СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ ГИСТОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

Описание патента на изобретение RU2563827C1

1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации при снижении в мембранах эритроцитов ионов кальция создается угроза разрушения эритроцитов и появляются признаки гипоксии в периферической крови беременной.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики устойчивости мембран эритроцитов и появлению в периферической крови беременной признаков гипоксии.

3. Раскрытие изобретения. Экранирование фиксированных зарядов клеточной поверхности снижает электрофоретическую подвижность клеток. Этот эффект может быть объяснен как экранирование фиксированных зарядов клеточной поверхности, и связывания ионов кальция с соответствующими заряженными группировками мембраны [1, 4]. На поверхности эритроцитов могут реагировать с ионами кальция остатки нейраминовой (сиаловой) кислоты и карбоксильные группы белков [8]. В различных мембранах поверхностный заряд может в значительной степени варьировать [7].

Ионы кальция, связывающиеся на поверхности клеточной мембраны, существенны для поддержания их структурной целостности. Стабильность мембраны может снижаться, о чем свидетельствует прогрессирующее снижение сопротивления и утечка через каналы содержимого клетки. При снижении ионизированного кальция на поверхности мембраны уменьшается поверхностный потенциал мембраны [2]

4. Новая техническая задача

Найти новый способ оценки устойчивости мембран эритроцитов методом определения количества связанных ионов кальция с мембраной в зависимости от обострения в организме цитомегаловирусной инфекции.

5. Уровень техники раскрытия изобретения

Устойчивость мембран эритроцитов зависит от количества связанного с ее рецепторами ионов кальция. В случае снижения содержания ионов кальция заряд мембраны снижается, нарушается проходимость мембранных каналов и наблюдается утечка содержимого клеток [4].

Эти вопросы успешно решались в течение многих лет микроэлектрофоретическим методом на интактных клетках [4]. Однако в организме человека эти вопросы обстоят намного сложнее. В целом ряде случаев клеточная мембрана эритроцитов попадает под воздействие чужеродных белков, которыми являются и антигены вирусных инфекций. Поэтому мы применили в наших исследованиях гистохимический метод с целью показать, как ионы кальция связываются с рецепторами мембран эритроцитов как в норме, так и при вирусных заболеваниях.

Антиген цитомегаловируса находит рецептор на мембране эритроцита в качестве гликофорина, количество которого при вирусных заболеваниях резко возрастает, что нами и отмечено [5]. Это позволило провести исследования связи ионов кальция с мембраной эритроцитов гистохимическим методом с последующим цитофотометрическим подсчетом содержания связанного с мембраной эритроцита ионов кальция. Метод специфичен и прост в своем исполнении.

Отсутствие достаточного количества ионов кальция на мембране эритроцитов приводит к нарушению ее устойчивости и как следствие к гибели клетки, что фиксировалось автоматической установкой "Mekos" по количеству дегенеративных форм эритроцитов. Наконец, биохимическим методом подтверждается, что количество оксигемоглобина в этой ситуации значительно снижается, что составляет угрозу формирования в третьем триместре гестации для беременной гипоскии. Подобных исследований у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции мы не встречали.

6. Осуществление изобретения

6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 25 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие JgM или четырехкратного и более нарастания титра антител JgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к цитомегаловирусу (ЦМВ). Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства здравоохранении РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре "Stat-Fax-2100" (USA) с использованием тест-систем ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибирск), методами ПНР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО "ДНК-технология " (Москва).

7. Монослойные мазки периферической крови приготовляли на центрифуге Stat-Sprin Μ 700-22 (USA).

8. Выявление ионов кальция проводили с использованием рекомендаций Косса [3].

8.1. Фиксация выполнялась в течение 30 мин в закрытом эксикаторе в парах параформальдегида.

8.2. После фиксации мазки заливали 5% раствором нитрата серебра на 15 мин при ярком дневном свете.

8.3. После окраски нитратом серебра мазки промывались 5% раствором тиосульфата натрия и дистиллированной водой

8.4. Далее на мазок наносится на 30 мин 1% раствор сафранина на 96% этиловом спирте.

8.5. Обезводить в спиртах возрастающей крепости, просветлить в ксилоле и заключить в бальзам. В местах размещения кальция появляются черные зерна реакции, фон - желто-розовый.

9. Полученные мазки изучались под цифровым микроскопом MEIJI (Япония), связанным с компьютером через цитофотометрическую программу "Scion " (USA), позволяющую определять автоматически количество продуктов реакции (в данном случае кальция) в каждом эритроците.

10. Число дегенеративных форм эритроцитов определяли с помощью цитофотометрической установки "Mekos "(МЗ РФ, 29/100110198/1282-01).

11. Уровень оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [6].

12. Статистическая обработка проводилась непарным параметрическим критерием Стъюдента и методом Фишера.

В процессе исследования установлено, что обострение хронической цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 на третьем триместре гестации связано со снижением количества ионов кальция в мембранах эритроцитов до 12,80±0,40 усл.ед., контроль - 34,00±0,07 усл.ед. (фигура 1, 2). Это связано с тем, что рецепторы мембран эритроцитов связаны в большинстве с антигеном цитомегаловируса, что экранирует контакты кальция с мембраной эритроцита. Это приводит к нарушению устойчивости мембраны эритроцитов и появлению в периферической крови беременной до 12,0±0,95% дегенеративных форм, а также к снижению оксигемоглобина до 92,3±1,5%, что и создает угрозу формирования в организме беременной гипоксии.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность ионов кальция в мембранах эритроцитов периферической крови беременной, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600. Реакция на кальций снижается до 12,80±0,40 усл.ед., при контроле - 34,00±0,07 усл.ед.

Гистохимическая реакция на кальций по Коссу. Увеличение - 10±100.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на активность ионов кальция в мембранах эритроцитов периферической крови беременной, не болевшей в течение гестации. Интенсивность реакции на кальций - 34,00±0,07 усл.ед. Гистохимическая реакция на кальций по Коссу. Увеличение-10±100.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дорошенко П.А., Костюк П.Г., Мартынюк А.Е. Инактивация кальциевых токов в соматической мембране нейронов моллюсков// Нейрофизиология. 1982. Т. 14, №5. С. 525-531.

2. Дорошенко П.А., Мартынюк А.Е. Блокирование кальцийзависимого выходящего тока в соматической мембране нейронов моллюсков повышением рН внутриклеточной среды// Нейрофизиология. 1982. Т.14, №5. - С. 426-430.

3. Кононский А.И. Гистохимия. Киев.: Вища Школа. 1976. - 277 с.

4. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М.: Наука, 1986, 254 с.

5. Луценко М.Т., Андриевская И.Α., Кутепова О.Л. Морфофункциональная характеристика глутатионового цикла эритроцитов периферической крови беременных, перенесших в период гестации обострение цитомегаловирусной инфекции // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2014. Т.157, №2. С. 246-250.

6. Покровский А.А. Справочник биохимических исследований. М.Медицина. 1969. 337 с.

7. Bolognani L., Masserini Μ., Bodimi P. Lipid composition in ganglia of molluses// J. Neurochem.,1981. V.36. P. 821-825.

8. Seaman G.V., Vasser P., Kenall M.J. Electrophoretic studies of human polynuclear leucocytes and erythrocytes// Arch. Biochem. And Biophys.1969. V.135. P 356-363.

Похожие патенты RU2563827C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ СНИЖЕНИИ ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗА НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 2013
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Довжикова Инна Викторовна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
RU2549432C2
СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ОКСИГЕНАЦИЮ ГЕМОГЛОБИНА В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ НА ФОНЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОГЛОБИНА И 2,3 ДФГ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ 2012
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
RU2504775C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ СНИЖЕНИИ МИКРОВЯЗКОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ И ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 2013
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Ишутина Наталья Александровна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
RU2540425C1
Способ определения угрозы формирования гемической анемии у беременных на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции, подавляющей активность SH-групп в эритроцитах и приводящей к снижению оксигенации гемоглобина 2015
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
RU2612010C1
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ 2015
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
RU2592239C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОДАВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ 2015
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Довжикова Инна Викторовна
RU2577300C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ПОДАВЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ БЕРЕМЕННЫХ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ПРИ НАРАСТАНИИ В НИХ ПЕРЕКИСЕЙ ЖИРНЫЙ КИСЛОТ 2014
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
  • Мироненко Артем Геннадиевич
RU2542426C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 2013
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Довжикова Инна Викторовна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
RU2535055C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРИДОКСАЛЬФОСФАТА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ 2014
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Довжикова Инна Викторовна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
RU2546531C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СКЕЛЕТ ЭРИТРОЦИТОВ 2015
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Мироненко Артем Геннадьевич
RU2601404C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 563 827 C1

Реферат патента 2015 года СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ ГИСТОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ

Изобретение касается способа выявления ионов кальция в эритроцитах периферической крови беременных. Способ включает выполнение гистохимической реакции на монослойных мазках периферической крови с помощью их последовательной обработки растворами, состоящими из 5% нитрата серебра, промывки 5% тиосульфатом натрия и дистиллированной водой с последующей докраской 1% раствором сафранина на 96% этиловом спирте, дифференцировки в 96% этиловом спирте, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, просветление в кислоте и заключение в бальзам. Затем изучают компьютерным цитофотометрическим методом содержание кальция в отдельно взятых эритроцитах и устанавливают. При обострении цитомегаловирусной инфекции до титра антител 1:1600, снижении содержания кальция в мембранах эритроцитов до 12,80±0,40 усл. ед., при контроле - 34,00±0,07 усл. ед., увеличении количества дегенеративных форм эритроцитов до 12,0±0,95% и снижении содержания оксигемоглобина до 92,3±1,5% определяют угрозу формирования в организме беременной гипоксии. 2 ил.

Формула изобретения RU 2 563 827 C1

Способ определения угрозы формирования в организме беременной гипоксии, включающий выполнение гистохимической реакции на монослойных мазках периферической крови с помощью их последовательной обработки растворами, состоящими из 5% нитрата серебра, промывки 5% тиосульфатом натрия и дистиллированной водой с последующей докраской 1% раствором сафранина на 96% этиловом спирте, дифференцировки в 96% этиловом спирте, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, просветление в кислоте и заключение в бальзам, после чего изучают компьютерным цитофотометрическим методом содержание кальция в отдельно взятых эритроцитах и устанавливают, что при обострении цитомегаловирусной инфекции до титра антител 1:1600, снижении содержания кальция в мембранах эритроцитов до 12,80±0,40 усл. ед., при контроле - 34,00±0,07 усл. ед., увеличении количества дегенеративных форм эритроцитов до 12,0±0,95% и снижении содержания оксигемоглобина до 92,3±1,5% определяют угрозу формирования в организме беременной гипоксии.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2563827C1

СПОСОБ КОНТРОЛЯ КИСЛОРОДНО-ТРАНСПОРТНОЙ ФУНКЦИИ КРОВИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 1993
  • Веретяхин В.В.
  • Горничев А.А.
  • Грачев В.И.
  • Зарицкий А.Р.
  • Левит Ю.С.
  • Лобченко И.М.
  • Прокопенко Г.А.
  • Фок М.В.
RU2060501C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕТАБОЛИЗМА И СИСТЕМЫ ТРАНСПОРТА КИСЛОРОДА К ГОЛОВНОМУ МОЗГУ У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ 2004
  • Мартыненков В.Я.
  • Чурляев Ю.А.
  • Лукашев К.В.
  • Чеченин М.Г.
  • Григорьев Е.В.
  • Воеводин С.В.
  • Редкокаша Л.Ю.
RU2264162C2
НОВИЦКИЙ В.В., СОПРЫКИНА Э.В
и др
Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинообразователей // Бюллетень Сибирской медицины
Пломбировальные щипцы 1923
  • Громов И.С.
SU2006A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Способ образования коричневых окрасок на волокне из кашу кубической и подобных производных кашевого ряда 1922
  • Вознесенский Н.Н.
SU32A1
СИДОРОВА И.С., ЧЕРНИЕНКО И.Н
Внутриутробные инфекции: хламидиоз, микоплазмоз, герпес, цитомегалия
Источник:

RU 2 563 827 C1

Авторы

Луценко Михаил Тимофеевич

Андриевская Ирина Анатольевна

Даты

2015-09-20Публикация

2014-09-17Подача