РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pG1-Rm7, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА G1-Rm7, И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ И ОБЛАДАЮЩИЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2014 года по МПК C12N15/70 C12N15/62 C12N15/13 C07K19/00 C07K16/24 

Группа изобретений относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии и предназначена для получения генетически слитого бифункционального гибридного белка, состоящего из одноцепочечного антитела человека против фактора некроза опухолей альфа человека и модифицированного светоизлучающего белка целентеразин-зависимой люциферазы Renilla muelleri.

Фактор некроза опухолей альфа (ФНО) является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основным источником ФНО являются активированные мононуклеарные фагоциты, хотя стимулированные Т-клетки, натуральные киллеры и тучные клетки также могут секретировать этот белок [1]. Главным стимулятором запуска продукции ФНО макрофагами является бактериальный липополисахарид (ЛПС) или грамотрицательные бактерии, высвобождающие ЛПС [1]. Интерферон-гамма, продуцируемый Т-клетками и NK-клетками, усиливает продукцию этого цитокина ЛПС-активированными макрофагами [2].

ФНО ответственен за многие системные осложнения, возникающие при тяжелых инфекционных процессах, при этом ФНО, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления. Воздействуя на гипоталамус, он индуцирует лихорадку и поэтому называется естественным эндогенным пирогеном. В результате возникающей лихорадки увеличивается синтез простагландинов цитокин-стимулированными клетками гипоталамуса [3]. Кроме того, ФНО оказывает воздействие на печень, увеличивая, в частности, синтез гепатоцитами сывороточного амилоидного белка А и фибриногена - сывороточных воспалительных белков. Пролонгированная продукция ФНО вызывает и метаболические повреждения, такие как кахексия: он ингибирует синтез липопротеинлипазы - фермента, необходимого для высвобождения жирных кислот из циркулирующих липопротеиновых комплексов. Когда концентрация ФНО в сыворотке достигает больших значений, превышая 10^-7 М, это вызывает снижение сосудистого тонуса и сократимости миокарда, что, в конечном счете, приводит к резкому падению кровяного давления и шоку [4]. Кроме того, ФНО вносит ощутимый вклад в развитие локальных воспалительных реакций, в частности, при аутоиммунных заболеваниях [5]. Поэтому высокочувствительное количественное определение уровня ФНО в организме необходимо для своевременной диагностики ряда патологических состояний.

Люцифераза мягкого коралла Renilla muelleri представляет собой сравнительно небольшой, 36 кДа, одноцепочечный полипептид. Фермент катализирует окисление субстрата - целентеразина, молекулярным кислородом с образованием CO₂ и молекулы целентерамида в возбужденном состоянии. Переход этого соединения в основное состояние сопровождается выделением света в видимой области спектра (λ_max=482 нм). Ген, кодирующий этот белок, был клонирован, получен и изучен рекомбинантный белок дикого типа, а также методом сайт-направленного мутагенеза получен термостабильный вариант этого белка Rm7 [6, 7].

Известны ген и рекомбинантная целентеразин-зависимая люцифераза коралла Renilla reniformis, а также улучшенные производные этого белка. В литературе описаны бифункциональные гибридные белки на основе этой люциферазы, слитой с другими белками, например зеленым флуоресцентным белком (GFP) [8, 9], рецептором [10] и пр., которые используются для in vivo имиджинга, исследований на основе явления BRET и др.

Наиболее близким аналогом - прототипом к заявляемой группе изобретений является рекомбинантная плазмидная ДНК, полученная на базе бактериальной экспрессирующей плазмиды pKKtac вставкой последовательно гена Т84.66 anti-CEA, кодирующего антитело к карциноэмбриональному антигену, и гена модифицированной люциферазы Renilla reniformis, соединенных олигонуклеотидом, кодирующим 18-членный пептид-линкер. Плазмида кодирует синтез гибридного белка anti-CEA diabody-Renilla luciferase (Db-18-RLuc8), обладающего аффинностью к карциноэмбриональному антигену и биолюминесцентной активностью люциферазы, который может быть использован для визуализации опухоли в живом организме [11].

Конструирование, получение и использование для иммуноанализа фактора некроза опухолей гибридных белков с использованием люциферазы Renilla reniformis или ее аналогов в качестве репортеров в литературе не описано. Также не описано получение каких-либо гибридных белков с люциферазой мягкого коралла Renilla muelleri или ее генетически измененных вариантов.

Технической результатом группы изобретений является получение бифункционального гибридного белка, обладающего способностью связывать ФНО человека и одновременно биолюминесцентной активностью, как потенциально пригодного высокочувствительного репортера для выявления фактора некроза опухолей методом биолюминесцентного иммуноанализа.

Указанный результат достигается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pG1-Rm7, содержащей уникальный ген одноцепочечного антитела человека, направленного против ФНО, и ген модифицированной люциферазы Renilla muelleri; экспрессией целевого гибридного белка в трансформированных упомянутой плазмидной ДНК клетках Escherichia coli HB2151 с последующими выделением из периплазматической фракции и очисткой металл-хелатной хроматографией гибридного белка G1-Rm7, который обладает способностью связывать ФНО человека и одновременно биолюминесцентной активностью. Сущность группы изобретений заключается в следующем.

Генно-инженерными методами получают плазмиду pG1-Rm7, несущую уникальный ген одноцепочечного антитела человека, направленного против ФНО, и ген модифицированной люциферазы Renilla muelleri. Клетки E. coli HB2151, трансформированные сконструированной плазмидой, способны продуцировать гибридный белок G1-Rm7, состоящий из одноцепочечного антитела человека, направленного против ФНО, и модифицированной люциферазы Renilla muelleri, катализирующей реакцию окисления целентеразина с излучением света в видимой области спектра.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pG1-Rm7 являются:

а) модифицированный плазмидный вектор pHEN2-g1 [12], содержащий ген вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела gl против фактора некроза опухоли человека, представляющий собой два фрагмента размером 360 п.о. и 333 п.о. соответственно, между которыми находится коннектор размером 57 п.о., кодирующий линкерный пептид (Gly₄Ser)₂(AlaProGlySer)(Gly₄Ser), гидролизованный по NotI и ApaI-сайтам и содержащий сайт инициации репликации фага М13, промотор lacZ и уникальные сайты рестрикции HindIII (235), SfiI (328), NcoI (332), AvaI (2939), PstI (986), NotI (1076), BamHI (1737), ClaI (2045);

б) ДНК-последовательность, кодирующая пептид GGSGGS и модифицированную люциферазу Renilla muelleri [6, 7], встроенную по сайтам эндонуклеаз рестрикции NotI и ApaI.

Полученная в результате плазмида pG1-Rm7 характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную 3.69 МДа и размер 6161 п.о.;

- содержит NotI-ApaI-фрагмент размером 954 п.о., представляющий собой последовательность, кодирующую пептид GGSGGS и модифицированную целентеразин-зависимую люциферазу из мягкого коралла Renilla muelleri;

- содержит генетические маркеры: bla - ген ампициллин резистентности (ген (3-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli.

Экспрессию гибридного белка осуществляют в бактериальных клетках Escherichia coli HB2151, трансформированных ДНК плазмиды pG1-Rm7, обеспечивающих индуцируемый изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) синтез гибридного белка G1-Rm7.

Индикацию экспрессии осуществляют с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Уровень экспрессии определяют с помощью денситометрии полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси-К250 с использованием программного обеспечения Image Lab Ver. 3.0, поставляемого с прибором GelDocXR+(Bio-Rad). Уровень экспрессии составляет около 2% суммарного клеточного белка.

Целевой белок выделяют из периплазматической фракции и очищают с помощью металл-хелатной хроматографии. Степень очистки определяют сканированием геля на денситометре GelDocXR+(Bio-Rad). Концентрацию очищенного гибридного белка G1-Rm7 определяют спектрофотометрически с помощью набора DC Protein Assay (Bio-Rad), no протоколу производителя.

Полученный гибридный белок обладает биолюминесцентной активностью, которую определяют с помощью кюветного люминометра (модель БЛМ 8802, СКБ Наука, Красноярск) в буфере следующего состава 50 мМ Трис-HCl рН 7.0, 25 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА сразу после внесения целентеразина (10^-5 М раствор в метаноле). При проведении биолюминесцентного иммуноанализа измерения проводили с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 (Berthold, Германия). Биолюминесценцию инициировали внесением свежеприготовленного раствора целентеразина в 50 мМ Трис-HCl рН 7.0, 25 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА.

Полученный гибридный белок обладает способностью связывать ФНО человека, которая была показана с помощью прямого биолюминесцентного твердофазного иммуноанализа. При этом ФНО обнаруживается в растворе с концентрацией до 1,6 нг/мл (9,4 10^-11 М).

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК pG1-Rm7, содержащая в одной рамке считывания ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухолей, последовательность, кодирующую пептид GGSGGS, и ген модифицированной люциферазы Renilla muelleri; получен гибридный белок - одноцепочечное антитело-люцифераза (G1-Rm7), связывающий фактор некроза опухолей и обладающий биолюминесцентной активностью, который обеспечивает выявление фактора некроза опухолей биолюминесцентным иммуноанализом.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Общая схема структурной организации плазмиды pG1-Rm7. Обозначения: g1 - ген, кодирующий одноцепочечное антитело человека, способное связывать фактор некроза опухолей; Rm7 - ген, кодирующий модифицированную люциферазу Renilla muelleri; Linker - последовательность, кодирующая пептид GGSGGS; His6 - последовательность, кодирующая пептид НННННН; bla - ген устойчивости к ампициллину; указаны некоторые сайты рестрикции.

Фиг.2. Нуклеотидная и кодируемая ею аминокислотная последовательности гибридного белка G1-Rm7.

Фиг.3. 12% SDS-гель электрофорез фракций при выделении гибридного белка G1-Rm7. Дорожки: 1, 2 - лизат клеток НВ2151/pG1-Rm7 до и после индукции ИПТГ, соответственно; 3 - цитоплазматическая фракция, 4, 5 - периплазматическая фракция до и после очистки металл-хелатной хроматографией, 6 - фракция телец включения, 7 - маркеры молекулярных масс. Стрелкой показаны полосы, соответствующие целевому гибридному белку.

Фиг.4 (А-Б). Твердофазный иммуноанализ ФНО с использованием гибридного белка G1-Rm7.

Для лучшего понимания сущности предлагаемых изобретений, они иллюстрируются следующими примерами осуществления.

Пример 1. Конструирование плазмиды pG1-Rm7.

Предварительно проводят конструирование гена, кодирующего рекомбинантную люциферазу из мягкого коралла Remlla muelleri.

Амплификацию гена, кодирующего люциферазу, проводят методом ПЦР с использованием Pfu-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Новосибирск). Для синтеза фрагмента ДНК, кодирующего люциферазу, в реакционную смесь добавляют прайме? 92Rm7No5 5'-CAGGCTGCGGCCGCAGGTGGGTCAGGTGGCTCTACGTCAAAAG, кодирующий гибкий пептидный линкер (Gly₂Sei)₂ и содержащий сайт рестрикции для NotI. В качестве обратного используют праймер 115Rm7Ap3 5'-GTTAGCAGCGGGCCCTCAGTGGTG, содержащий сайт рестрикции для ApaI. Продукт амплификации, кодирующий пептид (Gly₂Ser)₂ и рекомбинантную люциферазу Remlla muelleri, подвергают очистке с помощью QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA) и расщепляют рестриктазами NotI и ApaI в реакционной смеси, содержащей 10 mM TpиcHCl, рН 7.6; 10 mM MgCl₂; 50 тМ NaCl, 1 mM DTT и по 20 ед. активности соответствующих ферментов. Реакцию ведут 2 часа при 37°С. После этого фрагмент длиной 990 п.о. очищают методом электрофореза в агарозном геле с последующей очисткой с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA).

Плазмидную ДНК pHEN2-g1, содержащую ген одноцепочечного антитела g1 с лидерным пептидом pelB, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции NotI и Apal в стандартном буфере при 37°С в течение 2 часов. Затем проводят дефосфорилирование в течение 1 часа с 20 ед. CIP в том же буфере. Ферменты инактивируют прогреванием при 65°С 20 мин. После этого ДНК плазмиды очищают методом электрофореза в 1% агарозном геле с последующей очисткой с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA).

Линеаризованную плазмиду лигируют с фрагментом ДНК, кодирующим пептид (Gly₂Ser)₂ и рекомбинантную люциферазу Renilla muelleri, обработанным теми же эндонуклеазами рестрикции. Лигирование проводят в стандартном буфере. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E. coli XL1Blue. С помощью рестрикционного анализа отбирают клоны, содержащие плазмидную ДНК со вставкой нужного размера. Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают как pG1-Rm7. Схема плазмидной ДНК pG1-Rm7 представлена на фиг.1.

Правильность конструирования подтверждают секвенированием. Результат представлен на фиг.2.

Пример 2. Получение гибридного белка G1-Rm7.

Клетки Е. coli HB2151 трансформируют ДНК плазмиды pG1-Rm7, инкубируют в YTx2 среде с добавлением 0,1% глюкозы и 100 мМ ампициллина при 37°С до оптической плотности ОД₆₀₀=0,4-0,5. Затем клеточную суспензию охлаждают и экспрессию гибридного белка G1-Rm7 индуцируют добавлением 0,5 мМ ИПТГ. Далее клетки инкубируют при 28°С в течение ночи и осаждают центрифугированием. Гибридный белок G1-Rm7 выделяют из периплазматической фракции и очищают с помощью металл-хелатной хроматографии на сорбенте Talon (Clontech) по протоколу производителя. Результаты выделения и очистки представлены на фиг.3. На фигуре 3 видно (дорожки 1, 2), что после индукции в клетках появляется новый белок, молекулярная масса которого 64,5 кДа близка расчетной массе гибридного белка G1-Rm7 (показано стрелкой). Белок обнаружен в цитоплазматической и периплазматической фракциях (дорожки 3, 4), а также в тельцах включения (дорожка 6). После очистки периплазматической фракции металл-хелатной хроматографией получен препарат, в котором гибридный белок составляет 15,5% (дорожка 5). На дорожке 7 приведены маркеры молекулярных масс.

Пример 3. Применение гибридного белка G1-Rm7 для биолюминесцентного твердофазного иммуноанализа ФНО.

В лунки непрозрачного иммунологического планшета (Costar, США) вносят по 100 мкл раствора рекомбинантного фактора некроза опухолей [13] в различных концентрациях (1000, 200, 40, 8, 1.6, 0 нг/мл) в 50 мМ K-Na фосфатном буфере рН 7,0 с 0,15 М NaCl (PBS) и инкубируют при 37°С в течение часа. После промывки (PBS, содержащий 0,1% Tween-20 и 5 мМ ЭДТА) в лунки вносят по 100 мкл 2% раствора обезжиренного молочного порошка в PBS и инкубируют при 37°С, 1 час. После промывки (PBS, содержащий 0,1% Tween-20 и 5 мМ ЭДТА) в лунки вносят раствор полученного гибридного белка, инкубируют при 23°С 1 час при перемешивании. После промывки (PBS, содержащий 0,1% Tween-20 и 5 мМ ЭДТА) вносят в лунки по 100 мкл раствора целентеразина (2×10^-6 М в 50 мМ Трис-HCl рН 7.0, 25 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) с одновременным измерением биолюминесцентного сигнала связавшегося гибридного белка с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 (Berthold, Германия). Сигнал интегрируют в течение 30-40 с. Полученный результат приведен на Фиг.4(А-Б). На Фиг.4А показаны биолюминесцентные сигналы гибридного белка от лунок, на поверхность которых сорбировали разное количество ФНО. На Фиг.4Б приведена зависимость интегрированного в течение 40 секунд биолюминесцентного сигнала (среднее значение от двух повторов, с вычетом усредненного сигнала от контрольных лунок с нулевым содержанием ФНО) от концентрации растворов ФНО, взятых для сорбции на поверхности лунок (логарифмические координаты). Зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации фактора некроза опухолей в диапазоне от 1,6 нг/мл до 1 мг/мл близка линейной (R²=0,988). Это означает возможность построения калибровочной кривой для количественного иммуноанализа фактора некроза опухолей с использованием полученного гибридного белка в качестве репортера.

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК pG1-Rm7, содержащая в одной рамке считывания ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухолей, и ген модифицированной люциферазы Renilla muelleri. Получен рекомбинантный гибридный белок - одноцепочечное антитело-люцифераза (G1-Rm7), связывающий фактор некроза опухолей и обладающий биолюминесцентной активностью, что делает возможным его применение в качестве высокочувствительного репортера для количественного иммуноанализа фактора некроза опухолей.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Abbas, A.K., Lightman, A.H., Pober, J.S. Cellular and Molecular Immunology. Fourth Edition, 553. - 2000. P.240-242, 244-246.

2. Konur A., Schuiz U., Eissner G., Andreesen R., Holler E. Interferon (IFN)-gamma is a main mediator ofkeratinocyte (HaCaT) apoptosis and contributes to autocrine IFN-gamma and tumour necrosis factor-alpha production. Br. J. Dennatol. - 2005. - Vol.152(6). - P.1134-42.

3. Zailae MZ. Decreased proinflammatory cytokine production by peripheral blood mononuclear cells from vitiligo patients following aspirin treatment. Saudi Med J. - 2005. - Vol.26(5). - P.799-805.

4. Carlson DL., Willis MS., White DJ., et al., Tumor necrosis factor-alpha-induced caspase activation mediates endotoxin-related cardiac dysfunction. Crit Care Med. - 2005. - May; 33(5). - P.1021-8.

5. Feldmann M. and Maini R.N. Lasker Clinical Medical Research Award. TNF defined as a therapeutic target for rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases. Nat. Med. - 2003 - Vol.9. - P.1245-1250.

6. M.S.Titushin, S.V.Markova, L.A.Frank, N.P.Malikova, G.A.Stepanyuk, J.Lee, E.S.Vysotski. Coelenterazine-binding protein ofRenilla muelleri: cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase. // Photochem. Photobiol. Sci. - 2008. - Vol.. - P.189-196.

7. G.A.Stepanyuk, J.Unch, N.P.Malikova, S.V.Markova, J.Lee, E.S.Vysotski. Coelenterazine-v ligated to Ca²⁺-triggered coelenterazine-binding protein is a stable and efficient substrate of the red-shifted mutant of Renilla muelleri luciferase. Anal. Bioanal. Chem. - 2010 - Vol.398 - P.1809-1817

8. Wang Y., Yu Y.A., Shabahang S., Wang G., Szalay A.A. Renilla luciferase-Aequorea GFP (Ruc-GFP) fusion protein, a novel dual reporter for real-time imaging of gene expression in cell cultures and in live animals. Mol. Genet. Genomics. - 2002 - Vol.268. - P.160-168

9. J.Liu, Y.Wang, A.A.Szalay, A.Escher. Visualizing and quantifying protein secretion using a Renilla luciferase-GFP fusion protein. Luminescence - 2000 - Vol.15. - P.45-49

10. Zeng F.-Y., Mclean A.J., G. Milligan, Lemer M., Chalmers D.T., Behan D.P. Ligand specific up-regulation of a Renilla reniformis luciferase-tagged, structurally unstable muscarinic M3chimeric G protein-coupled receptor. Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol.64. - P.1474-1484

11. Venisnik K.M., Olafsen Т., Loening A.M., Iyer M., Gambhir S.S., Wu A.M. Bifunctional antibody-Renilla luciferase fusion protein for in vivo optical detection of tumors. Prot. Eng. Des. Sel. - 2006. - Vol.19. - P.453-460.

12. Вихрова М.А., Батанова Т.А., Лебедев Л.Р., Шингарова Л.Н., Франк Л.А., Кирпичников М.П., Тикунова Н.В. Одноцепочечные антитела человека, направленные к фактору некроза опухолей. Биоорг. химия. - 2011. - Т.37. - С.334-343.

13. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства. - 1996. - Т.22. - С.243-251.

Группа изобретений относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно к рекомбинантной плазмидной ДНК pG1-Rm7, обеспечивающей в клетках Escherichia coli синтез гибридного белка G1-Rm7, способного связывать фактор некроза опухолей и обладающего биолюминесцентной активностью люциферазы Renilla muelleri, где указанная плазмидная ДНК включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и может быть использована в медицине. Изобретения также относятся к белку pG1-Rm7 с молекулярной массой 65,4 кДа, состоящему из одноцепочечного антитела против фактора некроза опухолей, пептида GGSGGS и модифицированной люциферазы Renalla muelleri и характеризующемся SEQ ID NO: 2. Изобретения позволяют получить высокочувствительный репортер для выявления фактора некроза опухолей методом биолюминесцентного анализа. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pG1-Rm7, обеспечивающая синтез гибридного белка G1-Rm7 в клетках Escherichia coli, который связывает фактор некроза опухолей человека и обладает биолюминесцентной активностью люциферазы Renilla muelleri, где указанная плазмидная ДНК с физической картой, представленной на фиг.1, имеет размер 6161 п.о., молекулярную массу 3.69 Md, уникальные сайты рестрикции HindIII (235), SfiI (328), NcoI (332), AvaI (2939), PstI (986), NotI (1076), BamHI (1737), ClaI (2045) и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую гибридный белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, состоящий из одноцепочечного антитела против фактора некроза опухолей, пептида GGSGGS и модифицированной люциферазы Renilla muelleri.

2. Гибридный белок G1-Rm7, связывающий фактор некроза опухолей человека и обладающий биолюминесцентной активностью, полученный из клеток Escherichia coli, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК pG1-Rm7, имеющий молекулярную массу 65,4 кДа, состоящий из одноцепочечного антитела против фактора некроза опухолей, пептида GGSGGS и модифицированной люциферазы Renilla muelleri, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, представленную на фиг.2.