ШТАММ Lactobacillus fermentum, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ КОНСОРЦИУМ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/123 C12R1/225 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской и пищевой промышленности и может быть использовано в производстве бактериальных препаратов и продуктов функционального питания, предназначенных для профилактики и лечения маститов у кормящих грудью матерей.

Микрофлора человека представляет собой систему, объединяющую множество микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих соответствующие биотопы в организме человека. Ведущими микробиоценозами являются желудочно-кишечный тракт, урогенитальный тракт, дыхательный тракт, кожа [1]. На микрофлору организма влияет множество факторов, таких как антибиотики, стресс, нарушения режима питания, экологические нарушения, различные заболевания, все это может привести к развитию дисбактериоза.

Одним из следствий нарушения микробиоценозов желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта и кожи у матерей, кормящих грудью, является возникновение мастита. Острый мастит возникает у женщин в процессе налаживания кормления грудью. Осложнением острого мастита является рецидивирующий мастит, этиологическим агентом которого выступают Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis. Клинические изоляты этих патогенов характеризуются устойчивостью к широкому спектру антибиотиков [2] и способностью использовать олигосахариды женского молока в качестве факторов роста [3].

В общем случае, для восстановления и поддержания нормальной микробиоты актуальным является применение пробиотиков [4]. В частности, важной проблемой является пробиотическая профилактика и терапия мастита, которым, согласно статистическим данным, страдают в период лактации около 30% женщин [2, 5].

Известны штаммы вида Lactobacillus fermentum, применяемые для коррекции дисбактериозов.

Так, известен штамм Lactobacillus fermentum 90-Ts-4, характеризующийся высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию [6], однако недостатком данного штамма является узкий спектр применения, ограничивающийся только решением гинекологических проблем. Известен штамм Lactobacillus fermentum МЕ-3 DSM 14241 [7].

Штамм используется для приготовления лекарственного продукта для профилактики и лечения кишечных и урогенитальных инфекций, а также применяется для приготовления продуктов функционального питания, однако, данные об эффективности его применения для профилактики и лечения маститов у кормящих грудью матерей отсутствуют.

Известен штамм Lactobacillus fermentum TS 3-06 [8]. Штамм используется для изготовления бактериальных препаратов и производства жидкой молочной закваски в качестве продукта питания лечебно-профилактического назначения. Он обладает высокой скоростью роста и устойчивостью к воздействию экстремальных факторов, таких как низкая кислотность и желчь, однако нет данных об эффективности его применения для профилактики и лечения маститов у кормящих грудью матерей.

Известны штаммы лактобацилл (Lactobacillus fermentum CECT 5716 и Lactobacillus salivaris CECT 5713), оральное применение которых снижает бактериальное обсеменение грудного молока стафилококками (Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis) [10]. При этом проявляется лечебный эффект для инфекционных маститов, однако, отсутствуют данные о длительности ремиссии заболевания.

Известен штамм Lactobacillus fermentum Lc40, выделенный из грудного молока здоровой женщины, на основе которого австралийская фирма Puremedic разработала пробиотический препарат QIARA, предназначенный для профилактики и лечения острых маститов [11], однако отсутствуют данные об эффективности этого препарата при лечении рецидивирующих маститов.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента пробиотических штаммов, в частности, обладающих выраженными антагонистическими свойствами по отношению к Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, и пробиотических консорциумов, которые могут быть использованы при получении бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов функционального питания, предназначенных, в частности, для лечения и профилактики инфекционных маститов.

Поставленная задача решена тем, что получен пробиотический штамм Lactobacillus fermentum 3872, а также включающий его консорциум штаммов Lactobacillus fermentum 3872, Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, который обладает пробиотической активностью, и может быть использован для изготовления бактериальных препаратов, а также закваски прямого внесения для ферментации молока и получения кисломолочных продуктов функционального питания, направленных на профилактику и лечение маститов у кормящих грудью матерей.

Штамм Lactobacillus fermentum 3872 выделен из грудного молока при изучении видового спектра лактобацилл у здоровой пары мать-дитя. Данный штамм обнаружен также в кале ребенка и матери и вагинальном секрете матери.

Штамм идентифицирован методом секвенирования гена 16S rRNA, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Московская обл., г. Пущино) и имеет регистрационный номер ВКМ B-2793D.

Штамм характеризуются следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на поверхности агаризованной среды МРС рН-6,5 (Himedia, Индия) методом истощающего штриха в термостате при 37°С в течение 24-48 часов образует колонии средние, белые, круглые, выпуклые с ровным краем.

При выращивании на жидкой среде МРС рН-6,5 (Himedia, Индия) или молоке при 37°С в течение 24-48 часов клетки штамма представляют короткие палочки размером ~3 мкм, цепочек не образуют.

Физиолого-биологические признаки.

Штамм является факультативным анаэробом, температурный оптимум 37±2°С, растет при 42°С, слабый рост при 30°С. Оптимальное значение рН среды 5,5-6,0.

Биохимические свойства.

Способность штамма ферментировать углеводы оценивают в API-тесте в соответствии с инструкцией фирмы производителя (BioMerieux, Франция).

Штамм усваивает D-Рибозу, D-Галактозу, D-Глюкозу, D-Фруктозу, D-Мальтозу, D-Лактозу, D-Мелибиозу, D-Сахарозу, D-Трегалозу, D-Раффинозу API-тест: Lactobacillus fermentum ID=99.8%; Т=0.89.

Геномный фингерпринт

Штаммоспецифичную идентификацию Lactobacillus fermentum 3872 осуществляют методом геномного фингерпринта с использованием праймеров на основе дивергированных инвертированных повторов (DIR) в кодирующих областях генома [13]. DIR-PCR проводят в 25 мкл смеси следующего состава: 1х буфер полимеразы BioTaq (17 мМ (NH₄)SO₄, 6 мМ трис-HCl, рН 8,8, 2,5 мМ MgCl₂), 7,5 нМ dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, 10 пкМ праймера и 1,25 ед. BioTaq DNA Polymerase ("Диалат ЛТД", Россия). Температурно-временной профиль реакции был следующим: первый цикл - 94°С × 30 сек; 30°С × 30 сек, 72°С × 1 мин 30 сек; последующие 43 цикла - 94°С × 5 сек, 30°С × 30 сек и 72°С × 1 мин 30 сек; окончательная элонгация - 7 мин при 72°С. Анализ продуктов ПЦР проводят при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием при напряженности поля 6 В/см.

Результаты, приведенные на фиг.1, показывают, что спектры, полученные на ДНК изолятах Lactobacillus fermentum, выделенных из грудного молока, кала ребенка, вагинального секрета и кала матери, сходны по числу и размеру фрагментов, что свидетельствует об их полной идентичности. Все четыре изолята представляют собой штамм Lactobacillus fermentum 3872, который может обитать в различных биотопах экологической системы «мать-дитя».

Чувствительность к антибиотикам.

Штамм L.fermentum 3872 устойчив к метронидазолу и ципрофлоксацину.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма.

Штамм Lactobacillus fermentum 3872 выращивают при 37±2°С на жидкой среде МРС или в обезжиренном молоке (0,01-0,03% жира).

Коммерчески приобретенное обезжиренное молоко (0,01-0,03% жира) стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0.5 атм и температуре 110°С.

Для выращивания индивидуальных колоний штамма используют агаризованную среду МРС, содержащую 1,4% агара (Difco, США).

Способ, условия и состав сред для хранения штамма

Штамм Lactobacillus fermentum 3872 может храниться:

- в стерильном обезжиренном молоке при 4°С с периодическим пересевом 1 раз в 15-20 дней;

- в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, рН 7,0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°С;

- в замороженном виде при -70°С. Длительность хранения 6 месяцев.

Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, входящие в заявляемый консорциум наряду со штаммом Lactobacillus fermentum 3872, выделены из влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста, идентифицированы методом секвенирования гена 16S rRNA и депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Московская обл., г. Пущино) под следующими регистрационными номерами:

Штамм Lactobacillus crispatus 2029 имеет регистрационный номер ВКМ B-2727D;

Штамм Lactobacillus gasseri 2016 имеет регистрационный номер ВКМ B-2728D;

Штамм Lactobacillus plantarum 2025 имеет регистрационный номер ВКМ В-2731D.

Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 характеризуются следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на поверхности агаризованной среды MPC pH-6,5 (Himedia, Индия) методом истощающего штриха в термостате при 37°С в течение 24-48 часов:

- штамм Lactobacillus crispatus 2029 - колонии средние, бледно-белые, круглые, плоские с ровным краем,

- штамм Lactobacillus gasseri 2016 - колонии мелкие, бледно-белые, круглые, плоские с ровным краем.

- штамм Lactobacillus plantarum 2025 - колонии средние, белые, круглые, выпуклые с ровным краем.

При выращивании на жидкой среде МРС pH-6,5 (Himedia, Индия) или молоке при 37°С в течение 24-48 часов клетки штамма Lactobacillus crispatus 2029 представляют собой средние палочки размером ~5-6 мкм, образуют короткие цепочки; клетки штамма Lactobacillus gasseri 2016 представляют собой средние палочки размером ~4-5 мкм, образуют цепочки, клетки штамма Lactobacillus plantarum 2025 представляют короткие палочки размером ~3 мкм, образуют короткие цепочки.

Физиолого-биологические признаки.

Все штаммы являются факультативными анаэробами, температурный оптимум 37±2°С, растут при 42°С, слабый рост при 30°С. Оптимальное значение рН среды 5,5-6,0.

Биохимические свойства.

Способность штаммов, входящих в состав консорциума ферментировать углеводы оценивали в API-тесте в соответствии с инструкцией фирмы производителя (BioMerieux, Франция).

Штамм Lactobacillus crispatus 2029 усваивает D-Глюкозу, D-Фруктозу, D-Сазарозу, Эскулин железа цитрат.

Штамм Lactobacillus gasseri 2016 усваивает D-Глюкозу, D-Фруктозу, N-Ацетилглюкозамин, Эскулин железа цитрат, D-Сазарозу, D-Трегалозу.

Штамм Lactobacillus plantarum 2025 усваивает D-Рибозу, D-Галактозу, D-Глюкозу, D-Фруктозу, D-Маннит, D-Сорбит, МетилαD-маннопиранозид, N-Ацетилглюкозамин, Амигдалин, Арбутин, Эскулин железа цитрат, Салицин, D-Целлобиозу, D-Мальтозу, D-Лактозу, D-Мелибиозу, D-Трегалозу, D-Сазарозу, D-Мелицитозу, Гентиобиозу и имеет таксономическую характеристику ID=99.8%; Т=0.89.

Чувствительность к антибиотикам.

Штамм L. crispatus 2029 устойчив к линкомицину, метронидазолу, гентамицину и ципрофлоксацину.

Штамм L.gasseri 2016 устойчив к метронидазолу и ципрофлоксацину.

Штамм L.plantarum 2025 устойчив к метронидазолу и ципрофлоксацину.

Способ, условия и состав сред для размножения штаммов консорциума.

Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025 выращивают при 37±2°С на жидкой среде МРС или в обезжиренном молоке (0,01-0,03% жира).

Коммерчески приобретенное обезжиренное молоко (0,01-0,03% жира) стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0.5 атм и температуре 110°С.

Для выращивания индивидуальных колоний штаммов используют агаризованную среду МРС, содержащую 1,4% агара (Difco, США).

Консорциум штаммов Lactobacillus fermentum 3872, Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 может храниться:

- в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, рН 7,0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°С;

- в замороженном виде при -70°С. Длительность хранения 6 месяцев.

Заявленное решение иллюстрируется следующей фигурой:

Фиг.1. Геномные фингерпринты для штамма Lactobacillus fermentum 3872, выделенного из грудного молока при изучении видового спектра лактобацилл у здоровой пары мать-дитя (1), кала ребенка (2), вагинального секрета и кала матери (3, 4), соответственно; L-маркеры молекулярных масс; k - контроль (вода).

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Lactobacillus fermentum 3872 в лабораторных условиях.

Для получения посевного материала в ампулу, содержащую 10 мг лиофилизированной культуры Lactobacillus fermentum 3872, добавляют 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9% и выращивают культуру на поверхности агаризованной среды МРС методом истощающего штриха в термостате при 37°С в течение 18 часов. Затем изолированную колонию помещают в бактериологическую пробирку, содержащую 7 мл жидкой среды МРС и выращивают в термостате при 37°С в течение 15 часов.

Полученный посевной материал в количестве 1% вносят во флаконы, содержащие 500 мл жидкой среды МРС и выращивают при 37°С в течение 18 часов. Титр полученной культуры 2,0×10⁹ КОЕ/мл. Путем доведения концентрации клеток до 6,0×10⁸ КОЕ/мл получают стандартизованную стартовую биомассу штамма Lactobacillus fermentum 3872.

Для длительного хранения клетки освобождают от компонентов среды выращивания путем центрифугирования, переводят в среду высушивания (защитная среда при высушивании - стерильное обезжиренное молоко), расфасовывают по 1 мл в пенициллиновые флаконы и лиофилизируют. В лиофильно высушенном состоянии стартовая биомасса может храниться в течение двух лет при температуре 4°С.

Пример 2. Получение бактериального препарата консорциума штаммов Lactobacillus fermentum 3872, Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025.

Для получения бактериального препарата на основе консорциума штаммов лактобактерий производят механическое смешивание стандартизованных жидких культур штамма Lactobacillus fermentum 3872 и консорциума штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 (далее: консорциум 1)

Консорциум 1 получают следующим образом. Штаммы, составляющие консорциум 1, раздельно культивируют в жидкой среде МРС при 37°С в течение 18 часов, затем доводя концентрацию клеток до 6,0×10⁸ КОЕ/мл, получают стандартизованную стартовую биомассу каждого штамма. Культуры смешивают в равных объемах и получают стартовую биомассу консорциума 1. Стандартная концентрацию клеток каждого штамма в полученной биомассе составляет 2×10⁸ КОЕ/мл.

Стартовую биомассу штамма Lactobacillus fermentum 3872, полученную по примеру 1, смешивают со стартовой биомассой консорциума 1 в соотношении 1:3 по объему, что позволяет получить консорциум (далее консорциум 2), в котором штаммы Lactobacillus fermentum 3872, Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillu splantarum 2025 находятся в равных концентрациях, т.е. в соотношении 1:1:1:1.

Стандартная концентрация клеток каждого штамма в полученной биомассе (стандартизованная стартовая биомасса) составляет 1,5×10⁸ КОЕ/мл. Общий титр - 6,0×10⁸ КОЕ/мл.

Консорциум штаммов Lactobacillus fermentum 3872, Lactobacilltis crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 может быть также получен непосредственным смешением стандартизованных биомасс всех штаммов. При этом для получения консорциума могут быть использованы и другие соотношения исходных штаммов (от 1:100 до 100:1), но соотношение 1:1:1:1 является предпочтительным.

Полученный консорциум лиофилизируют по примеру 1. В лиофильно высушенном состоянии бактериальный препарат может храниться в течение двух лет при температуре 4°С. Общий титр клеток в одном флаконе - 6,0×10⁸ КОЕ.

Данный консорциум может быть использован в качестве бактериального препарата или в качестве закваски прямого внесения для получения ферментированных продуктов.

Пример 3. Оценка активности кислотообразования.

Активность кислотообразования определяют титриметрическим методом [14].

В качестве закваски используют стандартизованную стартовую биомассу штамма Lactobacillus fermentum 3872, полученную по примеру 1, и стартовые биомассы консорциума 1 и консорциума 2, полученные по примеру 2.

Закваски (штамм и каждый консорциум в отдельности) в количестве 1% вносят во флаконы, содержащие молоко 1,5% жирности, и культивируют в течение 24-48 ч при 37°С. Измерения проводят в течение 48 часов. Результат представляют в градусах Тернера (Т° - величина, выражающая количество 0,1 N щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца).

Результаты, приведенные в табл.1, показывают, что штамм Lactobacillus fermentum 3872 сквашивает молоко за 48 часов, кислотность продукта составляет 70,2±1,5°Т.

При инокуляции консорциума 2 образование сгустка происходит за 20 часов и к 48 часам кислотность продукта достигает 106.5±1.4°Т, что соответствует нормативам кисломолочных напитков и йогуртов 70-140°Т. Полученный продукт обладает хорошими вкусовыми свойствами и имеет легкий кисломолочный запах. Проведенные исследования показали, что свойства заявляемого консорциума при использовании его в качестве закваски прямого внесения соответствуют технологическим требованиям производства кисломолочных продуктов.

Пример 4. Способность продуцировать H₂O₂.

Эффективная продукция перекиси водорода (H₂O₂) пробиотическими лактобациллами является одним из основных факторов обеспечивающих колонизационную резистентность микробиоценозов организма [15].

Количественное определение перекиси водорода (H₂O₂), продуцируемое культурами лактобацилл, осуществляют колориметрическим методом, используя хромофор 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) (Sigma) в присутствии пероксидазы хрена (Sigma) [16].

Результаты, приведенные в табл.2 показывают, что наиболее эффективная продукция H₂O₂ отмечалась при культивировании консорциума 2. Концентрация H₂O₂ в среде культивирования в этом случае составляла 148 мг/л.

Пример 5. Исследование устойчивости штаммов к желудочному и кишечному стрессам (способность расти в среде с низким значением рН или в среде, содержащей желчь).

При пероральном применении пробиотических препаратов чрезвычайно важно, чтобы штаммы лактобацилл, входящие в консорциум, были устойчивы к желудочному и кишечному стрессам.

При исследовании используют следующие методики.

Имитация желудочного стресса in vitro

Композиция искусственного желудочного сока:

NaCl (SigmaS9625) 2.2 г/л L-молочная кислота (SigmaLl 750) 9.9 г/л (0,11 М) Pepsin (SigmaP7125) 3.5 г/л рН: 2.7±0.02 (доводят 35% NaOH) pH после разведения 1/11: 3.10±0.10 (контролируют для каждой культуры)

1 мл искусственного желудочного сока добавляют к 100 мкл культуры в стационарной фазе (1/11 разведение). Культуры инкубируют в течение 10 минут, 30 минут и 60 минут при 37°С, 10% CO₂. В качестве контроля вместо искусственного желудочного сока используют 1 мл МРС. Измерения выполняют в двух повторах для каждой культуры.

После инкубации культуру (каждую повторность и контроля) разводят от 10² до 10⁹ или 10¹⁰ в МРС, разведения высевают на чашках с МРС-агаром и инкубируют в течение 24-48 часов при 37°С, 10% CO₂). Определяют титр культуры в условиях стресса и без стресса путем подсчета количества колоний для разведении.

Имитация кишечного стресса in vitro

Композиция искусственного кишечного сока:

Желчные соли (желчь свиньи SigmaB8631) 3,3 г/л (конечная концентрация: 0.3%)

Карбонатный буфер NaHCO₃ (Sigma S8875) 16.5 г/л (конечная концентрация: 1.5%), рН: 6.3.

1 мл искусственного кишечного сока добавляют к 100 мкл культуры в стационарной фазе (1/11 разведение). Культуры инкубируют в течение 5 часов, при 37°С, 10% CO₂. В качестве контроля используют 1 мл МРС. Измерения выполняют в двух повторах для каждой культуры.

Культуры и контроли разводят от 10² до 10⁹ или 10¹⁰ в МРС, разведения высевают на чашках с МРС-агаром и инкубируют в течение 24-48 часов при 37°С, 10% CO₂. Определяют титр в условиях стресса и без стресса путем подсчета количества колоний для разведении.

Подсчет микроорганизмов в миллилитре культуры КОЕ осуществляют по формуле:

где: ∑C - сумма всех характерных колоний, подсчитанных на всех чашках, содержащих от 15 до 300 колоний;

n₁ - количество чашек, в самом низком разведении (2 чашки на разведение);

n₂ - количество чашек, в самом высоком разведении (2 чашки на разведение);

d - величина первого разведения (низкое разведение), взятого для подсчета.

Для определения устойчивости лактобацилл к желудочному и кишечному стрессам используют культуры в стационарной фазе роста, выращенные на жидкой среде МРС, рН-6,5 в течение 18 часов при 37°С, 10% CO₂.

Результаты, приведенные в табл.3 показывают, что штамм Lactobacillus fermentum 3872 является устойчивым к желудочному и кишечному стрессам.

Таким образом, показано, что все штаммы, входящие в консорциум 2 являются устойчивыми к воздействию экстремальных факторов, таких как низкая кислотность и содержание желчи и, следовательно, консорциум 2 является перспективным для использования в медицинской и пищевой промышленности для получения лекарственных препаратов и для приготовления продуктов функционального питания.

Пример 6. Исследование адгезии штамма Lactobacillus fermentum 3872 к перевиваемым клеткам Hela.

Адгезивность пробиотических бактерий рассматривается как положительный признак, позволяющий обеспечить защиту макроорганизма от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В частности, пробиотические лактобациллы, обладающие адгезивностью к эпителию урогенитального тракта, перспективны для профилактики и лечения урогенитальных инфекций [17].

Культуры клеток Hela выращивают в среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки + 1% пенициллин-стрептомицин + 0,2 мМ Hepes + 2 мМ L-глутамин при 37°С в CO₂-инкубаторе. Клетки в концентрации 3,0×10⁵ кл/мл высевают на 6-луночные планшеты в объеме 2,0 мл на лунку и культивируют 24 часа. По достижению 70-80% монослоя, клетки 3-кратно промывают средой ДМЕМ без сыворотки и затем к ним добавляют среду ДМЕМ с L-глутамином. Перед добавлением бактерий к клеткам Hela (18 часовая культура на среде МРС) их дважды промывают PBSpH 7,2, используя центрифугирование при 5000 об/мин в течение 15 минут, и ресуспендируют в среде ДМЕМ с L-глутамином. Концентрацию бактерий для определения соотношения бактерия/соматическая клетка регулируют по оптической плотности (ODλ=590 nm) и контролируют высевом на соответствующие твердые среды. Множественность инфицирования (MOI) составляет 50 и 100 бактерий/клетка. Клетки Hela с внесенными к ним лактобациллами инкубируют еще 5 часов при 37°С в СО₂-инкубаторе. После инкубации клетки промывают 3-х кратно PBS рН 7,2, затем фиксируют в холодном этаноле (3 мин) и окрашивают красителем Романовского-Гимза в течение 30 мин. Далее планшеты промывают дистиллированной водой, высушивают при комнатной температуре и исследуют микроскопически. Осуществляют подсчет количества клеток Hela с прикрепившимися бактериями (процент адгезии) и количество бактерий, прикрепившихся к одной клетке (индекс адгезии).

Проведенные исследования показали, что для штамма Lactobacillus fermentum 3872 процент адгезии составляет 89±4, индекс адгезии был равен 29±5, что свидетельствует о выраженной способности штамма Lactobacillus fermentum 3872 к адгезии на клеткам Hela.

Пример 7. Исследование адгезии штамма Lactobacillus fermentum 3872 к клеткам буккального эпителия.

Изучение адгезии к клеткам буккального эпителия осуществляют по методу, описанному в работе [18]. Множественность инфицирования составляла 100 бактерий на клетку. Клетки буккального эпителия с внесенными к ним лактобациллами инкубируют 5 ч при 37°С в CO₂-инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% CO₂).

Полученные результаты показали, что для штамма Lactobacillus fermentum 3872 процент адгезии составляет 94±3, индекс адгезии равен 28±7.

Данные свидетельствуют о выраженной способности штамма Lactobacillus fermentum 3872 к адгезии на поверхности буккального эпителия.

Пример 8. Исследование антагонистической активности штамма Lactobacillus fermentum 3872, консорциума 1 и консорциума 2.

Исследование антагонистической активности культур лактобацилл проводят методом двухслойного агара [9]. Результаты исследований представлены в табл.4.

Различия в антагонистической активности штамма L.fermentum 3872 и консорциума 1, содержащего штаммы L.crispatus 2029, L. gasseri 2012, L.plantarum 2025 по отношению к S. aureus SA40 и S. epidermidis SE8 (клинические изоляты из грудного молока женщин с диагнозом рецидивирующий мастит), являются статистически недостоверными. Добавление штамма L.fermentum 3872 к консорциуму 1 приводит к достоверному увеличению антагонистической активности нового пробиотика - консорциума 2 по сравнению с консорциумом 1 и отдельно используемым штаммом L.fermentum 3872 (p<0,05).

Антагонистическая активность консорциума 1 по отношению к G.vaginalis (этиологический агент бактериального вагиноза) достоверно выше по сравнению со штаммом L.fermentum 3872 (р<0,05). При совместном применении штамма L.fermentum 3872 со штаммами консорциума 1 L.crispatus 2029, L. gasseri 2012, L. plantarum 2025 (консорциум 2) отмечается синергизм их действия. Антагонистическая активность консорциума 2 достоверно выше по сравнению с консорциумом 1 (р<0,05).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что консорциум 2 проявляет более выраженную антагонистическую активность по сравнению с консорциумом 1 и штаммом L.fermentum 3872.

Пример 9. Приготовление кисломолочных продуктов с использованием штамма Lactobacillus fermentum 3872, консорциума 1 и консорциума 2.

Кисломолочные продукты на основе штамма Lactobacillus fermentum 3872, консорциума 1 или консорциума 2 могут быть получены как с использованием жидкой стандартизованной стартовой биомассы, так и с использованием лиофилизированного биологического препарата. При этом продукт функционального питания может быть получен как путем добавления закваски в подходящую среду (например, стерилизованное молоко с жирностью 1,5%) и последующего культивирования, так и путем введения закваски в уже готовый кисломолочный продукт непосредственно перед применением.

а) Стандартизованные стартовые биомассы штамма Lactobacillus fermentum 3872 (по примеру 1), консорциума 1 и консорциума 2 (по примеру 2) (отдельно штамм и каждый консорциум) в объеме 5% вносят в стерильное молоко, перемешивают и культивируют при температуре 37°С в течение 20-24 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают до 4°С и расфасовывают. В результате получают кисломолочные продукты функционального питания с содержанием полезной микрофлоры не менее 10⁸ КОЕ/мл.

б) Непосредственно перед употреблением продукт может быть получен следующим образом: в два флакона, содержащих лиофилизированный препарат, например, консорциум 2, полученный по примеру 2, добавляют по 1 мл кипяченой теплой воды не выше 37°С, препарат растворяют, содержимое выливают в 100 мл кефира и перемешивают. Полученный продукт готов к употреблению.

Пример 10. Безвредность консорциума, содержащего штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, Lactobacillus fermentum 3872.

Кисломолочный продукт на основе консорциума 2, полученный по примеру 9а, в течение двух месяцев употребляли в пищу волонтеры из числа сотрудников отдела биохимии иммунитета ОАО «Институт инженерной иммунологии». В результате данного исследования побочных эффектов, вызванных регулярным длительным потреблением кисломолочного продукта, изготовленного с использованием консорциума 2, выявлено не было.

Пример 11. Использование кисломолочного продукта функционального питания с целью лечения и профилактики кандидоза (молочницы) у женщин репродуктивного возраста.

Двенадцать женщин-добровольцев возраста 24-35 лет с диагнозом кандидоз (молочница), подтвержденным лабораторным анализом, были разделены на три группы, по четыре в каждой группе. Первая группа ежедневно в течение 14 дней выпивала во время ужина по 100 мл кисломолочного продукта, полученного с использованием консорциума 2 по примеру 9а. Вторая группа ежедневно в течение 14 дней выпивала по 100 мл кисломолочного продукта, полученного с использованием консорциума 2 по примеру 96. Третья группа (контрольная) ежедневно в течение 14 дней выпивала во время ужина по 100 мл кефира, не обогащенного препаратом консорциума. Через 14 дней у женщин первой и второй групп исчезли симптомы, характерные для кандидоза (молочницы). Уровень С.albicans в вагинальном отделяемом первой и второй групп снизился с 10⁵ КОЕ/мл до 10² КОЕ/мл, что соответствует норме. Побочные эффекты от приема кисломолочных продуктов функционального питания, содержащих консорциум 2, отсутствовали. В третьей группе симптоматика кандидоза сохранилась.

Результаты исследований свидетельствуют о перспективности использования консорциума пробиотических штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, Lactobacillus fermentum 3872 для получения кисломолочных продуктов функционального питания с целью профилактики и лечения кандидоза. Способ прост, экономичен, доступен и может быть эффективно применен в домашних условиях.

Пример 12. Сравнительная оценка эффективности применения кисломолочных продуктов, полученных при использовании в качестве заквасок прямого внесения Lactobacillus fermentum 3872, консорциума 1 и консорциума 2 в комплексном лечении рецидивирующего мастита.

В эксперименте участвовали двенадцать женщин-добровольцев возраста 27-36 лет с диагнозом рецидивирующий мастит, прошедших предварительно курс антибиотикотерапии в течение 14 дней под контролем лечащего врача. До проведения антибиотикотерапии у всех женщин в грудном молоке были обнаружены Staphylococcus aureus (1,3×10⁴-2,6×10⁴ KOE/мл) и Staphylococcus epidermidis (2,3×10⁴-3,5×10⁴ КОЕ/мл). В клинической микробиологической лаборатории была определена чувствительность выделенных изолятов к различным антибиотикам и под контролем лечащего врача был проведен курс антибиотикотерапии мастита. Через трое суток антибиотикотерапии самочувствие всех пациенток улучшилось и появились признаки выздоровления, однако традиционный этиотропный курс лечения мастита продолжался на протяжении 14 дней. После проведенного курса антибиотикотерапии у всех пациенток в грудном молоке было обнаружено снижение уровня Staphylococcus aureus до 1,5×10²-2,4×10² КОЕ/мл и Staphylococcus epidermidis 2,6×10²-3,2×10² КОЕ/мл. Данный момент явился началом эксперимента.

Женщины были разделены на 4 группы по три участницы в каждой группе.

Первая группа ежедневно в течение 10 дней выпивала во время ужина по 150 мл кисломолочного продукта, в котором в качестве закваски прямого внесения использовался штамм Lactobacillus fermentum 3872.

Вторая группа ежедневно в течение 10 дней выпивала во время ужина по 150 мл кисломолочного продукта, в котором в качестве закваски прямого внесения использовался консорциум 1, содержащий Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2012, Lactobacillus plantarum 2025.

Третья группа ежедневно в течение 10 дней выпивала во время ужина по 150 мл кисломолочного продукта, в котором в качестве закваски прямого внесения использовался консорциум 2, содержащий Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2012, Lactobacillus plantarum 2025, Lactobacillus fermentum 3872.

Четвертая группа (контроль) ежедневно в течение 10 дней выпивала во время ужина по 150 мл кисломолочного продукта, не содержащего Lactobacillus fermentum 3872, а также лактобацилл, входящих в состав консорциумов 1 и 2.

После окончания курса пробиотикотерапии все участницы эксперимента находились под наблюдением в течение 180 дней. Эффективность пробиотического действия Lactobacillus fermentum 3872, консорциума 1 и консорциума 2 оценивалась по длительности ремиссии рецидивирующего мастита. Результаты исследований приведены в табл.5.

В группе 4 (контроль) длительность ремиссии составляла 36-54 дня после антибиотикотерапии. В группах 1 и 2 длительность ремиссии после пробиотикотерапии составляла 92-128 дней и 85-116 дней, соответственно. У всех женщин группы 3 рецидивы заболевания отсутствовали на протяжении 180 дней наблюдения.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что наиболее перспективным для комплексного лечения рецидивирующего мастита является консорциум 2, содержащий Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, Lactobacillus fermentum 3872.

Литература

1. Дисбиоз кишечника: руководство по диагностики и лечению. / Под ред. Е.И. Ткаченко и А.Н. Суворов. СПб.: 2006-196 с.

2. World Health Organization. 2000. Mastitis: causes and management. World, Geneva, Switzerland.

3. Hunt K., Prruss J., Nissan C. etal. Human milk oligosaccharides promote the growth of Staphylococci. Applied and Environmental Microbiol.2012, 78 (14):4763-4770. DOI: 10.1128/AEM.00477-12.

4. Шендеров Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Изд-во Гранть, 1998, 416 с.

5. Foxman, В., H.D'Arcy, В. Gillespie, J.К. Bobo, and K. Schwartz.2002. Lactation mastitis: occurrence and medical management among 946 breastfeeding women in the United States. Am. J.Epidemiol. 155:103-114.

6. Патент RU 2133272 C1, опубликован 20.07.1999, приоритет с 11.06.1998.

7. Патент WO 03002131.

8. Патент RU 2391395.

9. -Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - 5. - С.94-98.

10. Arroyo R., Marti'n V., Maldonado A., Jime' nez E., Ferna'ndez L., Rodri'guez J.M. Treatment of Infectious Mastitis during Lactation: Antibiotics versus Oral Administration of Lactobacilli Isolated from Breast Milk. Clinical Infectious Diseases 2010; 50(12):1551-1558.

11. Starling S. Breast milk probiotic targets Spanish mammary inflammation, 2012.

http://www.nutraingredients.com/Industry/World-first-Breast-milk-probiotic-launched-in-Australia/?utm_source=newsletter_daily&utm_medium=email&utm_campaign=Newsletter%2BDaily&c=Q2d2CeJrV5ZZl3MYnRwlMw%3D%3D

12. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., and Struhl K. Current protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. New York. 1994.

13. Цыганкова С.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Хабибулин С.С., Дорошенко Е.В., Эль-Регистан Г.И. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации // Микробиология. 2004. Т.73. №3. С.398-405.

14. ГОСТ 3624-92. Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности.

15. Reid G. Probiotic agents to protect the urogenital tract against infections. Am. J. Clin. Nutr., 2001, 73 (Suppl.):437-443.

16. Martin R., Suárez J. Biosynthesis and Degradation of H₂O₂ by Vaginal Lactobacilli. 2010. Appl. Environ. Microbiol. vol.76 no. 2 p.400-405.

17. Reid G. Probiotic Lactobacilli for urogenital health in women. J. Clin. Gastroenterol. 2008 Sep; 42 Suppl 3 Pt 2:S234-6.2008.

18. RU 2210770.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus fermentum ВКМ В-2793D, обладающий антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Также предложен консорциум штаммов Lactobacillus fermentum ВКМ В-2793D, Lactobacillus crispatus ВКМ В-2727D, Lactobacillus gasseri ВКМ B-2728D, Lactobacillus plantarum ВКМ В-273D, обладающий пробиотическим действием и используемый для изготовления бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов функционального питания. Консорциум обладает более высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам по сравнению с отдельными штаммами лактобацилл, входящими в его состав. Группа изобретений позволяет расширить ассортимент пробиотических штаммов, а также средств для профилактики и лечения маститов у кормящих грудью матерей. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 12 пр.

1. Штамм бактерий Lactobacillus fermentum BKM B-2793D, обладающий антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

2. Консорциум штаммов Lactobacillus fermentum BKM B-2793D, Lactobacillus crispatus BKM B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D, Lactobacillus plantarum BKM B-2731D, обладающий пробиотическим действием и используемый для изготовления бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов функционального питания.