ЛИПОТРИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ ДИЭФИРОВ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C07K5/09 A61K38/06 A61K47/48 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к производным аминокислот и пептидов, принадлежащих к классу алифатических диэфиров, содержащих три аминокислотных остатка.

Липосомы активно привлекаются для доставки в клетки биологически активных соединений, диагностических веществ и генетического материала, не способных самостоятельно преодолевать клеточную мембрану (белки, нуклеиновые кислоты, противоопухолевые препараты и многие другие). Отличительными особенностями таких систем являются неиммуногенность, биодеградируемость и биосовместимость. Сконструированные на данный момент липосомальные формы лекарственных препаратов содержат в качестве основного компонента фосфатидилхолин - природный липид. Однако каждый клеточный тип отличается по мембранному составу, поэтому для разных клеточных линий в опытах in vitro необходимы различные липидные агрегаты, способные контактировать и сливаться непосредственно с плазматической клеточной мембраной или взаимодействовать с внутриклеточными мембранами. Использование алифатических производных аминокислот и пептидов может послужить альтернативой применения «традиционных» фосфатидилхолиновых липосом.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является ряд катионных липидов, содержащих тетрапептиды. Наличие четырех аминокислотных остатков в полярной части амфифила позволяет липотетрапептидам формировать в водной среде частицы с небольшим диаметром, эффективно компактезировать нуклеиновые кислоты и с высокой эффективностью трансфицировать эукариотические клетки [Себякин Ю.Л., Буданова У.А., Колоскова О.О. Заявка на патент РФ №2013116689, дата публ. 20.10.2014].

Данный вид полярной части молекулы приводит к тому, что наиболее вероятной формой структурной организации дисперсий на основе этих соединений являются не только мелкие липосомы, но и мицеллы, а также возможен смешанный состав. Подобные дисперсии не подходят для использования в качестве переносчиков биологически активных веществ, таких как, например, противоопухолевые препараты, ввиду невозможности достижения эффективной нагрузки транспортного средства.

Снижение количества аминокислотных остатков в полярном блоке амфифила по сравнению с липотетрапептидами позволяет увеличить диаметр формируемых в водной среде липосом и более эффективно встраивать в их внутренний объем биологически активные вещества, а также получать более устойчивые во времени дисперсии.

Предлагаемые в настоящем изобретении соединения ранее в литературе не описаны и аналогов не имеют.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является синтез ряда новых алифатических производных трипептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей OrnOrnGlu, LysLysGlu, OrnLysGlu, LysOrnGlu, а гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи С₈, С₁₀, С₁₆:

Для достижения указанного технического результата разработана схема получения липотрипептидов, включающая следующие этапы: синтез этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты, активация карбоксильных групп Fmoc-Lys(Boc) или Fmoc-Orn(Boc) и образование пептидной связи между этими компонентами, удаление Fmoc защитных групп с полученного дипептидного производного, активация карбоксильных групп Boc-Lys(Boc) или Вос(Orn)Вос и образование пептидной связи с получением производных трипептидов, удаление Boc защитных групп с получением липотрипептидов.

Реализация данного изобретения подтверждается примерами.

Пример 1.

Синтез дигексадецил-N-(N-L-лизил)-L-лизил-L-глутамата.

Смесь 2,0 г (0,0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 7,0 г (0,0292 моль) гексадецилового спирта и 3,1 г (0,0163 моль) n-толуолсульфокислоты нагревали на масляной бане при 130°C в течение 4 ч. После окончания реакции реакционную массу охлаждали до комнатной температуры и перекристаллизовывали из ацетона.

Для удаления тозильной группы 1,5 г соли растворяли в 50 мл хлороформа, промывали 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия (2×80 мл), водой до pH 7, сушили сульфатом натрия. Растворитель отгоняли в вакууме. Получали 1,1 г (73%) аморфного вещества, R_f=0,47 (толуол-ацетонитрил, 3:1).

ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3395 (NH₂), 2945 (C-H), 1725 (C=O), 1632 (NH₂), 1482 (CH₂), 1381 (CN), 1281 (CH₃), 1202 (C-O-C), 1126 (O-C-C), 753 (NH₂).

К раствору Fmoc-Lys(Boc) 0,941 г (2 ммоль) в 4 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) добавляли 0,271 г (2 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл ДМФА и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,412 г (2 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 4 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали.

К полученному раствору добавляли 0,795 г (1,3 ммоль) дигексадецил-L-глутамата в 4 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 5 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт очищали препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1 с предварительной отмывкой непрореагировавшего избытка Fmoc-Lys-(Boc) переосаждением из хлороформа. Выход дигексадецил-N-(Fmoc-L-лизил-Boc)-L-глутамата составил 0,965 г (71%), R_f=0,8 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0,88 (6Н, т, CH₃), 1,24 (~56H, м, CH₂), 1,57 (4Н, м, СООСН₂СН₂), 4,06 (2Н, т, CH₂ (Fmoc)), 4,11 (4Н, м, COOCH₂), 4,57 (1Н, м, СН (Glu)), 5,72 (1H, д, NH), 7,62 (8Н, м, CH (Fmoc)).

Растворяли 0,965 г (1,3 ммоль) полученного соединения в 2 мл 20% раствора пиперидина в ДМФА. Раствор выдерживали при комнатной температуре 20 мин. Продукт NH₂Lys(Boc)Glu(C₁₆)₂ выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). R_f=0,2 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

Масс-спектр [M]⁺: 824.

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-лизина 0,265 г (0,728 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0,96 г (0,728 ммоль) оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,150 г (0,728 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 4 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0.300 г (0.364 ммоль) NH₂Lys(Boc)Glu(C₁₆)₂ в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 10 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Полученное соединение 0,2 г растворяли в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт дигексадецил-N-L-лизил-N-L-лизил-L-глутамат тристрифторацетат LysLysGlu(C₁₆)₂ выделяли переосаждением из эфира. Выход 143 мг (46%), R_f=0,2 (хлороформ-метанол, 1:2).

¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0,89 (6 Н, т, 2 СН₃), 1,27 (~48 Н, с, 24 СН₂), 1,37 (2 Н, м, γСН₂), 1,55 (2 Н, м, δСН₂), 1,59 (4 Н, м, 2 СООСН₂СН₂), 1,6 (2 Н, м, δСН₂), 1,64 (2 Н, м, γСН₂), 1,73-1,76 (4 Н, м, 2 βСН₂), 1,95 (2 Н, м, СНСН₂), 2,46 (2 Н, м, СН₂СОО), 2,91-3,05 (4 Н, м, 2CH₂NH₂), 4,05-4,10 (4 Н, м, 2 СООСН₂), 4,29-4,41 (3 Н, м, СН), 4,76 (2Н, д, 2NH), 7,35 (6 Н, с, 3NH₃ ⁺).

Масс-спектр [М]⁺: 852.

Пример 2.

Синтез дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-лизил-L-глутамата.

Аналогично из 2,0 г (0.0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 7,0 г (0.0292 моль) гексадецилового спирта и 0.941 г (2 ммоль) Fmoc-Lys(Boc) получали NH₂Lys(Boc)Glu(C₁₆)₂. Масс-спектр [М]⁺: 824.

К раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина 0,216 г (0,68 ммоль) в 4 мл хлороформа добавляли 0,92 г (0,68 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,140 г (0,68 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 4 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0,280 г (0,34 ммоль) NH₂Lys(Boc)Glu(C₁₆)₂ в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 10 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Полученное соединение 0,2 г растворяли в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-лизил-L-глутамат тристрифторацетат OrnLysGlu(C₁₆)₂ выделяли переосаждением из эфира. Выход 151 мг (53%), R_f=0,18 (хлороформ-метанол, 1:2).

¹Н-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м. д.): 0,89 (6 Н, т, 2 СН₃), 1,27 (~48 Н, с, 24 СН₂), 1,33 (2 Н, м, γСН₂ (Lys)), 1,50 (2 Н, м, βCH₂ (Orn)), 1,55 (2 Н, м, δСН₂ (Lys)), 1,57 (2 Н, м, γСН₂ (Orn)), 1,76 (2 Н, м, βCH₂ (Lys)), 2,15 (2 Н, м, СНСН₂), 2,46 (2 Н, м, СН₂СОО), 2,92 (4 Н, м, 2CH₂NH₂), 4,05-4,10 (4 Н, м, 2 СООСН₂), 4,3-4,4 (3 Н, м, СН), 4,46 (2Н, д, 2NH), 7,58 (6 Н, с, 3NH₃ ⁺).

Масс-спектр [М]⁺: 838.

Пример 3.

Синтез дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-орнитил-L-глутамата.

Аналогично из 2,0 г (0,0136 моль) L-глутаминовой кислоты, 7,0 г (0,0292 моль) гексадецилового спирта получали Glu(C₁₆)₂. ИК-спектр (в пленке, ν_max, см^-1): 3395 (NH₂), 2945 (С-Н), 1725 (С=O), 1632 (NH₂), 1482 (СН₂), 1381 (CN), 1281 (СН₃), 1202 (С-О-С), 1126 (О-С-С), 753 (NH₂).

К раствору Fmoc-Orn(Boc) 0,534 г (1,174 ммоль) в 5 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) добавляли 0,159 г (1.174 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл ДМФА и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,242 г (1,174 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 2 мл хлороформа. Смесь выдерживали 1,5 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали.

К полученному раствору добавляли 0,350 г (0,587 ммоль) дигексадецил-L-глутамата в 5 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 7 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт очищали препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Выход дигексадецил-N-(Fmoc-L-орнитил-Boc)-L-глутамата составил 0,465 г (77%), R_f=0.7 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1).

¹H-ЯМР-спектр (DMSO-D6, δ, м.д.): 0,9 (6Н, т, CH₃), 1,25 (~48Н, м, CH₂), 1,5 (2H, м, δCH₂), 1,6 (4Н, м, COOCH₂CH₂), 1,76 (2H, м, βCH₂), 2,0 (1Н, с, СН (Fmoc)), 2,15 (2H, м, CHCH₂), 2,46 (2H, м, CH₂COO), 3,06 (2H, м, CH₂NH₂), 3,9 (2Н, т, CH₂ (Fmoc)), 4,10 (4Н, м, СООСН₂), 4,41 (1Н, м, СН (Glu)), 5,95 (1H, д, NH), 7,5-7,8 (8Н, м, 8CH (Fmoc)).

Растворяли 0,465 г (0,587 ммоль) полученного соединения в 1 мл 20% раствора пиперидина в ДМФА. Раствор выдерживали при комнатной температуре 20 мин. Продукт NH₂Orn(Boc)Glu(C₁₆)₂ выделяли препаративной ТСХ в системе (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1). R_f=0,23 (толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1)

Масс-спектр [M]⁺: 810.

Аналогично к раствору Nα,Nε-(ди-трет-бутилоксикарбонил)-L-орнитина 0,159 г (0,501 ммоль) в 2 мл хлороформа добавляли 0,68 г (0,501 ммоль) N-оксибензотриазола (НОВТ) в 2 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и при активном перемешивании охлажденный раствор 0,103 г (0,501 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 2 мл хлороформа. Смесь выдерживали 2 ч при охлаждении, выпавший осадок отфильтровывали. К полученному раствору добавляли 0,133 г (0,167 ммоль) NH₂Orn(Boc)Glu(C₁₆)₂ в 2 мл хлороформа. Смесь перемешивали при комнатной температуре 7 ч, растворитель отгоняли в вакууме. Продукт выделяли препаративной тонкослойной хроматографией в системе толуол-хлороформ-метилэтилкетон-изопропанол, 10:6:3:1. Полученное соединение 0,2 г растворяли в 1 мл хлороформа и 2 мл безводной трифторуксусной кислоте. Раствор выдерживали при комнатной температуре 5 ч. Растворитель отгоняли в вакууме. Продукт дигексадецил-N-L-орнитил-N-L-орнитил-L-глутамат тристрифторацетат OrnOrnGlu(C₁₆)₂ выделяли переосаждением из эфира. Выход 72 мг (52%), R_f=0,2 (хлороформ-метанол, 1:2).

Масс-спектр [М]⁺: 824.

Синтезированные соединения могут быть использованы для получения липосомальных водных дисперсий.

По данным фотонно-коррелляционной спектроскопии размер частиц на основе липотрипептидов (анализатор размера частиц серии LSTM 13320 (Beckman Coulter, USA)) составляет от 80 нм (в случае OrnOrnGlu(C₈)₂) до 100 нм (в случае LysLysGlu(C₁₆)₂).

Липосомы на основе синтезированных липотрипептидов проявляют высокую устойчивость при хранении. Стабильность липосомальных растворов во времени исследовали спектрофотометрически. Показано, что липосомы стабильны в течение 8 месяцев, при этом не наблюдалось заметных отклонений оптических свойств дисперсий.

Форма, размер и устойчивость частиц, формируемых липотрипептидами в водной среде, позволяют эффективно встраивать в них различные биологически активные вещества. Например, в липосомы на основе полученных амфифилов возможно введение противоопухолевого препарата доксорубицина в количестве 40% от массы липотрипептида, при этом процент включения активного компонента во внутренний объем составляет более 90%.

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к алифатическим производным трипептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей OrnOrnGlu, LysLysGlu, OrnLysGlu, LysOrnGlu, а гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи C₈-C₁₆, и способу их получения. Изобретение обеспечивает эффективное встраивание и перенос биологически активных веществ. 2 н.п. ф-лы, 3 пр.

1. Алифатические производные трипептидов, полярная часть которых состоит из аминокислотных последовательностей OrnOrnGlu, LysLysGlu, OrnLysGlu, LysOrnGlu, гидрофобная часть представлена остатками спиртов с длиной цепи С₈, С₁₀, C₁₆.

2. Способ получения липотрипептидов, охарактеризованных в п. 1, включающий следующие этапы: синтез этерифицированных остатками жирных спиртов производных L-глутаминовой кислоты, активация карбоксильных групп Fmoc-Lys(Boc) или Fmoc-Orn(Boc) и образование пептидной связи между этими компонентами, удаление Fmoc защитных групп с полученного дипептидного производного, активация карбоксильных групп Boc-Lys(Boc) или Вос(Orn)Вос и образование пептидной связи с получением производных трипептидов, удаление Boc защитных групп с получением липотрипептидов.