СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ПОДАВЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ БЕРЕМЕННЫХ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ПРИ НАРАСТАНИИ В НИХ ПЕРЕКИСЕЙ ЖИРНЫЙ КИСЛОТ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

1. Цель изобретения - выявить, что дыхательная активность эритроцитов возникает при снижении активности глутатионредуктазы вследствие нарастания перекисей жирных кислот в мембранах эритроцитов, индуцированных обострением у беременной в третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к оценке подавления дыхательной активности эритроцитов у беременных при обострении в период гестации цитомегаловирусной инфекции.

3. Раскрытие изобретения

Возбудитель цитомегаловирусной инфекции, вступая в контакт с мембраной эритроцитов через белки PvTRAgS (10), способствует изменению фосфолипидного состава, что приводит к появлению в мембранах большого количества перекисей жирных кислот (ПОЛ). Перекиси жирных кислот угнетают ферментативную активность эритроцитов, к их числу относится и глутатионредуктаза. Глутатион - активное вещество, принимающее участие во многих окислительно-восстановительных процессах в организме. Он обеспечивает функционирование многих ферментов, содержащих SH группы. Восстановленный глутатион разрушает в эритроцитах Н₂О₂ в ходе реакции, катализируемой глутатионпероксидазой GGSH+H₂O₂→GSSG+2H₂O. Эта реакция подтверждает защитную роль глутатиона в эритроцитах против оксидантов (1, 2, 6, 7). Больше всего глутатион находят в таких органах как почки, печень, головной мозг, эритроциты периферической крови (5). Восстановленная форма глутатиона легко подвергается окислению, в результате чего образуется дисульфидная форма глутатиона -G-S-S-G, но этот процесс обратим: $$\underset{+2H^{-}}{\overset{-2H^{+}}{{\displaystyle 2G-SH}}}\leftrightarrow GS-SG$$ . Реакция успешно протекает в присутствии ионов Mg⁺². Восстановление окисленного глутатиона происходит под влиянием глутатионредуктазы, что отчетливо наблюдается в эритроцитах периферической крови. В связи со своей функциональной мобильностью глутатион может принимать участие во многих окислительно-восстановительных реакциях (5). Установлено, что глутатион защищает гемоглобин эритроцитов от различных окислителей, поддерживая тем самым структурную устойчивость их мембран (2, 6). Гемолитическая анемия проявляется у новорожденных в связи с недостаточностью глутатионредуктазы, от которой зависит уменьшение содержания в эритроцитах G-SH. Нарушение реакций глутатионовой системы приводит к ряду острых интоксикационных воздействий на клеточные системы организма (4).

4. Прототипы работы

Среди работ, изучавших изменение активности глутатионредуктазы, имеется исследование Луценко М.Т. и Андриевской И.А. (9), в котором в отличие от настоящего исследования нарушение дыхательной активности эритроцитов изучали при воздействии на эритроциты герпес-вирусной инфекции. В этой работе не был изучен конкретный механизм повреждения ферментативной активности глутатионредуктазы. В настоящем исследовании было изучено содержание в мембранах эритроцитов перекисей жирных кислот при обострении в организме цитомегаловирусной инфекции.

5. Новая техническая задача

Нарушение дыхательной активности эритроцитов при обострении у беременной цитомегаловирусной инфекции возникает вследствие повреждения клеточных мембран и накопления в них перекисей жирных кислот.

6. Осуществление изобретения

6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН. Обследовано 15 беременных на третьем триместре гестации с обострением цитомегаловирусной инфекции с титром 1:1600. У беременных забиралась кровь для определения гистохимическим методом перекисей жирных кислот в эритроцитах, а также активности глютатионредуктазы. Контролем служили 15 беременных, не болевших цитомегаловирусной инфекцией в период гестации. У беременных симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также ДНК цитомегаловируса. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител класса IgM и IgG, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК цитомегаловируса методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Перекиси жирных кислот в мембранах эритроцитов определяли гистохимическим методом по Винклеру-Шульце (8). Суть метода заключалась в инкубации эритроцитов цельной крови в растворе, состоящем из 576 мг α-нафтола в 6 мл 1 N натриевой щелочи, доведенной до 50 мл дистиллированной водой. Вторым ингредиентом инкубационной среды является раствор, состоящий из 691 мг n-амино-N,N-диметиламина в 50 мл дистиллированной воды. Смешивают эти 2 раствора, фильтруют накануне реакции, отбирают в пробирку PUTH, КЗ ЭДТА 500 мкл этого раствора и вносят в него 200 мкл цельной крови с коагулянтом, взятой натощак из локтевой вены. Через 10 мин каплю инкубационного раствора с эритроцитами наносят на предметное стекло и на центрифуге Diffe Spin-2 (USA) приготовляют монослойный мазок. Высушивают при комнатной температуре и изучают под цифровым микроскопом МТ (Япония), связанным с компьютером через программу «Scion Corporation» (USA), позволяющую проводить количественно цитофотометрический анализ: определять площадь клетки и автоматически плотность продукта реакции.

6.4. Активность глутатионредуктазы у здоровых беременных и беременных, перенесших обострение цитомегаловирусной инфекции, определяли с использованием реагентов «Sentinel diagnostics)) (Италия) на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA).

6.5. Анализ полученных результатов проводился с помощью дискриминантного метода статистической обработки.

Исследования показали, что в случае обострения цитомегаловирусной инфекции у беременной в третьем триместре гестации с титром 1:1600 в мембранах эритроцитов отмечается содержание перекисей жирных кислот до 97,9±2,5 усл. ед. (фигура 1), контроль - 22,0±0,85 усл. ед. (фигура 2). Одновременно определяется снижение активности в эритроцитах глутатионредуктазы до 4,0±0,08 Е/г Hb; контроль - 7,90±0,15 Е/г Hb, что создает угрозу формированию у беременной гемической анемии.

Проведенный дискриминантный анализ показал, что дискриминантная функция (D_Ф) определяется следующим образом:

Имя выборки Объем выборки Кол-во выборки Расстояния Махалан Критерий Фишера, различия выборок Вероятность различия выборок Граничное значение дискриминантной функции Вероятность ошибочности классиф., % 493 15 2 4.35 52.76 100.000 -10.06 2.760 00R 15 2         1.851 D0=(+.143×ПОЛ)+(-2.825×глутатионредуктаза) где D_Ф - дискриминантная функция ПОЛ - перекиси жирных кислот +.143 - коэффициент, автоматически выставленный компьютером в дискриминантном уравнении при значении ПОЛ Глутатионредуктаза - фермент эритроцита -2.825 - коэффициент, автоматически выставленный компьютером в дискриминантном уравнении при значении глутатионредуктазы В результате анализа D_Ф=(+13.99)+(-11.30)=(+2.60)

Следовательно, при D_Ф(+2.60) > больше граничного значения (-11.30) отмечается снижение активности глютатионредуктазы и создается угроза формирования у беременной гемической анемии.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на перекиси жирных кислот в эритроците периферической крови беременной, перенесшей в третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600. В эритроцитах интенсивность реакции на перекиси жирных кислот составляет при цитофотометрическом исследовании по программе «Scion Corporation)) 97,9 усл. ед. Активность глутатионредуктазы снижается при этом до 4,0±0,08 Е/гHb, контроль - 7,90±0,15 Е/гHb. Создается угроза формирования гемической анемии.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на перекиси жирных кислот в эритроците беременной на третьем триместре гестации. В течение гестации беременная не болела. В мембранах эритроцитов количество жирных кислот не превышало 22,0±0,85 усл. ед. Количество глутатионредуктазы было в пределах контроля - 7,90±0,15 Е/гHb. Угрозы формирования анемии не предусматривалось.

ЛИТЕРАТУРА

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 1998. М.: Медицина, 750.

2. Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики, профилактики и терапии. Биохимия. 2004. 69. 1; 53-66.

3. Глушко С.И., Куценко С.Л., Новикова Т.И., Аксенов В.В. Состояние системы глутатиона в тканях сердца крыс при острых отравлениях доксорубицином // Вопросы онкологии. 2005. 5 г. 1; 108-112.

4. Глушко С.И. Нарушения системы глутатиона и их роль в патогенезе острых интоксикаций ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия. С.П. 2007. Автореф.…дисс. докторской. 35.

5. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. 2001. М.: Наука, Интерпериодика, 343.

6. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С Биологическая роль глутатиона. Успехи биол. химии. 1990. 110. 1(4); 20-23.

7. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона. Успехи биол. химии. 1990. 31; 157-179.

8. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969, 645.

9. Луценко М.Т., Андриевская И.А. Способ диагностики дыхательной функции эритроцитов беременных путем определения активности глутатионредуктазы в эритроцитах периферической крови при обострении герпес-вирусной инфекции // Бюллетень «Изобретения, полезные модели». 27.10.2010. №30.

10. Tyagi R.K., Sharma V.D. Erythrocyte bilding activity displayed by a selective group of Plasmodium vivax tryptophan rich antigens is inhibited by patients antibodie // Plos One. 2012. 7(12). S.50754.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии у беременной при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации. Для этого в периферической крови беременных измеряют титр антител к цитомегаловирусу, содержание перекисей жирных кислот и снижение активности глутатионредуктазы, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 определяют нарастание перекисей жирных кислот и снижение активности глутатионредуктазы, после чего вычисляют значение дискриминантной функции по формуле D_Ф=(+0.143×ПОЛ)+(-2.825×глутатионредуктаза), и при D_Ф более (+2.60) создается угроза формирования гемической анемии. Способ позволяет оценить угрозу формирования гемической анемии вследствие повреждения клеточных мембран и накопления в них перекисей жирных кислот. 1 табл., 2 ил.

Способ оценки угрозы формирования гемической гипоксии у беременной при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, включающий измерение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, содержание перекисей жирных кислот и активности глутатионредуктазы в мембранах эритроцитов, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 определяют нарастание перекисей жирных кислот и снижение активности глутатионредуктазы, после чего вычисляют значение дискриминантной функции по формуле: D_Ф=(+0.143×ПОЛ)+(-2.825×глутатионредуктаза), и при D_Ф более (+2.60) создается угроза формирования гемической анемии.