ШТАММ Lactobacillus fermentum TS3-06, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ПРОИЗВОДСТВА ЖИДКОЙ МОЛОЧНОКИСЛОЙ ЗАКВАСКИ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУКТА ПИТАНИЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к штаммам лактобацилл, применяемым в медицинской и пищевой биотехнологии. Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 обладает выраженными антагонистическими свойствами по отношению к Klebsiella pneumoniae, Е. coli, Pseudomonas aeruginosa. В геноме штамма обнаружены гены, кодирующие синтез бактериоцинов. Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 является устойчивым к воздействию экстремальных факторов, таких как низкая кислотность и содержание желчи, и может быть использован в медицинской, пищевой и микробиологической промышленности для получения лекарственных препаратов и для приготовления продуктов питания.

Микрофлора человека представляет собой систему, состоящую из множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих соответствующие биотопы в организме человека. Ведущими микробиоценозами являются кишечник, урогенитальный тракт, легкие и кожа [1]. На микрофлору организма влияет множество факторов, среди них - различные заболевания, антибиотики, стрессы, нарушения режима питания, - все это приводит к развитию дисбактериоза. Потому для восстановления и поддержания свойственной для каждого конкретного индивидуума микробиоты является актуальным применение нового класса препаратов - пробиотиков, основу которых составляют определенные виды непатогенных для человека бактерий [2]. Так, сегодня известны пробиотические бактерии, используемые для производства как молочнокислых продуктов, так и лекарственных препаратов.

Известен штамм Lactobacillus acidophilus 100Аш, который входит в состав пробиотического препарата «Ацилакт» [3]. Штамм имеет широкий спектр антагонистической активности против условно-патогенных и патогенных микроорганизмов за счет продукции кислот и антибиотических веществ, и применяется для восстановления нормофлоры желудочно-кишечного и урогенитального тракта, однако нет данных о выживаемости данного штамма в условиях воздействия пониженной кислотности и присутствия желчи, которые могут существенно снижать эффективность препарата.

Известен штамм лактобактерий Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (NCC 2461), используемый фирмой «Нестле», обладающий способностью предотвращать колонизацию кишечника патогенными бактериями, вызывающими диарею, и предотвращать заражение эпителиальных клеток кишечника ротавирусами [4], однако для этого штамма также нет данных о его выживаемости в условиях воздействия факторов агрессии, которые могут существенно снижать эффективность препарата.

Известен штамм Lactobacillus plantarum Р-19, применяемый для производства пробиотика бифицина, применяемого для лечения заболевание желудочно-кишечного тракта животных [5], однако данный штамм применяется в ветеренарии и предназначается для лечения желудка и кишечного тракта телят и поросят.

Известны другие штаммы Lactobacillus fermentum, применяемые для коррекции дисбактериозов. Наряду с другими пробиотическими микроорганизмами этот вид отличается эффективностью в отношении урогенитальных инфекций. Так, известен штамм Lactobacillus fermentum 90-Ts-4 - отобранный вариант из «Лактобактерина», характеризующийся высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию [6], однако недостатком данного штамма является узкий спектр применения, ограничивающийся только решением гинекологических проблем.

Известен наиболее близкий по техническому результату к заявленному штамму штамм Lactobacillus fermentum МЕ-3 DSM 14241, выбранный в качестве прототипа. Он используется для приготовления лекарственного продукта для профилактики и лечения кишечных инфекций и уроинфекций, а также применяется для приготовления функциональных пищевых продуктов [7].

Недостатками штамма, выбранного в качестве прототипа, являются более низкая скорость роста, по сравнению с предлагаемым штаммом, в результате использования которого можно существенно снизить время культивирования; отсутствие данных о спектре антагонистической активности известного штамма и отсутствие данных об устойчивости штамма в условиях воздействия кислот и желчи.

Заявленный новый штамм - Lactobacillus fermentum TS3-06, выделенный из кисломолочной закваски, используемой для получения простокваши, имеет более высокие технологические характеристики по сравнению с известным штаммом, выбранном в качестве прототипа.

Техническим результатом заявленного изобретения является более высокая скорость роста, высокая устойчивость к воздействию экстремальных факторов, таких как низкая кислотность, содержание желчи, устойчивость к антибиотикам.

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 был получен путем множественных пересевов индивидуальных колоний лактобацилл на плотных питательных средах с последующим выяснением антагонистической активности, устойчивости к антибиотикам и молекулярно-генетических характеристик отдельных клонов. В результате был отобран клон, идентифицированный как штамм Lactobacillus fermentum TS3-06.

Полученный штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 депонирован в ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН под регистрационным номером «№1073 ГУНИИЭМ». Адрес коллекции ГУ НИИ экспериментальной медицины: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12. Уведомление прилагается к материалам данной заявки.

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» был многократно апробирован в лабораторных условиях на базе Научно-Исследовательского Института Экспериментальной Медицины Российской Академии Медицинских Наук (НИИЭМ РАМН). Как показали результаты микробиологических исследований, заявленный штамм обладает многими качественными характеристиками, превышающими известный мировой уровень.

1. Культурально-морфологические признаки штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ»

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» относится к семейству Lactobacillaceae, виду Lactobacillus, подвиду fermentum согласно определителю бактерий Берджи [8]. Клетки бактерий палочковидные, правильной формы, при росте в жидкой среде соединены в короткие цепочки. Бактерии относятся к грамположительным, спор не образуют. Размер клеток зависит от среды выращивания: так, на агаризованной среде МРС размер палочек - 0,5×1,0 мкм, на жидких средах и на триптозном агаре - 0,5-1,0×2,0-8,0 мкм.

На фиг.1 представлено изображение штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 (увеличение в 1350 раз), выращенного на 1,5% молоке в течение 16 часов при 37°С.

При выращивании на 1,5% молоке (посевная доза 1%) при температуре 37°С заквашивание молока происходит на 8 час культивирования; при выращивании на бульоне МРС в течение 24 часов при температуре 37°С образуется равномерная муть и осадок на дне; при росте в плотной среде - бежевые колонии в форме гречишного зерна 1,0-1,5 мм в диаметре. На поверхности плотной агаризованной среды формируются круглые каплевидные бежевые колонии с ровным краем, размер 1-2 мм, поверхность гладкая, блестит. Рост по штриху умеренный. Пигментов, дифундирующих в среду, штамм не образует.

2. Физиолого-биохимические признаки штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ»

Отношение к кислороду:

Факультативный анаэроб.

Общие биохимические свойства:

Каталазоотрицательный, цитохромов не содержит. Нитраты не редуцирует; желатину не разжижает. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический.

Характер роста на средах с молоком:

Молоко сбраживает без образования сгустка. При выращивании в течение 6 часов pH снижается до 5,5; через 24 часа культивировании pH снижается до 4,5.

Особенности роста:

Температурный оптимум 37±2°С. Растет при 42°С. Слабый рост при 15°С. Оптимальное значение pH среды 5,5-6,0. Сохраняет жизнеспособность в диапазоне pH от 2,5 до 10. Растет при содержании желчи в среде до 2,5%.

Чувствительность к антибиотикам:

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» характеризуется высокой чувствительностью к гентамицину, оксациллину, цефазолину, амоксиклаву и тетрациклину. Выраженная устойчивость к ципрофлоксацину, норфлоксацину, ванкомицину.

Антагонизм к другим бактериям:

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» проявляет выраженные антагонистические свойства по отношению к Klebsiella pneumoniae, Е. coli, Pseudomonas aeruginosa. Антагонистическая активность Lactobacillus fermentum TS3-06 по отношению к перечисленным видам микроорганизмов представлена на фиг.2, на которой изображена минимальная ингибирующая концентрация антагониста, при которой происходит подавление роста индикаторных культур. Как видно из фиг.2, необходимо около 10⁸ в 1 мл клеток Lactobacillus fermentum TS3-06, чтобы подавить рост 10⁸ в 1 мл клеток Klebsiella pneumoniae и всего 10 в 1 мл клеток Lactobacillus fermentum TS3-06 для подавления роста 10⁸ в 1 мл клеток Е. coli или Pseudomonas aeruginosa.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» выращивают при 37±2°С в среде на основе соевого белка (1.5%) "Supro Plus 2640" (Protein Technologies International) или в молоке с 1.5% жира. Для приготовления среды на основе "Supro Plus 2640" к 15 г соевого белка добавляют 1 литр воды, доводят pH до 7,0 и стерилизуют автоклавированием под давлением 1 атм 20 минут при 110-120°С. Коммерчески приобретенное молоко с 1.5% жирности стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0.5 атм и температуре 110-120°С.

Для выращивания индивидуальных колоний штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 используют 1% агар МРС-4 (Ман, Рогоза, Шарп) (НИЦФ, Россия).

Для проведения анализов, требующих прозрачные среды для выращивания, используют бульон МРС (Ман, Рогоза, Шарп) (Hi Media, Индия). Культивирование проводят при 37±2°С в течение 24-48 часов.

Способ, условия и состав сред для хранения штамма:

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» хранят в стерильном обезжиренном молоке при 4°С с периодическим пересевом 1 раз в 15-20 дней, либо в сублимированном виде в запаянных ампулах (длительность хранения 2 года и более). Защитная среда при высушивании - сахароза 10%, pH 7,0. Возможно хранение в замороженном виде при -70°С в течение 6 месяцев.

Свойства штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ» стабильны и не меняются при хранении, в процессе культивирования и при воздействии экстремальных факторов, что позволяет судить об его промышленной применимости.

Стабильность сохранения полезного свойства при длительном культивировании штамма Lactobacillus fermentum TS3-06:

Длительность культивирования штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 на жидких и агаризованных питательных средах (не менее 20 пересевов) не сопровождалось изменением спектра устойчивости к антибиотикам, антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам и другим признакам штамма Lactobacillus fermentum TS3-06, перечисленным выше.

3. Генетическая характеристика штамма Lactobacillus fermentum TS3-06:

Для облегчения видовой идентификации природного штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 как вида семейства Lactobacillaceae - Lactobacillus fermentum, участок хромосомной ДНК предлагаемого штамма был исследован методами молекулярной генетики и впоследствии был идентифицирован и сравнен с аналогичными участками других видов микроорганизмов.

ДНК штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 под «№1073 ГУНИИЭМ», соответствующая области кодирования рибосомального оперона (16S РНК) была просеквенирована методом Sanger. В результате установлена нуклеотидная последовательность, которая позволяет идентифицировать данный штамм в любых препаратах или продуктах его содержащих.

TGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTG

ATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAG

GTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAA

TACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCT

TCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTG

GGGTAA

Данная последовательность при сравнении с банком данных нуклеотидных последовательностей GenBank характеризуется гомологией 100% с другими штаммами Lactobacillus fermentum. Эти данные подтверждают принадлежность данного штамма к виду Lactobacillus fermentum. Данная нуклеотидная последовательность была депонирована в банк данных нуклеотидных последовательностей GenBank NCBI и ей присвоен номер bankit1046290. Копия учетной записи из оригинальной базы данных GenBank NCBI прилагается к материалам данной заявки.

4. Вирулентность:

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 был изолирован из простокваши и является безвредным для человека и животных. Молочнокислую закваску, полученную заквашиванием молока данным штаммом, в течение месяца употребляли в пищу волонтеры из числа сотрудников отдела молекулярной микробиологии ГУ НИИЭМ РАМН. В результате данного исследования побочных эффектов выявлено не было.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Lactobacillus fermentum TS3-06.

Пример 1

Результаты выращивания жидкой культуры штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 в условиях микробиологической лаборатории

Для получения посевного материала в ампулу с лиофилизированной культурой, содержащей 10 мг сухого вещества, добавляют 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9%. Посевной материал получают выращиванием микробной культуры штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 на поверхности агаризованной среды МРС (Hi Media, Индия) методом истощающего штриха в термостате при 37°С в течение 18-20 часов.

Индивидуальные клоны штамма Lactobacillus fermentum TS3-06, выросшие на поверхности агара, помещаются в бактериологические пробирки, содержащие 7 мл среды "Supro Plus 2640" или молока и выращивают в термостате при 37°С в течение 14-16 часов. Выросшие в жидкой среде лактобациллы обуславливают сквашиванием молока или среды "Supro Plus 2640". Из аликвот, взятых из полученной культуры, готовят мазки, окрашенные метиленовой синью. В мазках должны обнаруживаться одиночные и соединенные в короткие цепочки палочки размером 0,5×3,0 мкм. В препаратах не должно быть посторонней микрофлоры. Полученный посевной материал используют для получения стартовой биомассы. Посевной материал вносят во флаконы, содержащие 300-500 мл стерильного молока, в количестве 5% и выращивают при 37°С в течение 14-16 часов. Стартовая биомасса может быть использована для выращивания больших объемов биомассы для производства жидких молочнокислых заквасок на основе штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 или сухих бактериосодержащих продуктов.

Пример 2

Результаты исследования штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 по характеру антагонизма к патогенным бактериям

Для определения антагонистической активности штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 использовался метод двухслойного агара [9]. Предварительно выращенные в течение 12-18 ч исследуемые культуры в различных концентрациях помещали в агаризованную среду МРС, формируя нижний слой. Для этого проводили ряд последовательных разведений культур в стерильном 0,5% водном растворе NaCl. Затем 1 мл суспензии клеток помещали в 9 мл агаризованной среды, охлажденной до 45°С. После застывания сверху наносили триптозный агар (10 г/л триптон (Difco, США), 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, рН 7,0) в количестве 10 мл. Через 24 ч инкубации засевали по 10 мкл индикаторных культур (Klebsiella pneumoniae cl. is., Enterococcus faecalis ATCC 29212, E.coli ATCC 25922, E.coli Ml5, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Pseudomonas aeruginosa cl. is., Candida albicans ATCC 869) в количестве 3×10⁸ КОЕ/мл. Засеянные среды инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Антагонистическую активность исследуемых культур выражали минимальной ингибирующей концентрацией антагониста (МИКА) - это минимальное количество антагониста, ингибирующего размножение патогенных бактерий и грибов. Показатели минимальной ингибирующей концентрации штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 представлены в таблице 2.

Таблица 1 Индикаторная культура МИКА, lg KOE/мл Klebsiella pneumoniae cl. is. 8,0±0,4 E.coli Ml5 4,0±0,4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 4,0±0,4 Pseudomonas aeruginosa cl. is. 4,0±0,4

Полученные результаты исследования антагонистической активности штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 свидетельствуют о том, что данный штамм характеризуется высоким уровнем, антагонизма к показанным штаммам.

Пример 3

Результаты исследования штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 на способность развиваться в среде с содержанием желчи

В ростовую среду - жидкую среду МРС, содержащую от 0 до 10% желчи, добавлялся 1% (объемный) исследуемой культуры в стационарной фазе роста. Засеянные среды инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Оценку роста проводили по оптической плотности суспензии клеток на СФ при длине волны 600 нм. В таблице 3 представлены концентрации клеток штамма Lactobacillus fermentum TS3-06, выросших на среде с различным содержанием желчи.

Таблица 2 Концентрация желчи, % Оптическая плотность суспензии клеток (600 нм) 10 - 5 - 2,5 0,12±0,02 1,25 0,16±0,02 0,625 0,18±0,02 0,3 0,18±0,02 0,15 0,16±0,02 0 2,45±0,02

Таким образом, можно сделать вывод о том, что культура штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 способна расти на среде с содержанием желчи 2,5% и менее.

Пример 4

Результаты исследования штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 на выживаемость в условиях низких pH

Для определения устойчивости микроорганизмов в низким pH использовали методику, предложенную К.Дунн (C.Dunne) и соавторами [10]. Предварительно выращенную в течение 18 ч культуру штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 осаждали центрифугированием, затем ресуспендировали в среде МРС с pH 1,2 и 2,5. Кислотность среды доводили до необходимой одномолярной соляной кислотой. Пробы отбирали с момента внесения культуры в среду (0 мин), затем через 5, 30 и 60 минут. Для определения числа клеток в среде использовали метод высева на плотные питательные среды (метод Коха). Выживаемость исследуемых культур при различных значениях pH (lgKOE/мл) представлены в таблице 3.

Таблица 3 Культура pH Время инкубации, мин 0 5 30 60 штамм Lactobacillus 1,2 8,8±0,1 0 0 0 fermentum TS3-06 2,5 8,9±0,1 8,8±0,1 8,8±0,1 8,7±0,1

Из приведенных данных можно сделать вывод о том, что культура штамма Lactobacillus fermentum TS3-06 сохраняет свою жизнеспособность при pH 2,5.

Как показали результаты исследований в течение более двух лет, заявленный новый штамм молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus fermentum TS3-06 показал стойкие качественные характеристики, являющиеся преимуществом для использования в промышленном производстве, и может стать основой для создания новых лекарственных препаратов и пищевых продуктов лечебно-профилактического назначения, который будет иметь терапевтическую эффективность. Данный вид микроорганизмов особенно полезен для женщин, так как является естественным компонентом не только желудочно-кишечного тракта, но и влагалищного микробиоценоза. Заявленный штамм соответствует указанному техническому результату и обладает выраженными антагонистическими свойствами по отношению к грамотрицательным и грамположительным патогенным микроорганизмам, устойчив к антибиотикам, устойчив в условиях воздействия экстремальных факторов.

Литература

1. Дисбиоз кишечника: руководство по диагностике и лечению. / Под ред. Е.И.Ткаченко и А.Н.Суворов. - СПб: 2006. - 196 с.

2. Шендеров Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции. -М.: Изд-во ГрантЪ, 1998, 416 с.

3. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией. - Журн. микробиол. 2004. №1. С.84-92.

4. Патент РФ 2247569 С2, опубликован 10.03.2005, приоритет с 11.03.1999.

5. Патент РФ 2000117915 А, опубликован 07.10.2002, приоритет с 05.07.2000.

6. Патент РФ 2133272 C1, опубликован 20.07.1999, приоритет с 11.06.1998.

7. Патент РФ 2003137810 A, опубликован 10.03.2005, приоритет с 11.03.1999 (прототип).

8. Определитель бактерий Берджи. - М.: изд-во Мир, 1997, т.2, с.574.

9. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - №5. - С.94-98.

10. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. / Dunne C., O'Mahony L., Murphy L. et al. // The American Journal of Clinical Nutrition. - 2001. - V.7 (suppl) - P.386S-392S.

11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 выделен из кисломолочной закваски, используемой для получения простокваши. Полученный штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 депонирован в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова под регистрационным номером 498 KM МГУ. Штамм используют для изготовления бактериальных препаратов и производства жидкой молочнокислой закваски в качестве продукта питания лечебно-профилактического назначения. Это обеспечивает более высокую скорость роста, высокую устойчивость к воздействию экстремальных факторов, таких как низкая кислотность, содержание желчи, устойчивость к антибиотикам. 2 ил., 3 табл.

Штамм Lactobacillus fermentum TS3-06 депонирован в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова под регистрационным номером 496 KM МГУ, используемый для изготовления бактериальных препаратов и производства жидкой молочнокислой закваски в качестве продукта питания лечебно-профилактического назначения.