СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТИДИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ, ПОЗВОЛЯЮЩИЙ ОПРЕДЕЛЯТЬ СТЕПЕНЬ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА Российский патент 2014 года по МПК G01N33/50 

Гистидин относится к одной из 20 протеиногенных аминокислот. Его роль в организме многогранна. Он принимает активное участие в биосинтезе гистамина [1, 3], способствует росту и восстановлению тканей и в большом количестве содержится в гемоглобине эритроцитов периферической крови, принимая участие в его оксигенации [7-11].

Присоединяя кислород, гемоглобин превращается в оксигемоглобин. Валентность железа (Fe²⁺⁺) при этом не изменяется, поэтому эту реакцию называют оксигенацией, а не окислением. Связь гемоглобина с гистидином влияет на присоединение кислорода к Fe²⁺⁺ гема [12]. Гистидин как сильный донатор фиксирует гем в глобине, повышая основность Fe²⁺⁺, и тем самым способствует образованию связи с акцептором, которым является молекула кислорода с практически сохраненным эффектом H. Бора [2, 6].

Цель работы найти способ, позволяющий выявлять содержание гистидина в эритроцитах периферической крови и по измерению реакции на содержание гистидина прогнозировать содержание оксигемоглобина.

Прототипом выявления гистидина в клеточных элементах мы взяли реакции, предложенные в пятидесятые годы XX столетия [5]. Однако от предложенных методов наши исследования существенно отличаются.

1. Реакцию в те годы проводили только на гистологических срезах. В отличие от этого мы разработали гистохимическим методом выявлять гистидин в отдельно взятых эритроцитах периферической крови.

2. Предложенный ранее метод основан на обязательной обработке тканевых срезов 33% раствором азотной кислоты, что не приемлемо для применения к взвеси эритроцитов, поскольку это приводит к немедленному их гемолизу.

3. Обработанные слабым раствором соляной кислоты эритроциты помещались в инкубационный раствор для определения гистидина, после чего из капли прореагированной на гистидин взвеси изготовляли монослойный мазок.

4. Предложенный способ выявления гистидина в эритроцитах чувствителен и стоек, что позволяет мазки крови длительно сохранять для исследования.

5. До настоящего времени способа выявления гистидина в эритроцитах в литературе не описано, как и не предложено микрофотографий эритроцитов, содержащих продукты реакции на гистидин.

Заявленный способ имеет следующие приемы.

1. Исследование проводилось на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 25 здоровых беременных в возрасте 18-25 лет. Контролем служили 10 беременных с признаками анемии при обострении цитомегаловирусной инфекции.

2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ №266 от 19.06.2003 г.

3. Верификация цитомегаловирусной инфекции выполнялась путем определения типоспецифических антител и индекса авидности методом ИФА на спектрофотометре Stat-Fax-2100 (USA) с использование наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

4. Гистидин в эритроцитах периферической крови определяли гистохимическим методом путем помещения в инкубационный раствор эритроцитов, взятых у здоровых лиц. Контролем служили беременные с признаками анемии.

Приготовление инкубационного раствора проводилось следующим образом.

Раствор 1: 500 мг сульфаниловой кислоты растворяют в 50 мл 1 М HCl (2,218 мл до 50 мл дистиллированной воды).

Раствор 2: 125 мг NaNO₂ растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды.

В пробирку вносят 200 мкл цельной крови с коагулянтом и добавляют равные объемы (по 1 мл) растворов 1 и 2. При комнатной температуре инкубационный раствор выдерживают 10 мин. После чего каплю инкубационного раствора наносят на предметное стекло и изготовляют с помощью центрифуги Diff Spin Slide Spinner M 700-22 (USA) монослойный мазок, который подсушивают и изучают под цифровым фотомикроскопом МТ (Япония).

5. Компьютерным цитофотометрическим методом определяют содержание гистидина, приходящегося на 1 эритроцит в условных единицах, денситометрируя 100 эритроцитов у каждого пациента. Содержание HbO₂ у этих же пациентов определяли по методу Эвелина и Мэллой [4].

Проведенные исследования показали, что составление инкубационной смеси из следующих растворов: 1. - 500 мг сульфаниловой кислоты в 50 мл 1 М HCl и 2. - 125 мг NaNO₂ в 2,5 мл дистиллированной воды после смешения каждого из них по 1 мл и введения в смесь 200 мкл цельной крови с коагулянтом позволяет выполнять реакцию на выявление гистидина в эритроцитах в течение 10 мин при комнатной температуре.

Из капли взвеси после проведения реакции изготовляется монослойный мазок и после его подсушивания изучают содержание гистидина в эритроцитах компьютерным цитофотометрическим методом. В эритроцитах четко выделяются гранулы реакции на гистидин. У здоровых беременных цитофотометрические исследования позволяют установить, что на 1 эритроцит приходится 62,17±2,5 усл. ед. гистидина (фигура 1). При обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:800, если количество гистидина на 1 эритроцит снижается до 34,3±1,85 усл. ед. (фигура 2), уменьшается оксигенация гемоглобина до 94,5±1,9%, что создает угрозу формирования гипоксии в организме.

ЛИТЕРАТУРА

1. Коржуев П.А. Гемоглобин: сравнительная физиология и биохимия. 1964. М: «Наука».

2. Коробов В.Н., Федорович И.П., Климишин Н.И. Физико-химические и функциональные свойства гемоглобина мышей, зараженных карциномой Эрлиха // Бюлл. экс. биол. и мед. 1992. т.113, №6. с.640-642.

3. Луценко М.Т. Влияние активности аргининдегидрогеназы на уровень гистамина в периферической крови беременных с герпес-вирусной инфекцией // Бюлл. физиол. и патол. дых. СО РАМН. 2012. Вып.44. С.62-66.

4. Покровский А.А. Биохимические методы исследования: Справочник. М.: «Медицина». 1969. 337 с.

5. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. М.: «Советская наука», 1954. 441 с.

6. Федорова Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция. 1976. М.: «Медицина». 541 с.

7. Christian J.E., Unno М., et. al. Spectroscopic effects of polarity and hydration in the distal heme pocket of deoxymyoglobin // Biochemistry. 1997. 36 (37). P.11198-11204.

8. Ferguson R.A., Sehdev N., Bagatto B. In vitro interactions between oxygen and carbon dioxide transport in the blood of the sea lamprey // J. Exp. Biol'. 11992. №2. P.10-15.

9. Jkeda-Saito M., Hon H., Anderson L.A. Coordination structure of the ferric hemme iron in engineered distal hisdine myoglobin mutants // J. Biol. Chem. 1992. 267 (32). P.22843-22852.

10. Kopec W., Jamroz D., Wiliczkiewicz A. Antioxidation status and histidine dipeptides content in broiler blood and muscules depending on protein sources in feed // J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl). 2012. 10. 1111/j. P.1439-0396.

11. Nikinmaa M., Airaksinen S., Vikki L. Hemoglobin function in intact lamprey erythrocytes: interactions with membrane function in the regulation of gas transport and acid-base balance // J. Exp. Biol. 1995. №3. P.12-16.

12. Perutz M.F., Mazzarella L. A preliminary x-ray analysis of haemoglobin H. «Nature». 1963. V.4. P.2.

Изобретение касается способа выявления гистидина в эритроцитах периферической крови. Способ осуществляют путем приготовления инкубационного раствора №1, состоящего из раствора 500 мг сульфаниловой кислоты в 50 мл 1 М HCl, и раствора №2, состоящего из 125 мг NaNO₂ в 2,5 мл дистиллированной воды. Растворы смешивают по 1 мл каждого в пробирке и вносят в смесь 200 мкл цельной крови с коагулятом. Реакция протекает в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего из капли взвеси изготовляют монослойный мазок на предметном стекле, подсушивают и изучают с помощью компьютерной цитофотометрии. 2 ил.

Способ определения гистидина в эритроцитах периферической крови, включающий выполнение гистохимической реакции в инкубационном растворе, состоящем из смеси растворов по 1 мл каждого: раствор №1 - 500 мг сульфаниловой кислотой растворяют в 50 мл 1M HCl и раствор №2 - 125 мг NaNO₂ растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды, в который вносят 200 мкл цельной крови с коагулянтом и после 10 мин прохождения реакции при комнатной температуре из капли взвеси изготовляется мазок, на котором изучают компьютерным цитофотометрическим методом содержание гистидина в эритроцитах.