СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОДИПЕПТИДОВ Российский патент 2012 года по МПК C07K5/06 C07C229/24 C07C229/26 A61K38/05 

Изобретение относится к биоорганической химии и может быть использовано в технологии получения алифатических производных аминокислот и пептидов.

Ранее был предложен способ получения катионных липидов на основе L-аспарагиновой кислоты и L-лизина с различными по длине остатками высших жирных спиртов - C₁₂, C₁₄, C₁₆ и C₁₈ (H.S.Kim, J.Moon, K.S.Kim, M.M.Choi и др. Gene-transferring efficiencies of novel diamino cationic lipids with varied hydrocarbon chains // Bioconjugate Chem. 2004, v.15, p.1095-1101).

Стратегия синтеза включала в себя следующие стадии: получение этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-аспарагиновой кислоты, защита аминогрупп L-лизина, активация карбоксильной группы, образование пептидной связи между гидрофобным и гидрофильным компонентами и удаление защитных группировок.

Стадия этерификации N-карбобензилокси-L-аспарагиновой кислоты с соответствующими спиртами проводилась в присутствии n-толуолсульфокислоты в толуоле в условиях кипячения с азеотропной отгонкой воды с использованием насадки Дина-Старка в течение 16 ч. Далее следовала экстракция, промывка водой, сушка реакционной массы в органическом растворителе над безводным сульфатом магния, фильтрование осушителя, удаление растворителя в вакууме, хроматографическая очистка продукта на колонке с силикагелем и каталитическое гидрирование защитной Cbz группы с образованием целевых диэфиров L-аминокислоты.

Недостатком данного способа является длительное время реакции, сложное аппаратурное оформление процесса и трудоемкий метод выделения продукта.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получения липодипептидов на основе L-глутаминовой кислоты, при котором стадия этерификации L-аминокислоты проводится путем сплавления с соответствующим спиртом в присутствии n-толуолсульфокислоты в отсутствие растворителя толуола при температуре 130°C в течение 4-5 ч.

Для удаления из реакционной массы n-толуолсульфокислоты по окончании реакции проводится экстракция, промывка водой и кристаллизация продукта реакции (Ю.Л.Себякин, У.А.Буданова. pH-Чувствительные катионные липопептиды для создания транспортных систем медицинского назначения // Биоорган. Химия, 2006, т.32, №5, с.453-458; Себякин Ю.Л. и др. // Российские нанотехнологии, 2009, т.4, №5-6, с.149-156).

Техническим результатом изобретения является упрощение процесса на стадии этерификации.

Данный технический результат достигается получением этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты или L-глутамина, защитой аминогрупп L-орнитина, L-лизина или L-аргинина, активацией карбоксильных групп, образованием пептидной связи между гидрофобным и гидрофильным компонентами, удалением защитных группировок, при этом стадию этерификации проводят путем сплавления аминокислоты с соответствующим спиртом в присутствии сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме (вместо n-толуолсульфокислоты). При этом наблюдается снижение температуры проведения реакции до 120°C и времени реакции до 2 ч. Кроме того, происходит ликвидация операции удаления n-толуолсульфокислоты в ходе экстракции, при которой расходуется значительный объем органических растворителей (хлороформ, хлористый метилен), что значительно упрощает технологию получения алифатических эфиров L-аминокислот.

Примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1.

Диоктил-L-глутамат Glu(C₈)₂ (1). Смесь 1.5 г (10.2 ммоль) L-глутаминовой кислоты, 2.4 г (24.5 ммоль) октилового спирта и 3 г сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме КУ-2-8 нагревали на масляной бане при 120°C и интенсивном перемешивании в течение 2 ч. После окончания реакции реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, смолу отфильтровывали, остаток перекристаллизовывали из ацетона и промывали эфиром. Технический продукт растворяли в 100 мл хлороформа, промывали 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия (2×80 мл), водой до pH 7, сушили сульфатом натрия. Растворитель отгоняли в вакууме. Получали 5,2 г (78%) аморфного вещества, [α]_D ²⁰+8,5° (с 1, C₂H₅OH).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3600 (NH), 2904 (СН), 2810 (CH), 1740 (C=O), 1600, 1470 (CH), 1178, 1030, 715 (CH).

Boc₂-L-орнитин Boc₂Orn (2). К 0,5 г (2,97 ммоль) гидрохлорида L-орнитина добавляли раствор 1,62 г (8,9 ммоль) ди-трет-бутилоксипирокарбоната в 15 мл изопропилового спирта и раствор 0,82 г (5,9 ммоль) карбоната калия в 9 мл воды. Смесь перемешивали 3 ч при 40°С. Отгоняли органический растворитель в вакууме. Остаток разбавляли дистиллированной водой в 1,5 раза, насыщали хлоридом натрия, подкисляли 20%-ной лимонной кислотой до pH 3-4. Экстрагировали этилацетатом (2×15 мл), объединенные экстракты сушили сульфатом натрия. Выход продукта в виде бесцветной смолы 0,94 г (98%), [α]_D ²⁰+11° (с1, ДМФА).

ИК (вазелиновое масло, ν_max, см^-1): 3347 (NH), 2901 (CH), 1750 (C=O), 1658 (NHCO), 1600 (NHCO), 1420 (OH), 1390 (CH₃), 1300 (C-O), 1280 (C-O), 901, 935, 627 (CH).

¹H-ЯМР (ДМСО-D₆, δ, м.д.): 1.4 (с, 18 Н, CH₃), 2.5 (п, 2 Н, CH₂, 2.9 (к, 2 Н, CH₂), 3.2 (с, 2 Н, CH₂N), 4.3 (м, 1 Н, CH), 6.0 (д, 1 Н, NH), 6.8 (т, 1 Н, NH).

Найдено, %: C 54.31, H 8.62, N 8.39. C₁₅H₂₈N₂O₆. Вычислено, %: С 54.20, Н 8.49, N 8.43.

N-Оксисукцинимидный эфир Вос₂-L-орнитина (3). К охлажденному до -5°C раствору 0.2 г (0.4 ммоль) Boc₂Orn и 0.07 г (0.6 ммоль) N-гидроксисукцинимида в 2 мл THF добавляли при перемешивании раствор 0.096 г (0.46 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении и 2 ч при комнатной температуре, выпавший осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали, остаток перекристаллизовывали из этанола. Выход 0.22 г (98%), выход 96%, т.пл. 116-118°C.

Диоктил-N-(бис-Вос-L-орнитил)-L-глутамат Boc₂OrnGlu(C₈)₂ (4). К раствору соединения (3) 0.25 г (0.58 ммоль) в 4 мл THF добавляли 0.256 г (0.58 ммоль) глутамата (1). Смесь перемешивали при комнатной температуре 3 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной ТСХ. Выход аморфного вещества 0.180 г (60%), [α]_D ²⁰+16.5° (с 0.1, C₂H₅OH).

ИК (в пленке, ν_max, см^-1): 3996 (NH), 2914 (CH), 2900 (CH), 1741 (C=O), 1685 (C=O, амид I), 1644 (NH, амид II), 1500, 1460 (CH), 1374 (CH), 1200, 1100 (C-O).

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0.84 (6 Н, т, 2 CH₃), 1.23 (20 Н, с, 10 CH₃), 1.40 (18 Н, с, 2 C(CH₃)₃), 1.5-1.7 (4 Н, м, 2 βCH₂), 1.8-2.2 (4 Н, м, 2 αCH₂), 2.24 (4 Н, м, 2 CH₂), 2.5 (2 Н, т, CH₂COO), 3.8-4.2 (4 Н, м, 2OCH₂), 4.36 (2 Н, т, CH₂), 5.7 (1 Н, д, CONH).

Диоктил-N-(L-орнитил)глутамат бистрифторацетат OrnGlu(C₈)₂ (5). Растворяли 0.13 г соединения (4) в 0.3 мл безводной CF₃COOH. Раствор выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Продукт выделяли препаративной ТСХ. Выход 0.132 г (97%), [α]_D ²⁰+10.5° (с 0.1, C₂H₅OH).

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0.8 (6 Н, т, 2 CH₃), 1.2 (20 Н, с, 10 CH₂), 1.5-1.7 (4 Н, м, 2 βCH₂), 1.73 (4 Н, м, 2 αCH₂), 2.15 (2 Н, м, CH₂), 2.5 (2 Н, м, CH₂), 2.7 (2 Н, т, CH₂COOH), 4.4-4.9 (2 Н, м, 2 СН), 8.1 (5.5 Н, с, 2NH₃ ⁺).

ИК (в пленке, ν_max, см^-1): 3336 (NH), 2940 (CH), 2832 (CH), 1725 (C=O), 1660 (C=O, амид I), 1640 (NH, амид II), 1440 (CH), 1360 (CH), 1215 (CF), 1110 (C-O), 964, 820, 793, 714. Масс-спектр: [М]⁺ 486.23.

Найдено, %: C 50.52, H 7.51, N 5.76. C₃₀H₅₃F₆N₃O₉. Вычислено, %: С 50.48, Н 7.48, N 5.89.

Пример 2.

Дитетрадецил-L-глутамат Glu(C₁₄)₂ (6). Смесь 1 г (6.8 ммоль) L-глутаминовой кислоты, 4.1 г (15 ммоль) тетрадецилого спирта и 3 г сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме КУ-23 нагревали на масляной бане при 120°C и интенсивном перемешивании в течение 2 ч. После окончания реакции реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, смолу отфильтровывали, остаток перекристаллизовывали из эфира. Технический продукт растворяли в 100 мл хлороформа, промывали 5%-ным раствором гидрокарбоната калия (2×80 мл), водой до pH 7, сушили сульфатом натрия. Растворитель отгоняли в вакууме. Получали 4,58 г (83%) аморфного вещества.

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3450 (NH), 2926 (CH), 2810 (CH), 1736 (C=O), 1470 (CH), 1172, 1030, 715 (CH).

Следующие стадии проводили аналогично примеру 1.

Вос₂-L-лизин Boc₂Lys (7). Выход продукта в виде бесцветной смолы (99%), [α]_D ²⁰+2.3° (с 1, ДМФА).

ИК (вазелиновое масло, ν_max, см^-1): 3341 (NH), 2894 (CH), 1745 (C=O), 1660 (NHCO), 1612 (NHCO), 1420 (OH), 1390 (CH₃), 1270 (C-O), 1280 (C-O), 900, 935, 628 (CH).

¹Н-ЯМР (ДМСО-D₆, δ, м.д.): 1.4 (с, 18 Н, CH₃), 2.5 (п, 2 Н, CH₂), 2.9 (к, 2 Н, CH₂), 3.2 (с, 2 Н, CH₂N), 4.3 (м, 1 Н, СН), 6.0 (д, 1 Н, NH), 6.8 (т, 1 Н, NH).

Найдено, %: С 55.28, Н 8.71, N 8.11. C₁₅H₂₈N₂O₆. Вычислено, %: С 55.31, Н 8.73, N 8.09.

N-оксисукцинимидный эфир Вос₂-L-лизина (8), выход 86%, т.пл. 108-110°C.

Дитетрадецил-N-(бис-Вос-L-лизил)-L-глутамат Boc₂LysGlu(C₁₄)₂ (9). Продукт выделяли колоночной хроматографией. Выход (58%), т.пл. 35-36°C, [α]_D ²⁰+22° (с 0.1, C₂H₅OH).

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0.87 (6 Н, т, 2 CH₃), 1.25 (44 Н, с, 22 CH₂), 1.44 (18 Н, с, 2 C(CH₃)₃), 1.56 (4 Н, м, 2 βCH₂), 1.84 (2 Н, м, CH₂), 2,05 (4 Н, м, CH₂CH₂), 3.1 (4 Н, м, 2 αCH₂), 3.6 (2 Н, т, CH₂COO), 3.9-4.3 (2 Н, м, СН), 4.54 (2 Н, т, CH₂), 5.6 (1 Н, с, CONH), 6.8 (1 Н, с, CONH).

ИК (в пленке, ν_max, см^-1): 3321 (NH), 2896 (CH), 2870 (CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O, амид I), 1630 (NH, амид II), 1500, 1459 (CH), 1350 (CH), 1200, 1100 (C-O), 1039, 960.

Дитетрадецил-N-(L-лизил)глутамат бистрифторацетат LysGlu(C₁₄)₂ (10). Продукт выделяли препаративной ТСХ. Выход (73%), т.пл. 38°C, [α]_D ²⁰+10.5° (с 0.1, C₂H₅OH).

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0.8 (6 Н, т, 2 CH₃), 1.1 (44 Н, с, 26 CH₂), 1.6 (4 Н, м, 2 βCH₂), 1.75 (4 Н, м, 2 αCH₂), 2.15 (2 Н, м, CH₂), 2.5 (4 Н, м, CH₂), 2.7 (2 Н, т, CH₂COO), 4.1-4.4 (2 Н, м, СН).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3350 (NH), 2920 (CH), 2898 (CH), 1730 (C=O), 1690 (C=O, амид I), 1665 (NH, амид II), 1426 (СН), 1223 (CF), 1109 (C-O), 780, 650. Масс-спектр: [M]⁺ 881.7.

Найдено, (%): С 57.67, Н 8.88, N 4.72. C₄₃H₇₉F₆N₃O₉. Вычислено, (%): С 57.64, Н 8.89, N 4.69.

Пример 3.

Гексадециловый эфир L-глутамина (11). Смесь 1 г (10.3 ммоль) L-глутамина, 2.49 г (13.6 ммоль) гексадецилового спирта и 3 г сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме Dowex нагревали на масляной бане при 120°C и интенсивном перемешивании в течение 2 ч. После окончания реакции реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, смолу отфильтровывали, остаток перекристаллизовывали из эфира. Технический продукт растворяли в 100 мл хлороформа, промывали 5%-ным раствором гидрокарбоната калия (2×80 мл), водой до pH 7, сушили сульфатом натрия. Растворитель отгоняли в вакууме. Получали 1.76 г (71%) GlnC₁₆, т.пл. 33-35°C.

ИК-спектр (вазелиновое масло, ν_max, см^-1): 3370 (NH), 2920 (CH), 2898 (CH), 1730 (C=O), 1610 (C=O, I амидная полоса, NH, II амидная полоса), 1465 (CH), 1411 (CH), 1390 (CH), 1180 (C-O), 920, 860, 780, 713, 650 (CH).

Найдено, %: С 68.11; Н 11.49; N 7.52. C₂₁H₄₂N₂O₃. Вычислено, %: С 68.06; H 11.42; N 7.56.

Следующие стадии проводили аналогично примеру 1.

N^α-Вос-N^γ-(Boc)₂-L-аргинин Boc₃Arg (12). Выход защищенного L-аргинина (44%), [α]_D ²⁰+7,5° (с 0.1, C₂H₅OH).

ИК (вазелиновое масло, ν_max, см^-1): 3500 (NH), 1740 (COOH), 1650 (NH), 1600 (C=O), 1515, 1710.

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 1.4 (с, 9 Н, CH₃), 1.45 (с, 18 Н, CH₃), 1.5-2.0 (м, 4 Н, СН₂-СН₂), 3.8 (м, 3 Н, C^αH, CH₂N), 7.0 (д, 1 Н, NH), 9.2 (c, HN=CNH).

Найдено, %: С 53.02, Н 8.11, N 11.76. C₂₁H₃₈N₄O₈. Вычислено, %: С 53.15, H 8.07, N 11.81.

N-оксисукцинимидный эфир Boc₃-L-аргинина (13), выход (98%) соединения, т.пл. 64-66°C.

Гексадецил-N-(бис-Вос-L-аргинил)глутаминат Boc₃ArgGlnC₁₆ (14).

Выход (52%), [α]_D ²⁰+44° (с 0.1, C₂H₅OH).

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0.8 (3 Н, т, CH₃), 1.0 (24 Н, с, 12 CH₂), 1.42 (18 Н, с, 2 C(CH₃)₃), 1.6 (2 Н, м, βCH₂), 1.69 (2 Н, м, αCH₂), 2.14 (2 Н, м, CH₂), 2.49 (4 Н, м, 2 CH₂), 4.4-4.6 (2 Н, м, CH), 5.7 (1 Н, с, NH).

ИК (в пленке, ν_max, см^-1): 3325 (NH), 2903 (CH), 2890 (CH), 1740 (C=O), 1687 (C=O, амид I), 1635 (NH, амид II), 1599, 1515, 1460 (CH), 1377 (CH), 1280, 1160, 1108 (C-O), 1037, 950, 735.

Гексадецил-N-(L-аргинил)глутаминат бистрифторацетат ArgGlnC₁₆ (15). Выход (93%), [α]_D ²⁰+43° (с 0.1, C₂H₅OH).

¹Н-ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0.8 (3 Н, т, CH₃), 1.2 (26 Н, с, 13 CH₂), 1.55 (2 Н, м, βCH₂), 1.75 (6 Н, м, CH₂C=О, CH₂CH₂), 2.1 (2 Н, м, CH₂), 2.4 (2 Н, м, CH₂), 3.0 (2 Н, т, NCH₂), 4.3-4.6 (2 Н, м, 2 СН), 8.2 (3 Н, с, NH₃ ⁺).

ИК (в пленке, ν_max, см^-1): 3340 (NH), 2911 (CH), 2899 (CH), 1730 (C=O), 1670 (С=О, амид I), 1651 (NH, амид II), 1589, 1425 (CH), 1380 (CH), 1200 (CF), 1110 (C-O), 650. Масс-спектр: [M]⁺ 529.44.

Найдено, %: C 49.29, H 7.60, N 7.64. C₃₁H₅₇F₆N₆O₈. Вычислено, %: С 49.26, Н 7.60, N 11.12.

Синтезированные липодипептиды могут быть использованы для создания липосомальных систем доставки диагностических агентов, терапевтических средств и генетического материала в клетки-мишени.

Таким образом, сопоставляя известный способ и предлагаемый нами, видно, что использование сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме вместо n-толуолсульфокислоты позволяет значительно упростить способ получения целевых липодипептидов с различными по длине остатками высших жирных спиртов на стадии этерификации.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения липодипептидов на основе L-глутаминовой кислоты или L-глутамина и L-орнитина, L-лизина или L-аргинина. Получают этерифицированные остатками жирных спиртов производные L-глутаминовой кислоты или L-глутамина путем сплавления аминокислоты с соответствующим спиртом в присутствии сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме. Осуществляют защиту аминогрупп L-орнитина, L-лизина или L-аргинина, а затем активацию карбоксильных групп. Далее проводят реакцию между этерифицированными производными L-глутаминовой кислоты или L-глутамина и защищенными производными L-орнитина, L-лизина или L-аргинина с образованием липодипептидов. Затем удаляют защитные группировки. Изобретение способствует упрощению процесса на стадии этерификации, снижению температуры реакции до 120°C и времени проведения реакции до 2 ч. 3 пр.

Способ получения липодипептидов на основе L-глутаминовой кислоты или L-глутамина и L-орнитина, L-лизина или L-аргинина, включающий получение этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты или L-глутамина, защиту аминогрупп L-орнитина, L-лизина или L-аргинина, активацию карбоксильных групп, образование пептидной связи между гидрофобным и гидрофильным компонентами и удаление защитных группировок, отличающийся тем, что стадию этерификации проводят путем сплавления аминокислоты с соответствующим спиртом в присутствии сильнокислотной ионообменной смолы в H⁺-форме.