ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЛЕГОЧНЫЙ СУРФАКТАНТ И СТЕРОИД Российский патент 2014 года по МПК A61K35/12 A61K31/66 A61K38/02 A61K31/573 A61P11/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к композициям для лечения недоношенных младенцев. В частности, данное изобретение относится к применению легочного сурфактанта в комбинации со стероидом для снижения окислительных повреждений легких и риска развития бронхолегочной дисплазии у недоношенных младенцев.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Легкое человека состоит из большого количества маленьких воздушных мешочков, называемых альвеолами, в которых происходит газообмен между кровью и воздушными пространствами легких. У здоровых индивидуумов этот обмен опосредован присутствием белоксодержащего сурфактантного комплекса, который предотвращает спадение легких в конце экспирации.

Легочный сурфактантный комплекс состоит в основном из липида и содержит незначительные количества различных белков. Отсутствие адекватных уровней этого комплекса приводит к нарушению функции легких. Этот синдром называется респираторным дистресс-синдромом (RDS), и он обычно поражает недоношенных младенцев.

Лечение RDS опирается на заместительную терапию препаратами на основе экзогенных легочных сурфактантов, экстрагированных из легких животных, известных как модифицированные природные сурфактанты. Например, модифицированными природными сурфактантами, применяемыми в клинической практике, являются порактант альфа, получаемый из свиного легкого и продаваемый под товарным знаком Curosurf®, берактант (Surfacten® или Survanta®), бовактант (Alveofact®), оба получаемые из бычьего легкого, и калфактант, получаемый из телячьего легкого (Infasurf®).

Экзогенные легочные сурфактанты в настоящее время вводят путем эндотрахеальной инсталляции в виде суспензии в физиологическом растворе интубированным недоношенным младенцам, которым проводят механическую вентиляцию кислородом.

Хотя указанная терапия обеспечивает весьма высокую послеродовую выживаемость, дети, которые выживают после RDS, имеют высокий риск развития бронхолегочной дисплазии (BPD), осложнения, мешающего развитию легких и приводящего, в конечном счете, к нарушению дыхания. Полученные данные указывают на то, что воспаление легких и окислительные повреждения тканей легких играют важную роль в патогенезе BPD. Кроме того, воспаление и окислительный стресс способствуют инактивации сурфактанта посредством альвеолярной транссудации белков плазмы и клеток и прямого действия свободных радикалов.

Риск развития BPD у младенцев, пораженных RDS, может быть снижен путем введения кортикостероида в период времени в пределах нескольких недель после рождения. Однако эффективность послеродового введения кортикостероида нивелируется возможными системными эффектами, например гипертензией, гипергликемией, желудочно-кишечными осложнениями и инвалидностью вследствие дефекта нейроразвития.

В качестве альтернативы системному введению предложена доставка кортикостероида ингаляцией или инстилляцией в трахею.

Например, Yen et al. (Pediatrics 2008, 121 (5), e1310-e1318) предложили инстилляцию в трахею будесонида с использованием сурфактанта Survanta® в качестве носителя.

Однако, как указано в US 2007/0225233, релевантная процедура доставки имеет некоторые недостатки, связанные с ее соблюдением, поскольку она предусматривает введение лекарственного средства четырьмя аликвотами, и каждую аликвоту приходится вводить в разных и весьма затрудненных положениях младенца.

Исходя из вышеуказанных соображений, все еще существует потребность в разработке более удобного в обращении лекарственного средства, способного эффективно снижать маркеры легочного воспаления и окислительного стресса и, следовательно, снижать риск развития BPD у младенцев, страдающих RDS.

В частности, поскольку механическая вентиляция является инвазивной процедурой, которая, как известно, вносит вклад в развитие BPD, особенно предпочтительным будет создание лекарственного средства, которое также эффективно можно вводить способами, позволяющими избегать указанного поддержания дыхания.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к порактанту альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, для применения для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD).

Изобретение также относится к применению порактанта альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, в изготовлении лекарственного средства для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD).

Предпочтительно, указанное применение снижает маркеры легочного окислительного стресса.

Предпочтительно, беклометазона дипропионат применяют в дозе 0,8 мг/кг.

Изобретение также относится к комбинации порактанта альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, и беклометазона дипропионата в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, предпочтительно 0,8 мг/кг, для одновременного, последовательного или раздельного введения для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD), предпочтительно для одновременного введения.

Изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему фиксированную комбинацию порактанта альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, с беклометазона дипропионатом в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, предпочтительно 0,8 мг/кг.

В конкретном воплощении указанное лекарственное средство находится в форме фармацевтической композиции для введения ингаляцией или интратрахельного введения, содержащей указанную фиксированную комбинацию.

В другом воплощении изобретение относится к набору, содержащему:

а) порактант альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в первой стандартной лекарственной форме;

б) беклометазона дипропионат в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, предпочтительно 0,8 мг/кг, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель во второй стандартной лекарственной форме; и

в) контейнер для размещения в нем указанных первой и второй лекарственных форм.

В еще одном воплощении изобретение относится к способу предупреждения бронхолегочной дисплазии, включающему введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, порактанта альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, предпочтительно 0,8 мг/кг.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Используемый здесь термин "бронхолегочная дисплазия (BPD)" относится к хроническому легочному расстройству, известному также как хроническое заболевание легких (CLD), которое является следствием не вылеченного или восстановленного с отклонением от нормы повреждения легких.

BPD обычно имеет место у младенцев с очень низкой массой тела при рождении (VLBW), которые испытывают повреждение легких в результате токсического эффекта кислорода и баротравмы от механической вентиляции, которую к ним применяли ранее.

Используемый в данном документе термин "модифицированный природный сурфактант" относится к липидному экстракту из измельченного легкого млекопитающего. В результате осуществления способа экстракции липидов, используемого в процессе производства, гидрофильные белки SP-А и SP-D теряются. Эти препараты имеют вариабельные количества двух гидрофобных, сурфактант-ассоциированных белков SP-B и SP-C и в зависимости от способа экстракции могут содержать несурфактантные липиды, белки или другие компоненты.

Используемый в данном документе термин "порактант альфа" относится к модифицированному природному сурфактанту, экстрагированному из легких свиньи, по существу состоящему из полярных липидов, в основном фосфолипидов, и белков SP-B и SP-C. Порактант альфа продается под товарным знаком CUROSURF®.

Используемый здесь термин "фиксированная комбинация" означает комбинацию, в которой активные вещества находятся в фиксированном количественном соотношении.

Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый" относится к среде, которая не вызывает аллергической или подобной неблагоприятной реакции при введении младенцу.

"Сурфактантная активность" для препарата на основе сурфактанта определяется как способность снижать поверхностное натяжение.

Эффективность in vitro препаратов на основе экзогенных сурфактантов обычно тестируют путем измерения их способности снижать поверхностное натяжение с использованием прибора, такого как весы Вильгельми, прибора для измерения поверхностного натяжения методом пульсирующего пузырька, прибора для измерения поверхностного натяжения методом лежащего пузырька и прибора для измерения поверхностного натяжения методом капиллярных трубок.

Эффективность препаратов на основе экзогенных сурфактантов in vivo тестируют путем измерения механики внешнего дыхания в моделях недоношенных животных методами, известными специалисту в данной области.

Используемый здесь термин "тяжелый RDS" указывает на форму респираторного дистресс-синдрома у младенцев, обратно пропорционально зависящую от гестационного возраста и/или массы тела новорожденного, которая может быть диагностирована клиническими и/или радиографическими методами, известными специалисту в данной области.

Поскольку общеизвестно, что воздействие экстренного введения кортикостероида на механику внешнего дыхания незначительно, в контексте настоящей заявки термин "синергетический" означает, что в сумме активность сурфактанта плюс активность беклометазона дипропионата больше, чем можно было ожидать от активности только сурфактанта в отношении любого из параметров механики внешнего дыхания.

ПРОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано частично на неожиданно полученных данных, что беклометазона дипропионат в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, может быть объединен с модифицированным природным сурфактантом, таким как порактант альфа, в целях эффективного снижения риска бронхолегочной дисплазии (BPD) без изменения поверхностной активности сурфактанта.

Таким образом, настоящее изобретение относится к порактанту альфа в дозе, составляющей от 100 до 200 мг/кг, в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе, равной или выше 0,4 мг/кг, в качестве лекарственного средства для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD).

Предпочтительно, доза беклометазона дипропионата выше 0,4 мг/кг (400 мкг/кг) и предпочтительно находится в диапазоне от 0,6 до 0,8 мг/кг.

В одном из воплощений доза беклометазона дипропионата составляет 0,6 мг/кг.

Предпочтительная доза беклометазона дипропионата составляет 0,8 мг/кг (800 мкг/кг).

Предпочтительно, доза порактанта альфа составляет 200 мг/кг.

Комбинацию порактанта альфа и беклометазона дипропионата в указанных дозах можно вводить последовательно раздельно или вместе. Предпочтительно, когда два активных вещества вводят вместе, тогда их вводят в фиксированной комбинации.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему два активных вещества в указанных дозах в виде фиксированной комбинации. Лекарственное средство может быть в форме фармацевтической композиции.

Указанные композиции можно вводить в форме раствора, дисперсии, суспензии или сухого порошка. Предпочтительно, указанные композиции содержат заявленную комбинацию, суспендированную в подходящем физиологически переносимом растворителе.

Более предпочтительно, композиция содержит водный раствор, предпочтительно стерильный, который может также содержать регулирующие рН буферные агенты и другие фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80 или сорбитанмонолаурат в качестве смачивающих агентов и хлорид натрия в качестве агента изотоничности.

Композиции могут быть размещены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например в запаянных ампулах и во флаконах, или их можно хранить в замороженном или подвергнутом сублимационной сушке (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением.

Предпочтительно, композицию поставляют в виде стерильной суспензии в буферном физиологическом солевом водном растворе (0,9% мас./об. хлорида натрия) в одноразовых флаконах.

Введение заявленной композиции может быть выполнено известными способами, например эндотрахеальной инстилляцией, введением в виде спрея, или струйным ультразвуковым распылением, или с помощью небулайзеров с вибрирующей сеткой, обычно доступных на рынке.

Когда композицию вводят эндотрахеальной инстилляцией, подходящими могут быть разные способы в зависимости от тяжести респираторного дистресс-синдрома. Например, заявленную композицию можно вводить эндотрахеальной инстилляцией родившимся раньше срока младенцам, которых держат в условиях непрерывной или периодической искусственной вентиляции при положительном давлении.

Альтернативно, композицию можно вводить с использованием тонкого катетера, вставленного в трахею, и поддерживая дыхание пациента с помощью специально сконструированных назальных приспособлений, таких как маски, канюли или трубки, согласно методологии, известной как назальная искусственная вентиляция, создающая положительное постоянное давление в дыхательных путях (nasal Continuous Positive Airway Pressure, nCPAP), согласно методике, описанной в WO 2008/148469.

Последний подход может быть возможен только с экзогенным сурфактантом, таким как порактант альфа, имеющим низкую вязкость, так как высокая вязкость может затруднять проход сурфактанта через катетер.

Объем водного раствора, в котором суспендированы два объединенных активных вещества, будет зависеть от желаемой концентрации.

Предпочтительно, объем композиции не должен превышать 5,0 мл, предпочтительно он должен находиться в пределах между 4,5 и 2,0 мл, более предпочтительно между 3,5 и 2,5 мл.

Например, для порактанта альфа в количестве 200 мг и беклометазона дипропионата в количестве 0,8 мг, когда используют объем 2,5 мл, конечные концентрации порактанта альфа и беклометазона дипропионата могут составлять 80 мг/мл и 0,32 мг/мл соответственно.

Если использовали объем 4,5 мл, для одинаковых доз конечные концентрации будут составлять примерно 44 мг/мл и примерно 0,18 мг/мл соответственно.

Если использовали дозу порактанта альфа 100 мг, для объема 2,5 мл конечные концентрации будут составлять 40 мг/мл и 0,32 мг/мл соответственно.

В других воплощениях, когда порактант альфа и беклометазона дипропионат вводят раздельно, индивидуальные активные вещества могут быть приготовлены в виде отдельных композиций. В этом случае два индивидуальных активных вещества безусловно не придется вводить в одно и то же время.

В случае такого раздельного введения композиции двух индивидуальных активных веществ могут быть упакованы одновременно в подходящий контейнер. Такая раздельная упаковка компонентов в подходящем контейнере также описана как набор.

Таким образом, данное изобретение также относится к набору, содержащему: а) количество порактанта альфа, составляющее от 100 до 200 мг, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в первой стандартной лекарственной форме; б) количество беклометазона дипропионата, равное или выше 0,4 мг, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель во второй стандартной лекарственной форме; и в) контейнер для размещения в нем указанных первой и второй лекарственных форм.

Предпочтительно, первая стандартная лекарственная форма представляет собой одноразовый флакон, заполненный 2,5 мл стерильной композиции 80 мг/мл порактанта альфа, суспендированного в буферном физиологического солевом водном растворе (0,9% мас./об. хлорида натрия), и вторая стандартная лекарственная форма представляет собой одноразовый флакон, заполненный 2 мл стерильной композиции 0,8 мг/мл микронизированного беклометазона дипропионата, суспендированного в водном растворе, содержащем полисорбат (Tween) 20, сорбитанмонолаурат и хлорид натрия.

Комбинация по изобретению, которую можно вводить младенцу после рождения в соответствии с условиями, которые должен устанавливать специалист в данной области, пригодна для предупреждения, замедления, облегчения, остановки или торможения развития бронхолегочной дисплазии.

Предпочтительно, комбинация по изобретению пригодна для предупреждения развития бронхолегочной дисплазии у недоношенных младенцев, пораженных тяжелой формой респираторного дистресс-синдрома (RDS).

Однако ее можно применять для профилактики и/или лечения других заболеваний, связанных с потерей или дисфункцией эндогенного сурфактанта, таких как респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), острое повреждение легких (ALI) и синдром мекониевой аспирации (MAS).

Преимущества комбинирования порактанта альфа с дозой беклометазона дипропионата, которые выше, чем преимущества применяемых в настоящее время в терапевтической практике средств, вытекают из следующих полученных данных.

Действительно, было обнаружено в рандомизированном исследовании на недоношенных ягнятах с RDS, что порактант альфа в комбинации с дозой беклометазона дипропионата выше 0,4 мг/кг действует аддитивно на некоторые маркеры окислительного стресса легочных тканей и синергетически на параметр механики внешнего дыхания.

Исследование проводили путем интратрахельного введения порактанта альфа с беклометазона дипропионатом в других дозах по сравнению с дозами только сурфактанта.

Окисление легочной ткани исследовали путем измерения суммарных уровней гидропероксидов (ТН), продуктов глубокого окисления белков (АОРР) и не связанного с белками железа (NPBI) в образцах бронхиального аспирата. Уровень ТН был ниже в группах лечения сурфактантом с 400 или 800 мкг/кг беклометазона дипропионата, чем в группе введения только сурфактанта; уровень АОРР был ниже в группе лечения сурфактантом с 800 мкг/кг беклометазона дипропионата, чем в остальных группах; уровень NPBI был сходным во всех группах. Податливость легких также оценивали.

После лечения сурфактантом следовало длительное улучшение дыхательного объема (TV) и устойчивости дыхательных путей (Raw), которые, как и ожидалось, не изменялись в присутствии беклометазона дипропионата, даже в самой высокой дозе. Однако неожиданно было обнаружено, что добавление беклометазона дипропионата в дозе 800 мкг/кг приводит к синергетическому снижению среднего давления в дыхательных путях (MAP), необходимому для получения того же значения TV. И наоборот, в группе, которую лечили сурфактантом с беклометазона дипропионатом в дозе 400 мг/кг, влияние на MAP статистически не отличалось от влияния в группе, которую лечили только сурфактантом.

Это означает, что для пациентов, получающих комбинацию по изобретению, можно применять более мягкую механическую искусственную вентиляцию с меньшим риском баротравм.

Таким образом, с точки зрения вышеупомянутых полученных данных, т.е. снижения окислительного легочного стресса и синергетического улучшения одного из параметров механики внешнего дыхания, согласно настоящему изобретению создана комбинация, особенно эффективная для предупреждения бронхолегочной дисплазии.

Кроме того, поскольку беклометазона дипропионат является в высокой степени липофильным кортикостероидом, это его свойство может способствовать его всасыванию через слизистую оболочку и захват через фосфолипидные клеточные мембраны с весьма незначительным системным всасыванием, делая эту комбинацию безопасной для терапевтического применения у младенцев.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют данное изобретение более подробно.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

ОЦЕНКА IN VITRO ПОВЕРХНОСТНОЙ АКТИВНОСТИ ПОРАКТАНТА АЛЬФА В ПРИСУТСТВИИ БЕКЛОМЕТАЗОНА ДИПРОПИОНАТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРИБОРА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНЫХ ТРУБОК

Поверхностную активность порактанта альфа (в присутствии беклометазона дипропионата, 2 мл, 0,8 мг) оценивают в сравнении с одним порактантом альфа с использованием прибора для измерения поверхностного натяжения методом капиллярных трубок, коммерчески доступного от Calmia Medical, Inc., USA.

Готовят два образца: один из флакона с порактантом альфа (1,5 мл, 80 мг/мл) путем разбавления физиологическим раствором до концентрации 1 мг/мл в фосфолипидах, а другой из флакона с порактантом альфа (1,5 мл, 80 мг/мл), смешанного с содержимым из флакона с беклометазона дипропионатом (2 мл, 0,8 мг) и разбавленного физиологическим раствором до той же концентрации (1 мг/мл фосфолипидов). Образец 0,5 мл каждого раствора затем оценивают в приборе для измерения поверхностного натяжения методом капиллярных трубок.

Принцип прибора для измерения поверхностного натяжения методом капиллярных трубок заключается в стимуляции терминальных дыхательных путей человека. Образец вводят в узкую часть стеклянного капилляра, где внутренний диаметр равен 0,25 мм, т.е. подобен диаметру терминальных дыхательных путей человека. Один конец капилляра соединяют с гофрированной трубкой и датчиком давления. При медленном сдавливании гофрированной трубки давление поднимается и регистрируется. Увеличение давления заставляет образец выдавливаться из узкой части капилляра. Как только воздух начинает проходить через капилляр, давление резко снижается. Если образец содержит хорошо функционирующий легочный сурфактант, то жидкий образец не будет возвращаться в узкую часть. Устойчивый воздушный поток, получаемый путем непрерывного сдавливания гофрированной трубки, не будет встречать сопротивления, и регистрируемое давление будет равно нулю. С другой стороны, если образец не содержит хорошо функционирующий легочный сурфактант, то жидкий образец будет повторно возвращаться.

Поведение порактанта альфа с беклометазона дипропионатом, оказывается, статистически не отличается от поведения одного порактанта альфа, что указывает на то, что беклометазона дипропионат в указанной дозе не влияет на поверхностную активность сурфактанта.

ПРИМЕР 2

ОЦЕНКА IN VIVO ПОРАКТАНТА АЛЬФА В КОМБИНАЦИИ С БЕКЛОМЕТАЗОНА ДИПРОПИОНАТОМ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и приборы

Всех животных извлекали посредством кесарева сечения на 124±1,7 сутки гестационного срока из овец Massa ewes (срок гестационного возраста 145 суток). После обнажения головки и шеи плода в сонную артерию вставляют катетер для непрерывного мониторинга давления крови и взятия образцов крови. Катетер соединяют в датчиками давления с нулевой точкой отсчета по отношению к уровню в средней части грудной клетки.

Венозный катетер вставляют в правую внутреннюю яремную вену для непрерывной инфузии жидкостей (декстроза 10%, 100 мл/кг/сутки) и лекарственных средств, и эндотрахеальную трубку вставляют в трахею. Жидкость из легких плода, которая легко может быть аспирирована шприцем, извлекают, и ягнят извлекают и взвешивают (2425±410 граммов). Используют стандартное отведение электрокардиограммы (ECG). Ректальную температуру поддерживают в пределах нормального диапазона с использованием электрических нагревательных подушек.

Перед первым вдохом ягнята получают рандомизированно 200 мг/кг порактанта альфа (Curosurf®, Chiesi SpA, Parma, Italy), затем в дыхательные пути шприцем подают 10 мл воздуха или 200 мг/кг того же сурфактанта вместе с 400 или 800 мкг/кг беклометазона дипропионата (Clenil A®, Chiesi SpA, Parma, Italy). Рандомизацию осуществляют с использованием методов закрытого конверта до родов.

Всем животным делают искусственную вентиляцию в течение 6 ч аппаратами искусственной вентиляции легких для младенцев, работающими с переключением по времени и ограничением давления (Newport Breeze Ventilator, Soma Technology Inc., Bloomfield, CT, USA), используя аналогичные стратегии вентиляции. Частоту 60 вдохов/мин, время вдоха 0,5 с и положительное конечное давление на выдохе (PEEP) 4 см H₂O не изменяют. Пиковое давление на вдохе (PIP) изменяют для поддержания значения pCO₂ 35-65 торр (35-65 мм Hg). Давление ограничивают до PIP 35 см H₂O во избежание пневмоторакса. Фракцию вдыхаемого кислорода регулируют для сохранения целевого O₂ 100-150 мм Hg. Чтобы исключить возможность влияния изменений параметров вентиляции на результаты исследования, лицам, ответственным за регулировку аппарата искусственной вентиляции, не сообщают о назначенном лечении.

Газы крови, рН и избыток оснований (BE) анализируют с использованием системы для анализов на газы крови, электролиты и метаболиты (Radiometer Copenhagen USA, West Lake, ОН) по меньшей мере каждые 30 минут или при изменении статуса искусственной вентиляции легких, на что указывают изменения движения грудной клетки и дыхательных объемов.

В течение всего эксперимента плазмозаменитель полигелин (Emagel®, Novaselect, Potenza, Italy) и/или допамин, 10-20 мкг/кг/мин, вводят при необходимости для поддержания среднего SAP выше 30 мм Hg. Метаболические ацидозы (рН<7,25 и BE<8 ммоль/л) корректируют инфузией бикарбоната натрия или ТНАМ (трис(гидроксиметил)аминометан) (в случае гиперкапнии: PaCO₂>45 мм Hg). рН, pO₂ и pCO₂ каждого животного регистрируют как можно раньше сразу после родов и через 1 (T₁), 2 (Т₂), 4 (Т₄) и 6 (Т₆) часов после введения сурфактанта.

Мониторинг механики внешнего дыхания. Среднее давление в дыхательных путях (MAP), динамическую растяжимость легкого (Cdyn), выдыхаемый дыхательный объем (TV) и сопротивление выдохам (Raw) измеряют с использованием неонатального респираторного монитора (Florian Neonatal Respiration Monitor™, Acutronic, Hirzel, Switzerland), и регистрируют их исходные значения и значения в моменты времени T₁, Т₂, Т₄ и Т₆.

Анализы окислительного стресса легких. Образцы бронхиального аспирата, взятые из животных в каждых группах, получали следующим образом: 1 мл/кг стерильного 0,9%-ного физиологического раствора вводили инстилляцией с использованием шприца на 10 мл через питающий катетер номер 8F, который помещен в эндотрахеальную трубку таким образом, чтобы кончик на 2 см выходил за пределы дистального конца трубки. Физиологический раствор вводили каплями и сразу аспирировали назад в шприц.

Средний объем возвращенного физиологического раствора составляет 1,5 мл. Все образцы очищали центрифугированием (1000 об/мин × 5 мин), и надосадочную жидкость немедленно замораживали при -70°С и хранили для последующего анализа. Бронхиальный аспират собирали из каждого животного, затем вводили сурфактант, после обнажения головки плода и через 1 (T₁), 2 (Т₂), 4 (Т₄) и 6 (Т₆) часов после введения сурфактанта.

В каждом образце бронхиального аспирата измеряли суммарные уровни концентрации гидропероксидов (ТН), продуктов окисления белков (АОРР) и не связанного с белками железа (NPBI). Продуцирование ТН измеряли с использованием набора d-ROMs Kit (Diacron srl, Italy) спектрофотометрическим методом.

Результаты выражают в стандартных единицах (единицы Карр: 1 единица Карр равна концентрации 0,08 мг/дл перекиси водорода). АОРР измеряют методом, описанным Witko-Sarsat et al. (Kidney Int. 1996, 49 (5): 1304-13), с использованием спектрофотометрии на микропланшет-ридере. Концентрацию АОРР выражают в мкмоль/л эквивалентов хлорамина-Т. Уровни NPBI определяют методом ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) по методике, описанной Kime et al. (Clin Sci(Lond) 1996, 91 (5): 633-8), частично модифицированной. Результаты выражают в нмоль/мл.

Извлечение ткани и патологическое исследование. В конце эксперимента животных умерщвляли сверхдозой пентобарбитала. Грудную клетку осторожно вскрывали, чтобы проверить, имеются ли признаки пневмоторакса, и собрать ткань. Трахею и легкие удаляли и помещали в ванну с буферным 10% формалином. Два случайных легочных образца получали из верхней и нижней долей обоих легких. Для подготовки тканей для заделки в парафин использовали обычные методики. Срезы толщиной пять микрон окрашивали гематоксилин-эозином, и два патолога выполняли слепое микроскопическое исследование. Растяжение терминальных дыхательных путей классифицировали по степени и присваивали степень 0, когда находили, что оно аналогично контрольным легким, степень 1, когда имело место расширение (в 1-1,5 раза больше внутреннего диаметра контрольных дыхательных путей), и степень 2, когда имело место очень сильное расширение (более чем в 1,5 больше внутреннего диаметра контрольных дыхательных путей). Дополнительно анализировали следующие гистологические признаки: области ателектаза (спадения легких), интерстициальный и/или альвеолярный отек, воспалительная инфильтрация, разрывы междольковых перегородок и десквамация бронхиолярного эпителия. Каждый патологический признак оценивали как 1, когда он присутствуют, и 0, когда он отсутствует. Оценку повреждения легких, которое считается отрицательным =0, легким =0-1, умеренным =2-3 и тяжелым ≥4, получают суммированием баллов.

Статистический анализ. Времязависимые изменения анализировали однофакторным дисперсионным анализом для повторных замеров. Эволюцию во времени между разными группами сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа для повторных замеров и одного группирующего фактора (т.е. "время" и "лечение"). Внутригрупповые сравнения в разных группах между разными условиями лечения тестировали с использованием парного критерия Стьюдента. Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартное отклонение, и значение р<0,05 считали значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Восемнадцать животных рандомизировали для введения 200 мг/кг природного сурфактанта (n=6), 200 мг/кг сурфактанта с 400 мкг/кг беклометазона дипропионата (n=6) и 200 мг/кг сурфактанта с 800 мкг/кг беклометазона дипропионата (n=6).

Газообмен. В Таблице 1 указаны изменения рН и анализ газов крови в исследованных группах. Во всех группах наблюдается значительное увеличение рН в моменты времени T₁, Т₂, Т₄ и Т₆ по сравнению с исходными значениями; pCO₂ не меняется в группе, получавшей сурфактант, но значительно снижается в группах, получавших сурфактант с беклометазона дипропионатом в моменты времени T₁, Т₂, Т₄ и Т₆; pO₂ сходно в группах в каждый момент времени; BE имеет тенденцию к снижению в каждой группе, но статистические изменения носят временный характер и имеют низкую значимость.

MAP и механика внешнего дыхания. В Таблице 2 указаны изменения MAP, TV, Cdyn и Raw. MAP значительно снижается в группе, которую лечили сурфактантом с 800 мкг/кг беклометазона дипропионата в моменты времени Т₄ и Т₆, и ниже, чем в других группах; TV и Raw снижаются от исходных уровней во всех группах, a Cdyn не изменяется.

Анализы окислительного стресса. В Таблице 3 подробно указаны изменения ТН, АОРР и NPBI. ТН ниже в момент времени Т₆ в группе, которую лечили сурфактантом с 400 мкг/кг беклометазона дипропионата, чем в группе, получавшей сурфактант, и в моменты времени Т₄ и Т₆ в группе, которую лечили сурфактантом с 800 мкг/кг беклометазона дипропионата, чем в других группах; АОРР увеличивается в момент времени T₁ и затем падает в моменты времени Т₂, Т₄ и Т₆ во всех группах, но в момент времени Т₆ его значение ниже в группе, которую лечили сурфактантом с 800 мкг/кг беклометазона дипропионата, чем в других группах. NPBI обнаружен во всех группах, и его концентрация не изменяется и не варьирует между группами.

Макроскопические и микроскопические признаки. При макроскопическом исследовании легкие животных, которых лечили сурфактантом с 800 мкг/кг беклометазона дипропионата, демонстрируют тенденцию лучшей аэрации, чем другие группы. При микроскопическом исследовании дистальные дыхательные пути выглядят более спавшимися в группе, получавшей сурфактант, чем в группах, получавших сурфактант с 400 или 800 мкг/кг беклометазона дипропионата. Более того, наблюдались участки ателектаза (спадения легких), некоторые альвеолы, содержащие макрофаги, и утечки через некоторые интерлобулярные перегородки. Общая оценка повреждения легких ниже в группе, получавшей сурфактант с 400 мкг/кг беклометазона дипропионата (1,8±0,7) и в группе, получавшей сурфактант и 800 мкг/кг беклометазона дипропионата (1,8±0,3), чем в группе, получавшей сурфактант (2,4±0,6), но разница не является статистически значимой.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты демонстрируют, что лечение порактантом альфа в комбинации с беклометазона дипропионатом эффективно в снижении окислительного стресса у недоношенных ягнят с дыхательной недостаточностью. Фактически, наблюдается, что после интратрахеальной инстилляции сурфактанта и 800 мкг/кг беклометазона дипропионата в образцах бронхиального аспирата уровни ТН в моменты времени Т₄ и Т₆ и АОРР в момент времени Т₆ ниже по сравнению с другими группами; после интратрахеальной инстилляции сурфактанта и 400 мкг/кг беклометазона дипропионата наблюдается снижение ТН в момент времени Т₆ по сравнению с группой, получавшей сурфактант, хотя инстилляция одного сурфактанта не оказывает влияния на концентрацию маркеров окислительного стресса. Эти результаты являются релевантными, поскольку ТН является показателем общего окислительного стресса, с учетом того, что он представляет собой промежуточные продукты окисления липидов, пептидов и аминокислот, а одновременное определение АОРР дает информацию относительно другого аспекта вовлечения белков в реакции с участием свободных радикалов, а именно окисленных белков, которые потеряли их окислительные свойства.

Иначе обстоит дело с концентрацией NPBI, которая не меняется в исследованных группах. Однако, как сообщалось ранее, значения NPBI могут быть не связаны с изменениями концентрации других маркеров окислительного стресса, вероятно из-за того, что они образуются также из других источников.

Кроме того, что касается растяжимости легких, было показано, что после лечения сурфактантом наблюдается длительное улучшение TV и Raw, тогда как Cdyn не меняется. Однако неожиданно беклометазона дипропионат в дозе 800 мкг/кг синергетически снижает среднее давление в дыхательных путях (MAP), необходимое для получения одного и того же значения TV, по сравнению с группой, которую лечили сурфактантом и беклометазона дипропионатом в дозе 400 мг/кг и только сурфактантом.

Таким образом, эффект интратрахельного беклометазона дипропионата в дозе 800 мкг/кг не ограничивается снижением легочного окислительного стресса, а согласуется также с улучшением механики внешнего дыхания и, следовательно, с дыхательной функцией животных.

В соответствии с другими полученными данными гистологическое исследование показывает тенденцию к снижению морфологического повреждения легких в группах, которые получали сурфактант плюс беклометазона дипропионат.

Таблица 1. Изменения результатов анализа газов крови у недоношенных ягнят, которых лечили сурфактантом плюс 400 мкг/кг беклометазона дипропионата (BDP) или сурфактантом плюс 800 мкг/кг беклометазона дипропионата (BDP). Среднее значение ± SD (стандартное отклонение).   Сурфанктант Сурфанктант + BDP 400 мкг Сурфанктант + BDP 800 мкг РН:       Исходный уровень 6,93±0,09* 6,90±0,09** 7,02±0,07** T₁ 7,11±0,25 7,26±0,16 7,34±0,11 T₂ 7,23±0,21 7,32±0,17 7,36±0,05 T₄ 7,23±0,18 7,32±0,09 7,36±0,08 T₆ 7,19±0,17 7,36±0,09 7,37±0,10* pCO₂:       Исходный уровень 86±25 109±12** 93±20*** T₁ 62±26 49±26 47±16 T₂ 70±40 46±18 43±14 T₄ 63±29 50±13 42±7 T₆ 64±38 47±17 38±7 pO₂:       Исходный уровень 96±113 71±54 106±133 T₁ 150±158 164±84 147±110 T₂ 160±165 155±114 100±134 T₄ 147±132 131±93 151±139 T₆ 134±177 95±100 123±146 BE:       Исходный уровень -11,7±6,7^ -5,5±6,6 -6,6±5,6 T₁ -6,1±6,6 -6,8±6,0 -1,3±2,1 T₂ -4,1±4,4 -0,32±5,1 -1,1±2,9 T₄ -3,9±0,7 -1,6±1,9^^ -2,1±3,5 T₆ -5,3±4,7 -2,1±1,9 -3,4±4,8 *р=0,009 для 2 ч; р=0,004 для 4 ч; р=0,008 для 6 ч; **р<0,0001 для 1, 2, 4, 6 ч; р=0,001 для 1 ч; р<0,0001 для 2, 4 ч; °р=0,049 для сурфактанта; ^р=0,018 для 4 ч; ^^р=0,019 для сурфактанта.

Таблица 2.   Изменения среднего давления в дыхательных путях (MAP) и механики внешнего дыхания у недоношенных ягнят, которых лечили сурфактантом, сурфактантом плюс 400 мкг/кг беклометазона дипропионата (BDP) или сурфактантом плюс 800 мкг/кг беклометазона дипропионата (BDP). Среднее ± SD.  

  Сурфанктант Сурфанктант + BDP 400 мкг Сурфанктант + BDP 800 мкг MAP:       Исходный уровень 15,2±1,0 15,8±1,2 16,2±1,3 T₁ 16,0±2,3 16,2±1,7 16,2±1,6 T₂ 15,6±1,9 16,0±1,7 15,8±2,6 T₄ 15,5±1,3 15,2±3,2 11,0±2,3* T₆ 15,7±2,6 15,5±3,0 11,8±2,5** TV (мл/кг): 3,9±1,7# 4,1±1,0* 4,1±1,9# Исходный уровень       T₁ 11,3±4,2 11,8±4,2 11,5±3,2 T₂ 10,4±3,0 11,7±4,4 11,2±1,3 T₄ 10,4±3,1 12,2±8,3 11,6±1 T₆ 11,3±4,5 11,9±2,2 11,4±2,1 Cdyn (/кг):       Исходный уровень 0,4±0,1 0,4±0,5 0,5±0,8 T₁ 0,4±0,1 0,4±0,1 0,4±0,1 T₂ 0,4±0,1 0,4±0,1 0,5±0,3 T₄ 0,5±0,1 0,5±0,2 0,6±0,2 T₆ 0,6±0,3 0,5±0,1 0,5±0,1 Raw:       Исходный уровень 283±73^ 295±13^^ 308±13^^^ T₁ 235±25 219±41 248±47 T₂ 214±24 225±20 237±43 T₄ 195±71 225±11 208±13 T₆ 185±43 208±44 231±41 *р<0,0001 для исходного уровня; р=0,003 для T₁; р=0,022 для Т₂; р=0,002 для сурфактанта; р=0,026 для сурфактанта + BDP 400; ** р=0,003 для исходного уровня; р=0,005 для Т₁; р=0,022 для Т₂; р=0,024 для сурфактанта; р=0,043 для сурфактанта + BDP 400; ^#р<0,0001 для Т₁, Т₂, Т₄, Т₆; ^р=0,018 для Т₆; ^^р=0,001 для 1 ч; <0,0001 для Т₁, Т₂, Т₄, Т₆; ^^^р=0,013 для Т₁; р=0,003 для Т₂; р<0,0001 для Т₄; р=0,003 для Т₆.

Таблица 3. Изменения ТН, АОРР и NPBI у недоношенных ягнят, которых лечили сурфактантом, сурфактантом плюс 400 мкг/кг беклометазона дипропионата (BDP) или сурфактантом плюс 800 мкг/кг беклометазона дипропионата (BDP). Среднее ± SD. ТН (единица Карр) Исходный уровень Т₁ T₂ T₄ T₆ Сурфактант 73,6±15,4 85,5±18,1 86,1±35,1 94,2±35,5 93,4±20,5 Сурфактант ± BDP 400 42,9±18,6 73,6±27,9 61,7±29,6 65,7±30,1 52,7±22,2^ Сурфактант ± BDP 800 77,8±61,3 50,1±61,1 95,1±61,1 57,6±23,2* 58,2±26,0**

АОРР (мкмоль/л) Исходный уровень Т₁ T₂ T₄ T₆ Сурфактант 2,1±1,8* 25,9±9,2 13,6±8,3 18,5±11,6 18,7±9,7 Сурфактант ± BDP 400 4,6±2,2** 36,9±24,7 17,3±7,0 15,3±8,1 11,5±10,9 Сурфактант ± BDP 800 1,9±0,6*** 16,3±9,7 12,2±11,6 8,2±5,7 7,2±2,8° NPBI Исходный уровень Т₁ T₂ T₄ T₆ Сурфактант 0,9±2,0 1,6±1,6 0,4±0,7 1,4±1,1 0,3±0,6 Сурфактант ± BDP 400 0,3±0,4 2,7±2,3 1,2±2,3 0,8±0,8 0,5±0,8 Сурфактант ± BDP 800 0,3±0,1 0,3±0,6 0,6±1,0 0,7±1,5 0,0±0,0 ^р=0,008 для сурфактанта; *р=0,060 для сурфактанта; **р=0,026 для сурфактанта; *р<0,0001 для Т₁, Т₄, Т₆; р=0,008 для Т₂; ^##р=0,010 для Т₁; р=0,002 для Т₂; р=0,011 для Т₄; ^###р=0,005 для Т1; р=0,023 для Т₄; р=0,001 для Т₆; °р=0,019 для сурфактанта.

Предложена группа изобретений, включающая: применение порактанта альфа в дозе от 100 до 200 мг/кг в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе от 0,6 до 0,8 мг/кг для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD) (варианты), для изготовления лекарственного средства для предупреждения BPD, соответствующая фармацевтическая композиция и набор того же назначении. Технический результат не ограничивается снижением уровней маркеров окислительного стресса легких, а сочетается с улучшением механики внешнего дыхания: показано синергетическое снижение значения МАР (среднего давления в дыхательных путях). 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Применение порактанта альфа в дозе от 100 до 200 мг/кг в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе от 0,6 до 0,8 мг/кг для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD).

2. Применение порактанта альфа в дозе от 100 до 200 мг/кг в комбинации с беклометазона дипропионатом в дозе от 0,6 до 0,8 мг/кг в изготовлении лекарственного средства для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD).

3. Применение по п.1 или 2, приводящее к снижению уровней маркеров окислительного стресса легких.

4. Применение по п.1 или 2, где доза порактанта альфа составляет 200 мг/кг.

5. Применение по п.1 или 2, где доза беклометазона дипропионата составляет 0,8 мг/кг.

6. Применение комбинации
порактанта альфа в дозе от 100 до 200 мг/кг и
беклометазона дипропионата в дозе от 0,6 до 0,8 мг/кг
для одновременного, последовательного или раздельного использования для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPD).

7. Фармацевтическая композиция для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPDP), содержащая порактант альфа и беклометазона дипропионат в фиксированном количественном соотношении, обеспечивающем дозу порактанта альфа от 100 до 200 мг/кг и дозу беклометазона дипропионата от 0,6 до 0,8 мг/кг.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, где доза порактанта альфа составляет 200 мг/кг.

9. Фармацевтическая композиция по п.7, где доза беклометазона дипропионата составляет 0,8 мг/кг.

10. Фармацевтическая композиция по п.7, представленная в форме для ингаляции или интратрахеального введения.

11. Фармацевтическая композиция по п.10 в форме стерильной суспензии в буферном физиологическом солевом водном растворе (0,9% мас./об. хлорида натрия).

12. Набор для предупреждения бронхолегочной дисплазии (BPDP), содержащий: а) порактант альфа в количестве, обеспечивающем дозу от 100 до 200 мг/кг, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в первой стандартной лекарственной форме; б) беклометазона дипропионат в количестве, обеспечивающем дозу от 0,6 до 0,8 мг/кг, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель во второй стандартной лекарственной форме; и в) контейнер для размещения в нем указанных первой и второй лекарственных форм.

13. Набор по п.12, где доза порактанта альфа составляет 200 мг/кг.

14. Набор по п.12 или 13, где первая стандартная лекарственная форма представляет собой одноразовый флакон, заполненный 2,5 мл стерильной композиции 80 мг/мл порактанта альфа, суспендированного в буферном физиологическом солевом водном растворе (0,9% мас./об. хлорида натрия), а вторая стандартная лекарственная форма представляет собой одноразовый флакон, заполненный 2 мл стерильной композиции 0,8 мг/мл микронизированного беклометазона дипропионата, суспендированного в водном растворе, содержащем полисорбат (Tween) 20, сорбитанмонолаурат и хлорид натрия.