ЛИПОТЕТРАПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ ДИЭФИРОВ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C07K5/09 A61K38/06 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности производным аминокислот и пептидов, принадлежащих к классу алифатических диэфиров, содержащих четыре аминокислотных остатка.

Как известно, комплексация ДНК липидами обусловлена в основном электростатическими взаимодействиями между положительно заряженными липидами и отрицательно заряженной фосфатной группы нуклеиновой кислоты. Однако в природе узнавание и связывание нуклеиновых кислот белками включает также нековалентные взаимодействия, что также может влиять на трансфекционную активность. Для исследования данного явления был синтезирован ряд липидоподобных пептидов с различными по длине гидрофобными цепями: Lys-Trp-Lys (KWK), Lys-Gly-Gly (KGG), Lys-Gly-Lys (KGK) [Lamanna K., Lusic H., Camplo M., Bartheleme F. Grinstaff M.Charge-Reversal Lipids, Peptide-Based Lipids, and Nucleoside-Based Lipids for Gene Delivery // Accounts of chemical research. 2011. P.205-210].

Кроме того, в дополнение были проведены исследования на цитотоксичность полученных пептидных липидов. Полученные соединения проявили меньшую цитотоксичность, чем Липофектамин 2000. Недостатком данных соединений является их невысокая эффективность трансфекции.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является ряд катионных липидов, содержащих дипептиды - L-лизил-L-глутамат или L-орнитил-L-глутамат, модифицированные алифатическими спиртами с длиной цепи C₈-C₁₈:

Катионные липосомы, полученные на основе данных липидов, проявили высокую трансфекционную эффективность на линиях клеток Hela, COS7, СНО, НЕК293 и меньшую цитотоксичность по сравнению с другими коммерчески доступными препаратами, такими как DOTAP-содержащие липосомы [Себякин Ю.Л., Буданова У.А. «pH-Чувствительные катионные липопетиды для создания транспортных систем медицинского назначения» // Биоорганическая химия. 2006. Т.32. №5. С.453-458].

Использование предлагаемых липотетрапептидов в качестве катионных векторов доставки генетического материала с большим количеством аминокислотных остатков в полярном блоке амфифила по сравнению с липодипептидами должно способствовать уменьшению размера образуемых в воде агрегатов и увеличению эффективности трансфекции.

Соединения и их синтез ранее в литературе не описаны и аналогов не имеют.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является синтез ряда новых алифатических производных тетрапептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей (Orn)₂OrnGlu и (Lys)₂LysGlu, а гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи C₈-C₁₆:

Для достижения указанного технического результата разработана схема получения липотетрапептидов, включающая следующие этапы: синтез этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты, защита аминогрупп L-орнитина и L-лизина, активация карбоксильных групп и образование пептидной связи между этими компонентами, удаление защитных групп с полученного дипептидного производного, активация карбоксильных групп и образование пептидной связи с получением производных тетрапептидов, удаление защитных групп с получением липотетрапептидов.

Реализация данного изобретения подтверждается примерами.

Пример 1

Синтез диоктил-N-(N,N-ди-(L-лизил))-L-лизил-L-глутамат бистрифторацетата (Lys)₂LysGlu(C₈)₂.

Смесь 2 г (0.0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 3.2 г (0.0326 моль) октилового спирта и 3.1 г (0.0163 моль) n-толуолсульфокислоты нагревали на масляной бане при 130°C в течение 6 ч. После окончания реакции реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, перекристаллизовывали из ацетона и промывали эфиром.

Для удаления тозильной группы 1.0 г соли растворяли в 50 мл хлороформа, промывали 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия (2×80 мл), водой до pH 7, сушили сульфатом натрия. Растворитель отгоняли в вакууме. Получали 0.48 г (71%) диоктил-L-глутамата Glu(C₈)₂, R_f 0.47 (толуол-ацетонитрил, 3:1).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3387 (NH₂), 2920 (С-H), 1725 (С=O), 1615 (NH₂), 1470 (CH₂), 1385 (CN), 1281 (CH₃), 1189 (С-О-C), 1123 (О-C-С), 725 (NH₂). ¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0.88 (т, 6Н, CH₃); 1.25 (с, 20H, CH₂); 1.38 (т, 4Н, COOCH₂CH₂); 1.67 (м, 2Н, CHCH₂CH₂), 1.82 (м, 2Н, CHCH₂CH₂). 2.36 (м, 2Н, CH₂COO), 3.97 (м, 1H, COOCH₂CH₂), 4.29 (т, 2Н, NH₂).

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-лизина Boc₂Lys 0.25 г (0.722 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0.108 г (0.794 ммоль) N-оксибензотриазола в 2 мл N,N-диметилформамида и при активном перемешивании охлажденный раствор 0.164 г (0,794 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл хлороформа. Смесь выдерживали 2 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. Контроль за ходом реакции осуществляли по данным тонкослойной хроматографии (ТСХ).

К полученному раствору добавляли 0.295 г (0,794) диоктил-L-глутамата Glu(C₈)₂ в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 5 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли колоночной хроматографией на силикагеле в системе (толуол-ацетонитрил, 3:1). Выход диоктил-N-(бис-Вос-L-лизил)-L-глутамата Boc₂LysGlu(C₈)₂ составил 0.278 г (53%), R_f 0.72 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3996 (NH), 2912 (CH), 2900 (CH), 1740 (С=O), 1654(С=O, амид I), 1644 (NH, амид II), 1503, 1461 (СН), 1372 (СН), 1198, 1112 (С-O). ¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м. д.): 0.87 (6H, т, 2СН₃), 1.23 (20H, с, 10 СН₂), 1.41 (18H, с, 2C(CH₃)₃), 1.63-1.82 (4H, м, 2CHCH₂CH₂), 2.22 (2H, м, 2 СН₂), 2.54 (2H, т, СН₂СОО), 3.8 (4H, м, 2OCH₂), 4.35 (2H, т, CH₂), 5.6 (1H, д, CONH), 6,9 (1H, д, CONH).

Растворяли 0.2 г (0.286 ммоль) полученного соединения в 1 мл хлороформа и 1 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Продукт выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). Выход диоктил-N-(L-лизил)-L-глутамат бистрифторацетата LysGlu(C₈)₂ 0.229 г (95%), R_f 0.72 (метанол-хлороформ, 2:1). ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3331 (NH), 2942 (СН), 2828 (СН), 1725 (С=O), 1660 (С=O, амид I), 1640 (NH, амид II), 1358 (СН), 1209 (CF), 1107 (С-O), 959, 828, 792, 715. ¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м. д.): 0.85 (6H, т, 2 СН₃), 1.23 (44H, с, 10 CH₂), 1.53 (6H, м, 3СН₂), 1.77-1.91 (4H, м, CHCH₂CH₂), 2.84 (2H, т, CH₂COOH), 4.0 (4H, м, 2 OCH3), 4.28 (1H, м, СН), 7.3 (5.6 Н, с, 2NH₃ ⁺).

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-лизина 0.103 г (0.297 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0.044 г (0.327 ммоль) N-оксибензотриазола в 2 мл N,N-диметилформамида и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,067 г (0,327 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 8 мл хлороформа. Смесь выдерживали 3 ч при охлаждении и 1 ч при комнатной температуре, выпавший осадок отфильтровывали. Контроль за ходом реакции осуществляли по данным ТСХ.

К полученному раствору добавляли 0,1 г (0,119) диоктил-N-(L-лизил)-L-глутамат бистрифторацетата в 3 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 8 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Растворяли 0.2 г реакционной массы в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 8 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Растворяли в хлороформе, выпавший осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали. Продукт выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). Выход диоктил-N-(N,N-ди-(L-лизил))-L-лизил-L-глутамат бистрифторацетата (Lys)3Glu(C₈)₂ 8.3 г (8.2%), R_f 0.68 (метанол-хлороформ, 2:1).

Масс-спектр: [М⁺] 756.774; [М⁺ (матрица)] 683.733.

Пример 2.

Синтез дитетрадецил-N-(N,N-ди-(L-орнитил))-L-орнитил-L-глутамат бистрифторацетата

Аналогично диоктил-L-глутамата Glu(C₈)₂ Из 2.0 г (0.0136 моль) 1-глутаминовой кислоты, 6.4 г (0.0292 моль) миритилового спирта и 3.1 г (0.0163 моль) n-толуолсульфокислоты аналогично диоктил-L-глутамату получали 0.54 г (73%) дитетрадецил-L-глутамата G1u(C₁₄)₂, R_f 0.47 (толуол-ацетонитрил, 3:1).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3395 (NH₂), 2945 (С-H), 1725 (С=O), 1632 (NH₂), 1482 (СН₂), 1381 (CN), 1281 (СН₃), 1202 (С-О-C), 1126 (O-С-С), 753 (NH₂).

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина 0.25 г (0.75 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0.111 г (0.82 ммоль) N-оксибензотриазола в 2 мл N,N-диметилформамида и при активном перемешивании охлажденный раствор 0.169 г (0,82 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 8 мл хлороформа. Смесь выдерживали 4 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали.

К полученному раствору добавляли 0.443 г (0,82 ммоль) дитетрадецил-L-глутамата в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 4.5 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной ТСХ в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Выход дитетрадецил-N-(бис-Boc-L-орнитил)-1-глутамата Boc₂OrnGlu(C₁₄)₂ составил 0.327 г (51%), R_f 0.72 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3996 (NH), 2914 (CH), 2900 (СН), 1741 (С=O), 1685 (С=O, амид I), 1644 (NH, амид II), 1500, 1460 (СН), 1374 (СН), 1200, 1100 (С-O). ¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0.85 (6 Н, т, 2 СН3), 1.23 (44 Н, с, 10 СН₂), 1.37 (18H, с, 2 С(СН₃)₃), 1.81-1.97 (4H, м, 2CHCH₂CH₂), 2.34 (2H, м, 2 CH₂), 2.87 (2H, т, CH₂COO), 4.0 (4H, м, 2OCH₂), 4.26 (1Н, т, CH), 5.7 (1H, д, CONH), 6.9 (1H, д, CONH).

Растворяли 0.3 г (0,351 ммоль) полученного соединения в 1 мл безводной трифторуксусной кислоты. Раствор выдерживали при комнатной температуре 2 ч. Продукт выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). Выход дитетрадецил-N-(L-орнитил)-L-глутамат бистрифторацетата OrnGlu(C₁₄)₂ 0.328 г (97%), R_f 0.72 (метанол-хлороформ, 2:1).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3335 (NH), 2940 (CH), 2829 (СН), 1725 (С=O), 1660 (С=O, амид I), 1640 (NH, амид II), 1360 (СН), 1209 (CF), 1110 (С-O), 959, 822, 795, 710. ¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0.85 (6H, т, 2 CH₃), 1.23 (44H, с, 10 CH₂), 1.57 (6H, м, 3СН₂), 1.79-1.89 (4H, м, 2CHCH₂CH₂), 2.85 (2H, т, CH₂COOH). 4.1 (4H, м, 2 OCH3), 4.25 (1H, м, CH), 7.5 (5.6H, с, 2NH₃ ⁺). Масс-спектр: [М⁺] 654.175.

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина 0.068 г (0.292 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0.043 г (0.321 ммоль) N-оксибензотриазола в 2 мл N,N-диметилформамида и при активном перемешивании охлажденный раствор 0.066 г (0,321 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 8 мл хлороформа. Смесь выдерживали 3 ч при охлаждении и 1 ч при комнатной температуре, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0.1 г (0.117 ммоль) дитетрадецил-N-(L-орнитил)-L-глутамат бистрифторацетата в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 12 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Полученную смесь растворяли 0.2 г в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 8 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Растворяли в хлороформе, выпавший осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали. Продукт дитетрадецил-N-(N,N-ди-(L-орнитил))-L-орнитил-L-глутамат бистрифторацетат (Orn)₂OrnGlu(C₁₄)₂ выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1), затем в системе (метанол-хлороформ, 2:1). Выход 14 мг (9.7%), R_f 0.68 (метанол-хлороформ, 2:1).

¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0.84 (6H, т, 2CH₃), 1.23 (44H, с, 22 CH₂), 1.36 (4H, м, 2CH₂), 1.52 (8H, м, 4CH₂), 1.67 (4H, м, 2βСН₂), 2.5 (2H, м, CH₂), 2.7 (2H, т, CH₂COOH), 1.92-1.98 (2H, м, СН₂СОО), 2.87 (4H, м, 2СН₂), 3.00 (2H, м, CH₂) 3.81 (2H, м, 2CH), 4.00 (4H, м, 2 OCH3), 4.25 (2H, м, 2CH), 7.8 (12H, с, 4NH₃ ⁺).

Масс-спектр: [М⁺] 882.627; [М⁺] 1338.705.

Пример 3.

Аналогично из 0.1 г (0.00065 моль) L-глутаминовой кислоты, 0.32 г (0.00146 моль) гексадецилового спирта, и 0.25 г (0.75 ммоль) Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина получали дигексадецил-N-(N,N-ди-(L-орнитил))-L-орнитил-L-глутамат бистрифторацетат (Orn)₂OrnGlu(C₁₆)₂. Выход 43 мг (17%), R_f 0.73 (метанол-хлороформ, 2:1). Масс-спектр: [М⁺] 896.122

Синтезированные соединения могут быть использованы для получения липосомальных водных дисперсий.

Полученные значения критической концентрации везикулообразования ККВ составляют 10^-5 М, что на порядок ниже, чем у прототипа - липодипептида (ККВ 10^-4).

С помощью лазерного анализатора размера частиц определен диаметр полученных везикул, который составлял для полученных липотетрапептидов от 80 до 100 нм в зависимости от структуры. Размер частиц для липодипептидов составлял от 200 нм до 1 мкм.

Эффективность трансфекции синтезированных липотетрапептидов в составе катионных липосом, исследованная на клетках линии НЕК293, на 3-5% выше, чем для липодипептидов.

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности, производным аминокислот и пептидов, принадлежащих к классу алифатических диэфиров, содержащих четыре аминокислотных остатка. Техническим результатом предлагаемого изобретения является синтез ряда новых алифатических производных тетрапептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей (Orn)₂OrnGlu и (Lys)₂LysGlu, а гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи C₈-C_16. Использование катионных векторов доставки с четырьмя аминокислотными остатками в полярном домене амфифила способствует уменьшению размера образуемых в воде агрегатов и увеличению эффективности трансфекции. 2 н.п. ф-лы, 3 пр.

n=7-15 m=3,4 k=3,4

1. Липотетрапептиды на основе диэфиров L-глутаминовой кислоты
,
где n=7-15
m=3,4
k=3,4.

2. Способ получения липотетрапептидов, охарактеризованных в п.1 формулы изобретения, включающий в себя следующие этапы: синтез этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты, защита аминогрупп L-орнитина и L-лизина, активация карбоксильных групп и образование пептидной связи между этими компонентами, удаление защитных групп с полученного дипептидного производного, активация карбоксильных групп и образование пептидной связи с получением производных тетрапептидов, удаление защитных групп с получением липотетрапептидов.