Штамм бактерий Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 - продуцент фунгистатических липопептидов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в защите растений от фитопатогенных микроскопических грибов, а также в качестве продуцента липопептидов сурфактина и фенгицина.

В настоящее время все более острой проблемой становится заболевания растений фитопатогенными микроскопическими грибами, наиболее вредоносными являются фузариозы надземных органов и корней растений. Грибами выделяются микотокины, которые неблагоприятно влияют не только на сами растения, но и на здоровье человека и животных, при потреблении. На данный момент наиболее распространенный метод борьбы с фитопатогенами остается применение химических фунгицидов, однако существенным их недостатком остается накопление компонентов в объектах природной среды и аккумуляция в сельскохозяйственной продукции, производимой на основе этих растений. Поэтому в последнее время все большее внимание привлекают биофунгициды, разработанные на основе микроорганизмов, которые обладают антагонистической активностью по отношению к патогенными грибам и ингибируют их рост.

Известны штаммы бактерий Bacillus pumilus BKM CR-333Д (Патент РФ №1817875, опубл. 20.05.1995) и Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474 (Патент РФ №2570624, опубл. 10.12.2015). Недостатком данных штаммов является недостаточная биологическая активность, которая проявляется в антагонизме к фитопатогенным грибам.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis М-22 (Патент РФ №2084152, опубл. 20.07.1997), является продуцентом биопестицида Гамаир, который подавляет рост и развитие грибной и бактериальной микрофлоры на растительных остатках и поверхности корнеплодов. Недостатком данного штамма является воздействия на возбудителей только овощных культур растений. Штамм Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 проявляю; антагонистическую активность на такие фитопатогенные грибы, как Fusarium oxysporum, Trichoderma harzianum с помощью биосинтеза липопептидов.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм бактерий продуцент сурфактина Bacillus subtilis 0017 (Патент РФ №2270858, опубл. 27.02.2006). Однако он может использоваться только для получения биогенного поверхностного-активного вещества - сурфактина.

Штамм Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 вырабатывает такие фунгистатические липопептиды, как сурфактина и фенгицин.

Технический результат настоящего изобретения - выделение нового штамма бактерий, который обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам и вырабатывает липопептиды (биосурфактанты) сурфактин и фенгицин, а также не воздействуют отрицательно на окружающую среду и снижают развитие резистентности патогенных организмов к фунгицидам.

Технический результат достигается предлагаемым штаммом Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20, выделенным из почвы чернозема выщелоченного агроценоза пшеницы в условиях Краснодарского края. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции Микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ B-3516D.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фигуре 1 представлена фотография - отражающее ингибирование воздушного и субстратного мицелия штаммами бактерий рода Bacillus; На фигуре 2 представлена фотография, представляющее собой антифунгальную активность штамма-антагониста ВКМ B-3516D, в отношении Trichoderma harzianum на картофельно-глюкозном агаре; На фигуре 3 представлена фотография, отражающая антифунгальную активность штамма-антагониста ВКМ B-3516D в отношении Pleurotus ostreatus на картофельно-глюкозном агаре; На фигуре 4 представлен график пиков молекул отражающий спектры липопептидов в ацетонитриле после экстракции из преципитата культуральной жидкости Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 на MALDI-TOF-MS, где A - 1022, 1036, 1044, 1058, 1060, 1074 - класс сурфактина, а Б - 1464, 1478, 1492, 1506 - класс фенгицина.

Заявленный штамм имеет следующие характеристики.

Культуральные и морфологические признаки

Клетки штамма Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20, в приложении представлено свидетельство о депонировании штамм бактерий, представляют собой палочки размером 0,8-0,9 мкм × 1,7-2 мкм, грамположительные, имеют перитрихиально расположенные жгутики, подвижные. Споры овальные, не превышающие размер клетки, расположены центрально.

Штамм бактерий выращивали на МПА, и картофельно-декстрозном агаре при температуре 28°С в течение 2-5 суток. На МПА колонии 6-7 мм в диаметре плотные, не правильной формы, белесоватые, матовые, край колонии волнистый, не ровный. На картофельно-декстрозном агаре колонии 5-10 мм в диаметре плотные, не правильной формы, матовые, молочно-белового цвета, край колонии волнистые, не ровные.

Физиологические признаки: штамм Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 является аэробной бактерией, обладает каталазной активностью, расщепляет крахмал, гликоген. Минимальная температура роста 10°С, максимальная температура роста 47°С, оптимальный диапазон 28-32°С, при значениях рН среды от 4,5 до 8,5 с оптимумом 7,0-7,5.

Состав среды для культивирования (г/л): кукурузный экстракт - 5,0, меласса свекловичная - 10, KH₂PO₄ - 0,25, MgSO4 * 7H₂O - 0,5, рН 6,8.

Чистая культура штамма Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 хранится в пробирках на скошенной агаризированной питательной среде (картофельно-клюкозный агар или сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов). Температура хранения +3-+8°С. Срок хранения 12 месяцев.

Более подробно сущность описанного изобретения раскрывается в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Проявление антагонистической активности по методу встречного роста.

Оценку фунгистатических свойств проводились in vitro на картофельно-декстрозном агаре (PDA medium) в чашках Петри методом встречного роста. Тест-культуры инокулировали на расстоянии 30 мм напротив друг друга и инкубировали при температуре 28°С в течение пяти суток. По истечении срока инкубации анализировали степень антагонизма по размеру зоны задержки роста (мм).

В ходе исследования для отбора потенциальных антагонистов, ингибирующих Fusarium oxysporum из почвы было выделено 50 изолятов, формирующих эндоспору, и морфологически соответствующих представителям рода Bacillus. Среди этих изолятов 6 штаммов проявили значимый фунгистатический эффект. Размер зоны задержки роста варьировал от 5 до 7 мм +/- 1. При этом наблюдали две формы фунгистатического эффекта. Штаммы 5-6 формировали зону задержки роста с ингибированием как воздушного, так и субстратного мицелия (фиг. 1). Штамм 5 отнесен к Bacillus Amyloliquefaciens, а штамм 6 к виду Bacillus subtilis subspecies subtilis. Далее штамм был определен как Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 и депонирован под номером ВКМ В-3516D

Пример 2. Другой способ определения фунгистатического эффекта пептидных метаболитов осуществляли луночным методом диффузии в агар. Для этого в центр чашки на поверхность картофельно-глюкозного агара инокулировали Trichoderma harzianum, на расстоянии 20 мм пробивали лунки (диаметр 5 мм), вносили 50 мкл образца, предварительно профильтрованного через стерильный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Инкубирование осуществляли при 25°С в течение пяти суток.

Для отбора потенциальных антагонистов, подавляющих Trichoderma harzianum, из почвы было выделено около 70 бактериальных штаммов, относящихся к роду Bacillus species. Среди этих изолятов штамм ВКМ В-3516D проявил наибольший антагонистический эффект по отношению к Trichoderma harzianum (фиг. 2) и не подавлял рост Pleurotus Ostreatus (фиг. 3).

Пример 3. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF-MS)

Раствор ацетонитрила после экстракции преципитата подвергали MALDI-TOF масс-спектрометрическому анализу с использованием масс-спектрометра ULTRAFlex2. Экстракт питательной среды без инокуляции использовали в качестве контроля. Масс-спектры получали на масс-спектрометре с азотным лазером 337 нм при частоте импульса до 20 Гц. Образец 0,5 мкл смешивали на мишени с аликвотой раствора 20%-ного ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты и 20 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты и высушивали на воздухе. Масс-спектрометры были записаны в диапазоне 600-2000 m/z. Для идентификации молекул массы пиков сравнивали с ранее опубликованными в литературе (Sarangi, 2009; Pyoung, 2010).

Анализ фунгицидных липопептидов. Осажденные из культуральной жидкости липопептиды после экстракции ацетонитрилом исследовали методом времяпролетной масс спектрометрии. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ раствора липопептидов в ацетонитриле выявил два кластера молекул, обнаруживаемых при m/z 1022, 1036, 1044, 1058, 1060, 1074 (класс сурфактина) и 1464, 1478, 1492, 1506 (класс фенгицина) (фиг. 4). Эти пики имели различия в 14 Da, означающее наличие гомологичных молекул, имеющих различную длину цепи жирных кислот (СН₂=14 Da). При этом не было выявлено пиков, соответствующих итурину.

MALDI-TOF спектр выявляет преобладание профиля фенгицина над профилем сурфактина примерно в два раза. Ранее другими авторами были представлены спектры данных липопептидов, профили которых имели обратные соотношения, т.е. сурфактин преобладал над фенгицином (Sujata, 2016.).

Заключение о пептидной природе данных веществ сделан на том основании, что они были выделены при осаждении аммонием сернокислым с последующей качественной реакцией на α-аминокислоты с нингидрином. Применимость нингидриновой реакции была установлена рядом исследователей (Khan, 1989; Friedman, 2004).

Для выделения липопептидов из культуральной жидкости нами был использован метод осаждение в насыщенном растворе сульфата аммония (Alajlani,2016).

При определении антифунгальной активности методом диффузии в агар пептидной фракции, полученной методом кислотного осаждения в качестве контроля использовали стерильную дистиллированную воду, в случае с солевым преципитатом - раствор сульфата аммония 1,6 М.

Источники принятые во внимание:

1. Pyoung K., Ryu J., Kim Y, Ch Y. Production of biosuractant lipopeptides iturin A, fengycin and surfactin a from bacillus subtilis CMB32 for control of Colletotrichum gloeosporioides. J. Microbiol. Biotechnol. 2010. 20(1), 138-145.

2. Sarangi N.P. Athukorala, W.G. Dilantha Fernando, and Khalid. Y. Rashid. Identification of antifungal antibiotics of Bacillus species isolated from different microhabitats using polymerase chain reaction and MALDI-TOF mass spectrometry. Can. J. Microbiol. 55: 1021-1032 (2009). doi:10.1139/W09-067.

3. Sujata S., Sanket J., Geetha S.J. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian journal of microbiology. 2016. V. 47, P. 955-964.

4. Khan A. A. Studies of the kinetics and mechanism of interaction of α-aminoacids with ninhydrin // J. Indian Chem. Soc. - 1989. - Vol. 66, №7. - P. 454-456.

5. Friedman A. Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences // J. Agric Food Chem. - 2004. Feb 11;52(3):385-406. doi: 10.1021/jf030490p.

6. Alajlani M., Shiekh A., Hasnain S., Brantner A. Purification of Bioactive Lipopeptides Produced by Bacillus subtilis Strain BIA //Chromatographia (2016) 79:1527-1532 DOI 10.1007/s10337-016-3164-3.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 - продуцент фунгистатических липопептидов, может быть использован для получения фунгицидного биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов и биосинтеза липопептидов, биосурфактантов сурфактина и фенгицина. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ B-3516D. 4 ил., 3 пр.

Штамм бактерий Bacillus subtilis subspecies subtilis krd-20 ВКМ B-3516D - продуцент фунгистатических липопептидов, для биосинтеза липопептидов - биосурфактантов сурфактина и фенгицина.