ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/409 C07D487/22 A61P35/00 

Изобретение относится к получению новой фармацевтически приемлемой светочувствительной композиции, содержащей 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорин и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин.

Фотосенсибилизаторы - класс веществ, производных порфиринов и родственных им гетероароматических структур, применяемых для методов фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики злокачественных опухолей, трофических язв и некоторых других патологий. При активации лазерным излучением фотосенсибилизатора, накопившегося в опухоли, в ее клетках развиваются фотохимические процессы, при которых молекула фотосенсибилизатора, поглотив квант света, переходит в возбужденное триплетное состояние, энергия которого способствует образованию молекулярного синглетного кислорода. Являясь мощным окислителем в клетке и околоклеточном пространстве, он выступает универсальным поражающим фактором как внутри патологической клетки, так и вне ее.

Основные требования к оптимальному фотосенсибилизатору:

1) низкая темновая и световая токсичность;

2) высокая селективность накопления в злокачественных тканях;

3) сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК-диапазоны);

4) высокий квантовый выход образования синглетного кислорода в условиях in vivo;

5) доступность получения или синтеза, а также однородный воспроизводимый химический состав;

6) растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях;

7) стабильность при световом воздействии и хранении.

Известны различные фотосенсибилизаторы - производные хлорина e₆, например РАДАХЛОРИН (патент РФ 2183956 от 27.06.2002 г.). Однако степень его чистоты недостаточна, что приводит к размыванию четкой границы между раковой опухолью и близкорасположенной здоровой тканью, снижая эффективность фотодинамической терапии.

Известны также ФОТОДИТАЗИН (патент РФ 2144538 от 20.01.1998 г.) и фотосенсибилизатор по патенту РФ 2276976, опубл. 2006 г. Однако их водные растворы неустойчивы из-за протекания радикальных процессов, приводящих к частичной деструкции и трансформации тетрапиррольного макроцикла, и обладают ограниченным сроком хранения даже при температуре 4-8°C.

Известны фотосенсибилизаторы - производные бактериохлорина, поглощающие свет в наиболее оптимальном диапазоне 740-820 нм, например фотосенсибилизаторы по Евразийскому патенту №002910, опубл. 2002 г., патенту РФ 2382787, опубл. 2010 г. Однако эти фотосенсибилизаторы тоже содержат лишь одно активное вещество.

Фотосенсибилизаторы на основе производных либо хлорина e₆, либо бактериохлорина вводят внутривенно, устанавливают по меньшей мере один пластиковый катетер в опухоль и проводят лазерное облучение через стенки катетера.

Однако при этом имеет место травматичность, предполагающая проведение общего анестезиологического пособия, а также недостаточная эффективность фотосенсибилизаторов, поскольку достигается лишь торможение роста опухоли.

Наиболее перспективными для практического использования считаются производные бактериохлорина.

Существуют два подхода к получению производных бактериохлорина:

1) направленная модификация природных бактериохлорофиллов. Однако наиболее доступный природный тетрагидропорфирин - бактериохлорофилл «а» склонен к окислению до соответствующих хлоринов и порфиринов, что существенно ограничивает их внедрение в клиническую практику. Высокая гидрофобность и связанная с ней низкая растворимость в полярных растворителях также осложняют практическое использование известных бактериохлоринов;

2) синтетический, включающий восстановление в различных порфиринах двойных связей в пиррольных кольцах. Так, известен способ получения 5,10,15,20-тетракис(1”-алкил-3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирин-тетра-n-толуолсульфоната алкилированием 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирина метил-п-толуолсульфонатом в нитрометане (Евразийский патент №002910 от 1998 г.).

Наиболее близким к изобретению является способ получения 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирин-тетра-n-толуолсульфоната (Дудкин С.В. «Синтез и некоторые свойства гидрированных производных тетраазапорфина и мезо-тетра(3-пиридил)порфина», канд. дисс. М.: 2012 г., с.129-131). Он заключается в последовательном проведении следующих операций:

- восстановление 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-порфина п-толуолсульфонилгидразидом в присутствии 30-35-кратного избытка поташа в пиридине при T=110°C;

- хроматографическое выделение 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирина, который может быть также назван тетракис-мезо-(3'-пиридил)бактериохлорин;

- N-метилирование тетракис-мезо-(3'-пиридил)бактериохлорина метил-п-толуолсульфонатом в нитрометане при кипении в течение 1 ч;

- охлаждение реакционной массы до комнатной температуры, разбавление бензолом до соотношения 1:1;

- фильтрование;

- промывка бензолом;

- сушка.

Целевой продукт - 5,10,15,20-тетракис-(N-метил-3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирин-тетра-п-толуолсульфонат. Это соединение может быть также названо 5,10,15,20-тетракис-(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин.

Однако выход целевого продукта невысок - 29%, и его эффективность при использовании в качестве фотосенсибилизатора невысока, так как он не обеспечивает снижение агрессии роста и метастазирования опухолей, не препятствует некротизации опухолевой ткани, не позволяет полностью и равномерно насыщать опухолевый объем и регионарные метастазы, не позволяет одновременно с лечением проводить и диагностику распространенности регионарного метастазирования.

Задачей изобретения является поиск способа получения фотосенсибилизатора с более высоким выходом, который был бы лишен вышеназванных недостатков.

Поставленная задача решена способом получения фотосенсибилизатора, который заключается в том, что 3-пиридилкарбоксальдегид конденсируют с пирролом в смеси пропионовая кислота - пропионовый ангидрид при их соотношении от 3-4 до 1-2 при кипении в течение 80-100 мин, продукт конденсации восстанавливают п-толуолсульфонилгидразидом в среде пиридина в присутствии карбоната калия при его 30-35-кратном избытке и 5-10% хинолина при T=85-95°C, в течение 4-5 часов, полученный продукт N-метилируют в диметилформамиде при кипении в течение 50-65 мин, осаждают бензолом, фильтруют и сушат.

Эта задача решена также фотосенсибилизатором, полученным этим способом.

При этом фотосенсибилизатор, полученный по заявленному способу, содержит 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорин в количестве 15-25% и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин в количестве 75-85%.

Структура этих соединений доказана электронным спектром поглощения в воде.

ЭСП λ_max, нм (ε.10^-3): 761(46,4); 655(7,1); 516(27,3); 417(118,9); 374(64,0).

Технический результат изобретения заключается в том, что:

- значительно повышается выход целевого продукта до 90-92%;

- полученный по этому способу фотосенсибилизатор позволяет:

- снизить темп роста и метастазирования опухолей;

на фиг. показан рост первичного узла опухоли карциномы легких Льюис у мышей BDF;

- препятствовать некротизации опухолевой ткани;

- поскольку фотосенсибилизатор хорошо растворим в воде, он может быть введен непосредственно в опухолевый объем и доступные метастатические очаги, поэтому появляется возможность создания концентрации препарата непосредственно в опухолевой ткани ~ в 1000 раз выше, чем при внутривенном введении, что безусловно повышает эффект лечения. Это контролируется оптическим прибором за счет добавления небольшого (5-7%) количества флуоресцирующих примесей;

- проводить одновременно с лечением и диагностику регионарного метастазирования.

К тому же получаемый фотосенсибилизатор работает в самом оптимальном диапазоне 760-762 нм, т.к. не рассеивается естественно окрашенными тканями (гемоглобин, миоглобин и др.), что безусловно повышает КПД излучения. У продукта отсутствует световая токсичность. Высокий процент выхода синглетного кислорода определяет ускорение начала реактивного изменения опухолевой ткани уже через несколько часов. Выход синглетного кислорода определяли, главным образом, путем сравнения со стандартом -тетракис-(п-сульфофенил)порфирином. В качестве источника возбуждающего света применяли осветительную часть флуориметра Perkin-Elmer MPF-44B. Ширина щели - 5 нм. Заявленный фотосенсибилизатор имеет квантовый выход ~ в 1,5 раза выше, что подтверждает, что он является более эффективным фотогенератором синглетного кислорода.

Сведения, подтверждающие возможность воспроизведения изобретения

Для реализации способа используют следующие вещества:

- 3-пиридилкарбоксальдегид - коммерческий продукт TCI EUROPE N.V.;

- пиррол - ТУ 6-09-07-242-84;

- пропионовая кислота - ТУТ CP 1150Н-63, хч;

- пропионовый ангидрид - ТУ 6-09-08-1176-77;

- оксид алюминия - ТУ 6-09-426-75;

- хлороформ - ТУ 263-44493179-01 с изм. №1, 2;

- метанол - ГОСТ 2222-95;

- п-толуолсульфонилгидразид - ТУ 6-09-10-541-76;

- пиридин - ГОСТ 13647-78 с изм. №1;

- поташ (карбонат калия) - ГОСТ 4221-76;

- оксид алюминия - ТУ 6-09-426-75;

- хлористый метилен - ТУ 2631-44493179-98 с изм. №1, 2, 3;

- гексан - ТУ 6-09-06-4521-77;

- метилтозилат (метиловый эфир п-толуолсульфокислоты) - ТУ 6-09-86-75;

- диметилформамид - ГОСТ 20289-74 с изм. №1, 2;

- бензол - ГОСТ 5955-75 с изм. №1, 2;

- аргон - ГОСТ 10157-79 с изм. №1, 2, 3, 4.

Пример 1.

а) получение 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)21H,23H-порфина.

При кипении к смеси 500 мл уксусной кислоты, 150 мл нитробензола и 27 мл (0,286 моль) уксусного ангидрида постепенно добавляют смесь 10 мл (0,144 моль) пиррола и 13,7 мл (0,144 моль) 3-пиридилкарбоксальдегида. Смесь кипятят 1,5 ч, затем охлаждают, отгоняют уксусную кислоту, разбавляют остаток водой, нитробензол отгоняют с водяным паром. Остаток отфильтровывают, осадок промывают водой и высушивают на воздухе. Затем остаток при перемешивании кипятят с метанолом, осадок отфильтровывают, промывают метанолом и высушивают. Выход 16,2 г. Осадок экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета до бесцветного вытека. Экстракт упаривают до 200 мл и отфильтровывают выпавший осадок. Раствор хроматографируют на оксиде алюминия II степени активности по Брокману. Элюат упаривают до минимального объема, осаждают метанолом, отфильтровывают порфирин, промывают метанолом и высушивают при 70°C. Выход - 5,6 г (25,1%).

Продукт идентифицирован по данным ЭСП и ЯМР-спектра.

5,10,15,20-тетракис-(3'-пиридил)21H,23H-порфин

Rf (силуфол): 0,92 (хл-ме, 5:1); 0,40 (бз-ме, 10:1)

ЭСП λ_max, нм. (е.10^-3): 647(3,4); 590(6,1); 550(7,6); 516(18,3); 419(439,3) хлороформ.

¹H ЯМР (вн.ст. ТМС) δ, м.д.: 9,50s (4H, 2'-H); 9,10dd (4H, 6'-H, ¹J=5,6Hz, ²J=1,4Hz); 8,56 d (4H, 4'-H, ¹J=5,6Hz); 7,81t (4н, 5'-H, ¹J=5,6Hz); -2,80bs (CDCl₃)

б) восстановление 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)21H,23H-порфина с получением смеси 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)хлорина и 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)бактериохлорина.

При нагревании и перемешивании к смеси 0,5 г (0,808 ммоль) 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)порфина (Мм - 618,704) и 3,7 г (26,8 ммоль) карбоната калия в 30 мл пиридина постепенно прибавляют раствор 5,0 г (26,8 ммоль) п-толуолсульфонилгидразида (Мм - 186,23) в 20 мл пиридина, затем реакционную массу выдерживают при Т=85-95°C, в течение 4-5 часов. Смесь выливают в 300 мл воды, центрифугируют, промывают водой и высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Состав смеси идентифицировали по данным ЭСП, количественный состав определяли по соотношению интенсивности полос в ЭСП.

ЭСП λ_max, нм, (ε.10^-3): 746(52,9); 654(7,5); 520(33,3); 418(78,0); 379(76,8); 356(62,1) (хлороформ).

5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)хлорин - 15-25% и 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)бактериохлорин - 75-85%.

в) N-метилирование для получения смеси 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорина и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорина.

408 мг (0,43 ммоль) 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирина растворяют в 20 мл ДМФА, добавляют 1,0 г (5,37 ммоль) метилтозилата (Мм - 186,23), нагревают до 110°C при перемешивании под аргоном 1 ч, охлаждают, добавляют 20 мл бензола, выдерживают 2 ч, осадок отфильтровывают, промывают бензолом и высушивают на воздухе. Выход 1,0 г (90,63%).

Полученный целевой продукт идентифицирован по данным ЭСП.

Пример использования заявленного фотосенсибилизатора при фотодинамической терапии.

Пациент О., 1951 г.р. В течение нескольких лет установлен диагноз: папиллярный рак (высоко дифференцированная форма опухоли) щитовидной железы с MTS в регионарный л/у шеи. От хирургического лечения отказался.

При первом сеансе фотодинамической терапии в опухолевую ткань размерами 3,2×3,5×3,7 см введено 50 мг (из расчета 1,2 мг на 1 г опухоли) заявленного фотосенсибилизатора и в регионарный метастаз в развилке сонной артерии размерами 3,0×1,7 см введено 30 мг препарата (из расчета 5 мг на 1 г опухоли) - исходя из понимания метастаза как более агрессивной ткани, т.е. аналогично признакам снижения дифференцировки. После 20 минут экспозиции проведен сеанс облучения в опухоли и метастазе ИК лазерным излучением длиной волны 760 нм в низкоинтенсивном режиме в течение 20 и 15 минут соответственно.

Через 7 дней проведен цитологический контроль. В опухолевой ткани имеются выраженные признаки реактивных клеточных изменений, резко снизился пул клеток с повышенной митотической активностью, определяются единичные комплексы первоначального строения опухоли. В цитологическом материале из метастаза в л/у - картина папиллярного рака. Проведен повторный сеанс ФДТ. Результат положительный.

В последующем цитологическом мониторинге нарастали явления апоптоза, реактивных изменений. В динамике клеточный состав из метастаза характеризовался как клетки кубического эпителия без признаков атипии, вплоть до полного отсутствия данных за патологическую ткань. При УЗИ в развилке сонной артерии имеется фрагмент банального л/у плоской формы размерами не более 0,5×0,3 см.

Таблица № Параметры способа Выход, % *Состав Хл/БХл, % Конденсация Восстановление N-метилирование *Соотношение ПК-ПА Время, τ, мин Избыток поташа, кратность Хинолин, % Температура, °C Время, τ, ч Время, τ, мин 1 3 80 30 5 85 4 50 91 15/85 2 4 90 35 7 85 4,5 50 90 20/80 3 3 100 33 7 90 4 60 90,63 17/83 4 3 90 30 10 95 5 65 92 25/75 5 4 90 35 10 95 5 65 92 21/79 *Примечание:
Пропионовая кислота - ПК
Пропионовый ангидрид - ПА
5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)хлорин - Хл
5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)бактериохлорин - БХл

Изобретение относится к получению новой светочувствительной композиции, пригодной для фотодинамической терапии рака. Заявлен способ получения фотосенсибилизатора, заключающийся в том, что 3-пиридилкарбоксальдегид конденсируют с пирролом в смеси пропионовая кислота - пропионовый ангидрид при их соотношении 3-4:1-2 при кипении в течение 80-100 мин. Продукт конденсации восстанавливают п-толуолсульфонилгидразидом в среде пиридина в присутствии карбоната калия при его 30-35-кратном избытке и 5-10% хинолина при температуре 85-95°C в течение 4-5 час. Затем полученный продукт N-метилируют в диметилформамиде при кипении в течение 50-65 мин, осаждают бензолом, фильтруют и сушат. Заявлен также фотосенсибилизатор, полученный по этому способу, который содержит 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорин в количестве 15-25% и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин в количестве 75-85%. Технический результат изобретений заключается в повышении выхода целевого продукта, снижении темпа роста и метастазирования опухолей, препятствии некротизации опухолевой ткани, в полном и равномерном насыщении опухолевой ткани препаратом. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ получения фотосенсибилизатора, заключающийся в том, что 3-пиридилкарбоксальдегид конденсируют с пирролом в смеси пропионовая кислота - пропионовый ангидрид при их соотношении 3-4:1-2 при кипении в течение 80-100 мин, продукт конденсации восстанавливают п-толуолсульфонилгидразидом в среде пиридина в присутствии карбоната калия при его 30-35-кратном избытке и 5-10% хинолина при температуре 85-95°C, в течение 4-5 часов, полученный продукт N-метилируют в диметилформамиде при кипении в течение 50-65 мин, осаждают бензолом, фильтруют и сушат.

2. Фотосенсибилизатор, полученный по п.1.

3. Фотосенсибилизатор по п.2, отличающийся тем, что он содержит 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорин в количестве 15-25% и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин в количестве 75-85%.