывая экономический подход и результаты исследований, можно рекомендовать соотношение ТБГ, Ig-G и тетрапептида равным 1:19:20.

При этом в качестве Ig использовали его разные классы (типы): Ig-G, Ig-A и Ig-M и получали примерно одинаковые результаты. Однако на практике предпочтение можно отдать классу Ig-G, так как его производство проще.

Биологическая активность заявляемого средства, состоящего из ТБГ, Ig и тетрапептида, определялась следующим образом.

Пример 1.

Исследовали действие средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, на пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных по методу Boyum 1969 г.

Диапазон используемых доз составлял 0,5 мкг/мл - 480 мкг/мл.

Результаты исследований отражены в таблице 1.

Таблица 1 Доза чистого ТБГ в мкг/мл в культуральной среде (как в опытной, так и в контрольной) n 0,5 1,5 3 7,5 15 30 60 120 240 480 Индекс ингибиции в % в контрольной среде (ТБГ + Ig G + физиологический p-p) 10 0 5±0,05 15±0,1 24±0,2 32±0,2 46±0,4 38±0,3 25±0,2 14±0,1 0 Индекс ингибиции в % в средстве (ТБГ + IgG + тетрапептид) 10 3±0,02 7±0,03 21±0,05 37±0,04 45±0,06 65±0,3 54±0,2 36±0,07 20±0,07 6±0,09

Как видно из таблицы №1, средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванной фитогемагглютинином, в 1,5 раза сильнее, чем ТБГ с Ig-G.

Пример 2. Исследовали влияние заявляемого средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, на способность индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови. На первом этапе получают суспензию МНК методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-уротрасте (метод Boyum). Периферическую кровь берут у донора путем венопункции в одно и то же время и помещают в пробирки с раствором гепарина из расчета 1 мл крови - 20-30 ед. гепарина. Далее кровь разводят раствором Хенкса без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ в соотношении 1:2 и наслаивают на градиент фиколл-уротраст (плотность 1,078). Затем проводят центрифугирование в режиме 400 g в течение 30 мин. Взвесь МНК из интерфазы переносят в центрифужную пробирку, добавляют раствор Хенкса без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ и производят 3 последовательных центрифугирования по 10 мин для отмывания клеток от раствора фиколл-уротраст. После 3-го центрифугирования осадок МНК ресуспензируют в 1 мл среды 199 и подсчитывают количество мононуклеарных клеток с помощью камеры Горяева.

На втором этапе МНК делят на две равные части, первую из которых культивируют без активатора супрессоров, вторую - с активатором супрессоров, в качестве которого используют исследуемое средство. МНК культивируют в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками № 14,5, при температуре 37°C. Среда культивирования RPM-1640 с добавлением 20% сыворотки IV АВ группы крови и глютамина.

В каждом флаконе культивируют 5∙10⁶ клеток в 2,0 мл полной среды. К культуре для индукции супрессоров добавляют средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, в дозах 1-960 мкг/мл.

Культивирование клеток осуществляют 48 ч. После этого МНК отмывают от среды культивирования и осуществляют блокировку пролиферации путем обработки митомицином C - 40 мкг/мл в течение 30 мин при 37°C. Затем отмывают средой 199 с 5% сыворотки IV АВ (охлажденной) трижды. Осадок клеток ресуспензируют, подсчитывают количество ядросодержащих клеток, определяют процент жизнеспособности клеток с помощью 0,1%-ного трипанового синего раствора и разводят до необходимой концентрации. При этом все операции делают раздельно с контрольными клетками и со стимулированной композицией, а для отмывания клеток используют силиконированную посуду.

На следующем этапе в каждую часть контрольных и стимулированных средством МНК добавляют свежевыделенные МНК, стимулированные фитогемагглютинином (ФГА), которые служат отвечающими тест-клетками в равных соотношениях (0,5∙10⁶ клеток/мл) для получения тест-культур. Культивирование их проводят в течение 72 ч. После этого с помощью Н³ - тимидина оценивают пролиферацию тест-культур и о величине супрессии судят по степени снижения пролиферации в них. Индекс супрессии (ИС) определяют по формуле:

Результаты исследований влияния средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, на способность индуцировать супрессорную активность МНС отражены в таблице 2.

Диапазон доз 0,5-480 мкг/мл.

Таблица 2 Доза чистого ТБГ в мкг/мл в культуральной среде (как в опытной, так и в контрольной) n 0,5 1,5 3 7,5 15 30 60 120 240 480 Индекс супрессиии в % в контрольной среде (ТБГ + IgG + физиологический p-p) 10 0 3±0,02 8±0,03 17±0,1 24±0,12 44±0,14 27±0,06 15±0,02 6±0,02 0 Индекс супрессии в % в средстве (ТБГ + IgG + тетрапептид) 10 2±0,04 5±0,06 13±0,07 25±0,08 35±0,09 64±0,1 40±0,1 21±0,04 10±0,08 4±0,04

Как видно из таблицы №2, средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови в 1,5 раза сильнее, чем ТБГ с Ig-G.

Пример 3. Исследовали влияние средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, на способность индуцировать продукцию цитокинов-трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР - В1) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови. На первом этапе получали суспензию МНК методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-утротраста (метод Boyum). МНК делили на 2 равные части, первую из которых культивировали без заявляемого средства, вторую - со средством.

МНК культивируют в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками №14,5 при температуре 37°C. Среда культивирования RP VI-1640 с добавлением 20% сыворотки IV АВ группы крови и глютамина. В каждом флаконе культивировали 5∙10⁶ МНК в 1 мл полной среды. К культуре МНК для индукции выработки цитокинов ТФР-В 1 и ИЛ-10 добавляли заявляемое средство. Культивирование клеток осуществляли 24 часа. После этого культуральную среду отделяли от клеток путем центрифугирования (1000 g 10 минут и из нее забирали 500 мкл, необходимой для выполнения анализа). При определении количества ТФР-B1 в культуральной среде первоначально производили экстракцию образцов. Этот этап анализа позволяет освободить ТФР-В 1 из комплексов, сделав его доступным для анализа. Для этого в полипропиленовую пробирку вносили 0,25 мл (250 мкл) культуральной среды и 0,05 (50 мкл) экстрагирующего раствора. Перемешивали содержимое на вортексе. Инкубировали 30 минут при 4°C. Добавляли в пробирку 250 мкл рабочего буферного раствора для разведения стандартов. На этом этапе происходит разбавление культуральной среды в 2,2 раза. Далее брали требуемое для проведения анализа число 8 луночных стрипов из разборного микропланшета, покрытого антителами к ТФР-β1.

Для повышения достоверности результатов анализа исследуемые и контрольные образцы ставили в дубликатах, используя для каждого образца две лунки. Вносили по 200 мкл каждого стандарта и экстрагированного образца или клотрона в соответствующие лунки. Добавляли по 500 мкл биотинилированных антител к ТФР-β1 во все лунки, перемешивали путем постукивания по планшету. Закрывали планшет пленкой и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали все лунки 4 раза рабочим буферным раствором, добавляя его каждый раз по 400 мл во все лунки. При этом каждый раз полностью заполняли и удаляли из лунок стрипов раствор. После завершения промывки от остатков влаги освобождали, постукивая перевернутыми стрипами по фильтровальной бумаге. Добавляли 100 мкл рабочего раствора конъюгата стрептавидинпероксидазы в каждую лунку, за исключением хромогенного бланка. Закрывали планшет пленкой и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали лунки 4 раза рабочим буферным раствором. Далее вносили во все лунки по 100 мкл хромогенного раствора тетраметилбензидина (ТМБ). Инкубировали 20-30 мин при комнатной температуре в темноте до появления голубой окраски в лунках с калибровочной пробой с максимальным содержанием ТФР-β1.

Вносили в каждую лунку по 100 мкл стоп раствора (раствор 1Н серной кислоты) для остановки ферментативной реакции. Перемешивали реагенты путем осторожного постукивания по держателю стрипов. Цвет раствора изменялся с голубого на желтый. Регистрацию результатов проводили фотометрически на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 450 нм сразу после остановки ферментативной реакции.

Для определения концентрации ТФР-β1 в исследуемых образцах строили калибровочную кривую в координатах: ось абсцисс - концентрация ТФР-β1 в калибровочных пробах (рг/мл); ось ординат - соответствующее значение оптической плотности. По калибровочной кривой исходя из полученного значения оптической плотности определяли концентрацию ТФР-В1 в исследуемых образцах. Если образцы были предварительно разбавлены, полученные значения концентраций умножали на коэффициент разведения (10, 100, 1000 и т.п.). Для определения количества ИЛ-10 в культуральной среде брали требуемое для проведения анализа число 8 луночных стрипов из разборного микропланшета, покрытого антителами к ИЛ-10. Для повышения достоверности результатов анализа исследуемые и контрольные образцы ставили в дубликатах, используя для каждого образца две лунки. Вносили 50 мкл каждого стандарта, испытуемого образца или контрольного образца в соответствующие лунки. Добавляли по 50 мкл инкубационного буфера для лунок, содержащих стандарты, и 50 мкл разбавляющего рабочего раствора в лунки, содержащие культуральную среду. Закрывали планшет пленкой и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок.

Промывали все лунки 4 раза рабочим буферным раствором, добавляя его каждый раз по 400 мкл во все лунки. При этом каждый раз полностью заполняли и удаляли из лунок стрипов раствор. Добавляли по 100 мкл биотинилированных антител к ИЛ-10 во все лунки, перемешивали путем постукивания по планшету. Закрывали планшет пленкой и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок, промывали все лунки 4 раза рабочим буферным раствором. Добавляли 100 мкл рабочего раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза в каждую лунку, за исключением хромогенного бланка.

Закрывали планшет пленкой и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали лунки 4 раза рабочим буферным раствором. Далее вносили во все лунки по 100 мкл хромогенного раствора тетраметилбензидина (ТМБ).

Инкубировали 20-30 мин при комнатной температуре в темноте до появления голубой окраски в лунках с калибровочной пробой с максимальным содержанием ИЛ-10. Вносили в каждую лунку по 100 мкл стоп раствора (раствор 1Н серной кислоты) для остановки ферментативной реакции. Перемешивали реагенты путем осторожного постукивания по держателю стрипов. Цвет раствора изменялся с голубого на желтый.

Регистрацию результатов также проводили фотометрически на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 450 нм сразу после остановки ферментативной реакции.

Для определения концентрации ИЛ-10 в исследуемых образцах строили калибровочную кривую в координатах: ось абсцисс - концентрация ИЛ-10 в калибровочных пробах (рг/мл); ось ординат - соответствующее значение оптической плотности. По калибровочной кривой исходя из полученного значения оптической плотности определяли концентрацию ИЛ-10 в исследуемых образцах. Если образцы были предварительно разбавлены, полученные значения концентраций должны быть умножены на коэффициент разведения (10, 100, 1000 и т.п.).

В результате проведенных исследований было установлено, что средство, содержащее ТБГ, Ig-G и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, обладает способностью индуцировать продукцию одновременно 2 цитокинов - ТФР-B1 и Ил-10 мононуклеарными клетками периферической крови. При этом уровень цитокинов ИЛ-10 и ТФР-В1, вырабатываемых мононуклеарными клетками периферической крови под действием заявляемого средства, в 1,5 раза выше, чем под действием ТБГ с Ig-G. Более того, введенное больному заявляемое средство приводит к снятию обострения аутоиммунных заболеваний на более длительный период - (1 год), в то время как при введении больному ТБГ с Ig-G эффект проявлялся только полгода.

Пример 4.

Исследовали действие средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, в соотношении 1:99:20 на пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных по методу Boyum 1969 г. Диапазон используемых доз составлял 0,5 мкг/мл - 480 мкг/мл.

Результаты исследований отражены в таблице 3.

Таблица 3 Доза чистого ТБГ в мкг/млв культуральной среде (как в опытной, так и в контрольной) n 0,5 1,5 3 7,5 15 30 60 120 240 480 Индекс ингибиции в % в контрольной среде (ТБГ + IgG + физиологический p-p) 10 0 5±0,05 15±0,1 24±0,2 32±0,2 46±0,4 38±0,3 28±0,2 14±0,1 0 Индекс ингибиции в % в средстве (ТБГ + IgG + тетрапептид) 10 2,5±0,03 7,2±0,04 21,5±0,04 36,8±0,05 44,8±0,04 64,8±0,3 54,7±0,08 36,6±0,04 20,4±0,03 5,5±0,08

Как видно из таблицы №3, средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношении 1:99:20, подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванной фитогемагглютинином, в такой степени как и заявляемое средство, содержащее ТБГ, Ig-G и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношении 1:19:20.

Пример 5.

Исследовали действие средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, в соотношении 1:1:20 на пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных по методу Boyum 1969 г. Диапазон используемых доз составлял 0,5 мкг/мл - 480 мкг/мл. Результаты исследований отражены в таблице 4.

Таблица 4 Доза чистого ТБГ в мкг/мл в культуральной среде (как в опытной, так и в контрольной) n 0,5 1,5 3 7,5 15 30 60 120 240 480 Индекс ингибиции в % вконтрольной среде (ТБГ + Ig G + физиологический p-p) 10 0 4±0,03 11±0,04 24±0,6 39±0,8 45±0,1 36±0,07 22±0,04 14±0,5 0 Индекс ингибиции в % в средстве (ТБГ + IgG + тетрапептид) 10 2±0,03 6±0,04 16±0,03 36±0,05 44±0,07 67±0,1 52±0,15 33±0,08 21±0,06 9±0,08

Как видно из таблицы №4, средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношении 1:1:20, подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванной фитогемагглютинином, в такой степени как и заявляемое средство, содержащее ТБГ, Ig-G и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношениях 1:19:20 и 1:99:20.

Пример 6.

Результаты исследований влияния средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношениях 1:99:20 в на способность индуцировать супрессорную активность МНС отражены в таблице 5. Диапазон доз 0,5-480 мкг/мл.

Таблица 5 Доза чистого ТБГ в мкг/мл в культуральной среде (как в опытной, так и в контрольной) n 0,5 1,5 3 7,5 15 30 60 120 240 480

Индекс супрессиии в % в контрольной среде (ТБГ + IgG + физиологический p-p) 10 0 3,5±0,03 8±0,05 18±0,03 24±0,07 38±0,09 28±0,04 17±0,05 6±0,03 0 Индекс супрессии в % в средстве (ТБГ + IgG + тетрапептид) 10 2±0,03 5±0,05 12±0,04 27±0,06 36±0,08 57±0,1 42±0,06 25±0,04 9±0,05 4±0,03

Как видно из таблицы №5, средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношении 1:99:20, индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови в такой же степени как и средство, содержащее ТБГ, Ig-G и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношениях 1:19:20, и индуцировать продукцию цитокинов-трансформирующего фактора роста бета 1 ТФР-В1 и интерлейкина-10 (ИЛ-10) мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови.

Пример 7.

Результаты исследований влияния средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношениях 1:1:20, на способность индуцировать супрессорную активность МНС отражены в таблице 6. Диапазон доз 0,5-480 мкг/мл.

Таблица 6 Доза чистого ТБГ в мкг/мл в культуральной среде (как в опытной, так и в контрольной) n 0,5 1,5 3 7,5 15 30 60 120 240 480 Индекс супрессиии в % в контрольной среде (ТБГ + IgG + физиологический p-p) 10 0 4±0,03 9±0,05 22±0,06 29±0,04 42±0,01 33±0,08 19±0,04 8±0,02 0

Индекс супрессии в % в средстве (ТБГ + IgG + тетрапептид) 10 4±0,03 6±0,05 14±0,06 31±0,07 42±0,08 61±0,09 46±0,08 28±0,06 13±0,05 6±0,03

Как видно из таблицы №6, средство, состоящее из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношении 1:1:20, индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови в такой же степени как и средство, содержащее ТБГ, Ig-G и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношениях 1:19:20,1:99:20, и индуцирует продукцию цитокинов-трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР-β1) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови.

Следует отметить, что проведенные исследования ИНВИТРО дали возможность определить наиболее оптимальные соотношения исследуемых препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний, эффективность которых будет показана ниже.

Пример 8. Исследовали влияния средства, состоящего из ТБГ, Ig-G и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH в соотношениях 1:19:20, на уровень интерлейкина-10 (ИЛ-10) и трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР-β1) при внутривенном введении в организм здорового человека. При этом оказалось, что прием вышеуказанного средства позволил увеличить уровень цитокинов ИЛ-10 и ТФР-β1 в 8-10 раз по сравнению с приемом каждого из средств в отдельности.

Пример 9. ВЫПИСКА из истории болезни.

Больная О. 46 лет, находилась на лечении в терапевтическом отделении с диагнозом: ревматоидный артрит-полиартрит, серопозитивный, с системными проявлениями (лихорадка, лимфаденопатия, анемия, амиотрофии, нейропатия, ревматоидные узелки), активность 3 ст., стадия III, недостаточность функции суставов III. При поступлении предъявляла жалобы на выраженные боли в мелких и крупных суставах конечностей (проксимальных межфаланговых кистей рук, пястнофаланговых, лучезапястных, локтевых, плечевых, коленных, голеностопных, плюснефаланговых, грудиноключичных), их припухлость, ограничение подвижности, выраженную скованность в суставах, продолжающуюся в течение всего дня, ощущение покалывания в кончиках пальцев рук и ног, повышение температуры тела до 37,8 градусов.

В течение 4 лет отмечала артралгии, в течение 2 лет беспокоят умеренные боли в суставах с их припухлостью, присоединилась утренняя скованность в суставах. Принимала нестероидные противовоспалительные препараты, для облегчения болей нередко употребляла катадолон, иногда трамал. По рекомендации ревматолога 1,5 года назад был назначен метотрексат, который отменен через 2 месяца из-за непереносимости (отмечались диспепсические расстройства, ощущение тяжести в правом подреберьи, в анализах крови - пятикратное повышение уровня печеночных ферментов). Трижды проводилось внутрисуставное введение кортикостероидов. Настоящее ухудшение состояния за 3 недели до госпитализации - после острой респираторной инфекции - повысилась температура до фебрильных цифр, развилась множественная припухлость суставов, появились вышеперечисленные жалобы. Амбулаторно получала антибиотики, нестероидные противовоспалительные препараты, анальгетики. Госпитализирована.

При поступлении состояние тяжелое. Температура тела 37,8 градусов. Обездвижена из-за болей в суставах и их припухлости. Кожные покровы бледные. Пальпируются увеличенные (1,5×1,5 см, 1,5×1,5 см) лимфоузлы (подчелюстные, аксиллярные, паховые). В легких дыхание везикулярное. Тоны сердца умеренно приглушены, тахикардия до 89 в минуту, пульс ритмичный, удовлетворительного наполнения, АД 140/85 мм рт ст. Живот мягкий, безболезненный. Печень у края реберной дуги. Селезенка не пальпируется. Симптом поколачивания (Пастернацкого) отрицательный.

Амиотрофии конечностей. Выраженная припухлость, дефигурация суставов-проксимальных межфаланговых кистей рук, пястнофаланговых, лучезапястных, локтевых, коленных, голеностопных. Гипертермия кожи над суставами. Ограничение активных и пассивных движений в суставах. Ульнарная девиация кистей рук. Контрактуры лучезапястных и локтевых суставов. Ревматоидный узелок в области левого локтевого сустава размером 2,5×2,0 см. Рентгенография кистей рук - остеопороз, сужение межсуставных щелей, множественные эрозии, подвывихи. Анализ крови: Гемоглобин - 92 г/л, Л - 12100, СОЭ - 62 мм/ч, СРБ - 132 мкмоль/л, РФ - 80, АЦЦП - 84 (норма до 5), HBs-(-), АСТ - 44, АЛТ - 32, общий белок крови - 68 г/л.

Супрессорная активность Т-лимфоцитов периферической крови при индукции заявляемого средства составила 16%. ЭКГ-ритм синусовый, диффузные изменения миокарда. Рентгенография органов грудной клетки - очаговых и инфильтративных изменений нет.

Больной проводилось лечение - диклофенак по 3 мл внутримышечно ежедневно, аэртал по 100 мг 2 раза в день, омез 20 мг 2 раза в день, инъекции анальгина с димедролом дважды в день. Состояние больной без существенной динамики в течение 12 дней. Сохраняются анемия, лихорадка до 37,6-37,4, выраженные экссудативные изменения в суставах. Больная обездвижена. В анализах крови лейкоцитоз 11800, СОЭ 65, СРБ 136 мкмоль/л. Больной проведен курс ежедневных внутримышечных инъекций заявляемого средства, содержащего ТБГ - 1 мг, Ig-G - 19 и тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH - 20 мг - (1 мг:19 мг:20 мг).

После осуществления инъекции вышеуказанных доз заявляемого средства состояние больной значительно улучшилось!!! Заметно уменьшились боли во всех суставах, их припухлость, увеличился объем движений. Температура тела нормализовалась. Исчезла скованность в суставах. Больная начала ходить, смогла обслуживать себя. Повысился уровень гемоглобина крови до 120 г/л, снизилась СОЭ до 24 мм/ч, СРБ стал 12 мкмоль/л, общий белок крови повысился до 82 г/л.

При повторном анализе выявили повышение супрессорной активности Т-лимфоцитов периферической крови при индукции заявляемого средства -64,2%. У больной в реакции Оухтерлони на 7, 14 и 28 дни антитела против заявляемого средства не выявлены. Больная выписана домой в удовлетворительном состоянии. Больной рекомендовано амбулаторно продолжить прием нестероидных противовоспалительных препаратов (типа диклофенак), назначить базисные препараты (типа сульфасалазин). Следует отметить, что в течение года у больной не наблюдалось обострения заболевания.

Пример 10. Больной М., 42 лет, находился на лечении с диагнозом: ревматоидный артрит-полиартрит, серопозитивный, с системными проявлениями (амиотрофия, анемия, нейропатия, лихорадка) активность II ст., стадия II, НФСП. При поступлении предъявлял жалобы на боли в суставах - проксимальных межфаланговых, пястнофаланговых кистей рук, лучезапястных, плечевых, коленных, голеностопных, припухлость указанных суставов, ограничение подвижности в них. Жалобы на выраженную скованность в суставах по утрам, продолжающуюся до обеда, онемение кончиков пальцев, повышение температуры тела до субфебрильных цифр.

Считает себя больным в течение 5 лет. Начало заболевания с поражения голеностопных и коленных суставов, в последние 2 года присоединилась припухлость лучезапястных суставов и межфаланговых суставов кистей рук. С этого же времени стал отмечать скованность в суставах по утрам. Проводилось лечение нестероидными противовоспалительными препаратами, метотрексатом с положительным эффектом. Метотрексат отменен 8 месяцев назад из-за побочных эффектов (гепатотоксичность). Настоящее ухудшение наступило 3 недели назад - после острого респираторного заболевания - развилась выраженная припухлость суставов - проксимальных межфаланговых, пястнофаланговых, лучезапястных, коленных, голеностопных, усилилась скованность по утрам (стала продолжаться до обеда), повысилась температура до 37,5. Проводимая терапия нестероидными противовоспалительными препаратами, антибиотиками - без существенного эффекта, в связи с чем госпитализирован. При поступлении обездвижен, ходит с трудом, с палочкой. Дефигурация, припухлость проксимальных межфаланговых и пястнофаланговых суставов кистей рук, лучезапястных, коленных, голеностопных, ограничение активных и пассивных движений в суставах. Гипертермия коленных, лучезапястных и голеностопных суставов. Контрактуры лучезапястных суставов. Выраженные амиотрофии мышц бедер, плечевых. По органам без выраженной патологии.

В анализах крови: Нb - 103 г/л, Л. - 10300, СОЭ - 46 мм/ч, СРБ 78, РФ 110 мкмоль/л, общий белок 70 г/л, АСТ-36, АЛТ-38. Анализ мочи: уд. вес 1023, Л - 1-2 в поле зрения. Рентгенография суставов кистей рук: остеопороз, сужение межсуставных щелей, множественные эрозии. Больному проводилось лечение - нестероидные противовоспалительные препараты (диклофенак в инъекциях, ксефокам в инъекциях), аэртал, физиотерапия.

Состояние без выраженной положительной динамики. Сохранялись субфебрилитет, припухлость суставов, усилилась скованность в суставах. СОЭ повысилась до 50 мм/час, СРБ 92. Супрессорная активность Т-лимфоцитов периферической крови при индукции ТБГ составила 20%.

Назначены инъекции заявляемого средства, содержащего ТБГ 1 мг, Ig-G 19 мг и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH 20 мг в соотношениях 1:19:20 ежедневно в течение 7 дней.

Состояние больного со значительным улучшением. Исчезла скованность в суставах, нормализовалась температура тела. Существенно уменьшились боли в суставах, их припухлость, увеличился объем движений в суставах. Больной свободно ходит по отделению. Активен. Возросла сила сжатия кистей рук с 7 мм рт ст до 92 мм рт ст (левая рука) и до 106 мм рт ст (правая рука). Полностью исчезли припухлость голеностопных и коленных суставов. Повысился уровень гемоглобина крови до 140 г/л. СОЭ снизилась до 22 мм/ч, СРБ стал 12.

При повторном анализе выявили повышение супрессорной активности Т-лимфоцитов периферической крови при индукции заявляемого средства - 60,4%. У больного в реакции Оухтерлони на 7, 14 и 28 дни антитела против заявляемого средства не выявлены. Больной в удовлетворительном состоянии выписан на амбулаторное лечение. Следует отметить, что в течение года у больного не наблюдалось обострения заболевания.

Пример 11.

Больной С., 45 лет, с диагнозом: рассеянный склероз, цереброспинальная форма, ремитирующее течение, стадия обострения процесса. Длительность заболевания - 7 лет. В неврологическом статусе: горизонтальный нистагм при взгляде вправо, сухожильные рефлексы живые, на ногах 0>5. Брюшные рефлексы - верхние низкие, средние и нижние отсутствуют. Симптом Бабинского с двух сторон. Клонусы стоп, грубее справа. Парезов конечностей нет, мышечный тонус не изменен. Походка атактическая. В позе Ромберга неустойчив. Атаксия при выполнении пяточно-коленной пробы. Задержка мочеиспускания. Спинно-мозговая жидкость:

белок - 0,8%, реакция Ланге 66644322.

Осмотр окулиста: побледнение височных половин дисков зрительных нервов. Активность Т-супрессоров периферической крови при индукции ТБГ-12%.

После введения ТБГ 1 мг, Ig-G 19 мг и тетрапептида типа Н-Туг-Х-Y-Glu-OH 20 мг ежедневно в течение 7 дней на следующий день у больного наступили признаки ремиссии. Нормализовалась походка, мочеиспускание. В позе Ромберга устойчив. Пяточно-коленную пробу выполняет четко. Повторная оценка имунного статуса выявила повышение функциональной активности Т-супрессоров периферической крови при индукции ТБГ - 48%. У больного в реакции Оухтерлони на 7,14 и 28 дни антитела против ТБГ не обнаружены. Следует отметить, что в течение года у больного не наблюдалось обострения заболевания.

Пример 12

Больной Д., 33 лет, находился в стационаре с диагнозом: аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура. Госпитализирован с жалобами на появление сыпи, кровоизлияний на коже, головокружение, слабость, повышение температуры до 37,8°C. Заболел 5 дней тому назад после ОРЗ - повысилась температура до 37,8°C, появились боли при мочеиспускании, изменился цвет мочи (моча приобрела красный цвет), появились геморрагические высыпания на коже. Госпитализирован. У родственников больного подобные заболевания отсутствуют. При поступлении: кожные покровы бледные. Мелкоточечные и петехиальные высыпания на коже груди, живота, спины, конечностей, склерах. Умеренное (до 1-1,5 см) увеличение подчелюстных лимфоузлов. Щитовидная железа не пальпируется, периферических отеков нет. Симптом щипка, жгута (+). В легких хрипов нет. Тоны сердца умеренно приглушены, тахикардия до 100 в одну минуту. Пульс ритмичный, удовлетворительного наполнения. АД 105/70 тт Нд. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не увеличены. Симптом Пастернацкого (-). В анализе крови: Нb 94%, Э - 2,4, ретикулоцитов 14%, Л -9,1, п - 3, сегм. - 65, лимф. - 19, м - 7, ЭО3 - 4, СОЭ - 44 мм/ч. Тромбоциты 21 тыс. Общий ан. мочи: уд. вес 1019, белок - следы, Э - сплошь покрывают поле зрения. Л - 2-6 в поле зрения. Биохимический анализ крови: трансаминаза ACT - 41, АЛТ - 29, билирубин 19, холестерин 4,21, глюкоза 5,1, мочевина 4,9, общий белок 79 г/л. Время свертываемости крови 5 мин (М), продолжительность кровотечения по Дюку - 30 мин (норма 5-10). Активированное время рекальцификации 60 с (М), фибриноген 4,2, протромбин 84%, ретракция кровяного сгустка 0,1' (М - 0,3-0,5). НВ₃ - антиген (-), 1_Е-клетки (-), ревмофактор (-), АНФ (-). Стернальная пункция: в костном мозге признаки раздражения эритроидного ростка, количество мегакариоцитов увеличен. Рентгеноскопия органов грудной клетки:

легочные поля прозрачны. Cor - в N. R-графия костей таза, черепа без патологических отклонений. УЗИ печени, почек, селезенки - размеры и текстура органов не изменена. Чашечно-лоханочная система без особенностей. Конкрементов нет.

После введения ТБГ 1 мг с иммуноглобулином G 19 мг и тетрапептидом 20 мг на 2-й день у больного наступили признаки ремиссии. Состояние больного с улучшением - температура нормализовалась, артралгии исчезли, гепатурии нет, геморрагии исчезли. Уровень гемоглобина повысился до 136 г/л, число тромбоцитов увеличилось до 200 тыс. Время кровотечения и ретракция кровяного сгустка нормализовались. Больной выписан домой в удовлетворительном состоянии. Следует отметить, что в течение года у больного не наблюдалось обострения заболевания.

Пример 13. Больная Ц., 45 лет, находилась на стационарном лечении с диагнозом: аутоиммунный тиреоидит, хронический гастрит типа А (аутоиммунный), В₁₂-дефицитная анемия. Поступила с жалобами на общую слабость, похудание, сердцебиение, онемение пальцев ног, неприятные ощущения в эпигастральной области после употребления пищи, нарушение сна, артралгии. В анамнезе хронический гастрит, тиреоидит, ухудшение состояния в течение последнего месяца - появились вышеуказанные жалобы, потеряла в весе 5 кг.

При поступлении: кожные покровы бледные с желтушным оттенком. Периферических отеков нет. Пальпируются подчелюстные лимфоузлы размером 1,2×1,4 см, мягкие, подвижные, умеренно чувствительные. Увеличение щитовидной железы 2-3 степени - железа при пальпации умеренно плотная, подвижная, не спаяна с окружающими тканями, поверхность ее гладкая. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Сог-тоны звучные, тахикардия до 100 в минуту, пульс ритмичный, удовлетворительного наполнения, АД 120/80. Живот мягкий, слегка чувствительный в эпигастрии при глубокой пальпации. Язык красный (малиновый), сосочки атрофированы.

Печень, селезенка не увеличены. Симптом Пастернацкого (-).

Определяется мелкий тремор пальцев вытянутых рук, слегка выражено пучеглазие. Положительны симптомы Мебиуса, Дельримпля.

Анализ крови: Нb - 88 г/л, цветной показатель 1,8, лейкоциты 4,3, п - 3, сегм. 64, лимф. - 34, моноц. - 3. Тельца Жолли и Кэбота. Выражен мегалоцитоз. Определяются полисегментоядерные нейтрофилы, СОЭ - 54 мм/г. Тромбоциты - 120 тыс.

Анализ мочи - уд. вес 1017, белок - abs, А - 3-4 в п/зрения.

Биохимический анализ крови: трансаминазы ACT - 38, АЛТ - 43, холестерин 2,8, билирубин - 21,7, непр. 17, мочевина 5,7, глюкоза 4,1, общий белок 84,3, сывороточное железо 16 (норма). Альбумины - 43%, Глоб.: a₁ - 3,6, a₂ - 15,1, p - 12,1, у - 26,2%, Ревмофактор (-), 1E-клетки не определяются. Определяются антитела к тиреоглобулину в высоком титре. Уровень T₃ и T₄ умеренно повышены. НВ₈-антиген (-).

Стериальная пункция: в костном мозге смешанное нормо- и мегалобластическое кроветворение; красный росток раздражен. Картина B₁₂-дефицитной анемии. Биопсия щитовидной железы: диффузная инфильтрация ткани железы лимфоцитами и плазматическими клетками, поля фиброза - картина аутоиммунного тиреоидита.

Гастродуоденоскопия - картина атрофического гастрита. Гастробиопсия: атрофия желез, снижено количество париетальных клеток, инфильтрация слизистой оболочки плазматическими клетками и нейтрофильными лейкоцитами. Учитывая вышеизложенные данные, больной поставлен диагноз: аутоиммунный тиреоидит, хронический гастрит типа A (аутоиммунный), обострение, B₁₂-дефицитная анемия.

После введения ТБГ 1 мг с иммуноглобулином G 19 мг и тетрапептидом 20 мг на 2-й день у больного наступили признаки ремиссии. Состояние больной с улучшением. Температура нормализовалась. Тахикардии нет. Уровень гемоглобина повысился до 128 г/л. Размеры щитовидной железы уменьшились до 1-2 ст. Больная прибавила в весе 1,5 кг. Титр антител к тиреоглобулину снизился в 4 раза. Число лейкоцитов возросло до 6,8, тромбоцитов до 220 тыс. Больная выписана на амбулаторное лечение. Следует отметить, что в течение года у больной не наблюдалось обострения заболевания.

Для изучения безопасности заявляемого средства, состоящего из ТБГ 1 мг, Ig-G 19 мг и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH 20 мг в соотношениях 1:19:20, до его клинического применения проводили изучение его острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ «Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ», Москва, 2001 г. Результаты исследования показали, что при внутрибрюшинном введении 1000-кратной дозы заявляемого средства не оказывалось острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть его LD₅₀.

Таким образом, предлагаемое средство, состоящее из ТБГ 1 мг, Ig-G 19 мг и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH 20 мг в соотношениях 1:19:20, не является токсичным.

Хотя приведенные выше изобретения были описаны довольно подробно, для среднего специалиста в данной области будет вполне понятно, в свете описания этого изобретения, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации изобретения без отхода от идеи или сферы действия предлагаемой формулы изобретения.

Промышленная применимость

Изложенные преимущества предлагаемого средства, содержащего ТБГ, Ig и тетрапептида типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys (acm) и/или Cys в вышеописанных дозах его использования обеспечивают возможность его широкого применения как в научных исследованиях и в экспериментальной биохимии, так и в практической медицине и ветеринарии.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и иммунологии, и касается создания средства для лечения аутоиммунных заболеваний. Разработанное средство содержит трофобластический β-1-гликопротеин (ТБГ), иммуноглобулин (Ig) и дополнительно содержит тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys (acm) и/или Cys. Данное средство обеспечивает эффективное лечение аутоиммунных заболеваний при введении в разовых дозах, включающих ТБГ 1 мг, Ig 19 мг и тетрапептид 20 мг. 6 табл., 13 пр.

1. Средство для лечения аутоиммунных заболеваний, содержащее трофобластический β-1- гликопротеин (ТБГ) и иммуноглобулин (Ig), отличающееся тем, что оно дополнительно содержит тетрапептид типа H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, причем разовая доза средства составляет ТБГ 1 мг, Ig 19 мг и тетрапептид 20 мг.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве иммуноглобулина используют иммуноглобулин класса G (Ig-G), или класса A (Ig-A), или класса M (Ig-M).