СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА-СЕЛЕНОЦИСТИНА Российский патент 2014 года по МПК A61K33/04 A61K31/198 A23L1/304 A23L1/305 C12P13/12 

Изобретение относится к области технологии получения биологически активных соединений, используемых при производстве биологически активных добавок к пище (БАД к пище), функциональных продуктов питания, кормовых добавок с целью профилактики селеновой недостаточности у человека и животных.

В связи с этим селенсодержащие препараты получают все большее распространение. Так в качестве микроэлемента селен вводят в различные витаминно-минеральные комплексы, например «Центрум» (Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. - М.: Астрафармсервис, 1997, с.654 - ближайший аналог для витаминно-минерального комплекса).

Известны различные функциональные продукты питания с селеном, например селеносодержащие водоросли (патент РФ №2096037, МКИ A61K 33/04. Способ получения селенсодержащего препарата биомассы спирулины / Тамбиев А.Х.; Кирикова Н.Н.; Мазо В.К.; Скальный А.В. - №96106889/13; заявл. 17.04.1996; опубл. 20.11.97, БИ 32), хлеб (патент РФ №2103874, МПК A21D 8/02. Способ производства хлеба/ Золотов П.А., Тутельян В.А. - №97106690/13; заявл. 06.05.1997; опубл. 10.02.1998), и дрожжи (патент РФ №2194523, A61K 35/78, A61K 31/295, A61K 31/315, A61K 35/72, A61K 9/48, A61P 25/00 A61K 35/78, A61K 31/295, A61K 31/315, A61K 35/72, A61K 9/48, A61P 25/00. Лечебно-профилактический комплекс/ Буряк Д.А. - №2002102753/14; заявл. 04.02.2002; опубл. 20.12.2002), патент РФ №2146874, A23L 1/30, A23J 1/18. Биологически активная добавка к пище на основе пищевых дрожжей/ Мазо В.К.; Чистяков А.В.; Данилина Л.Л.; Тутельян В.А.; Княжев В.А.; Гмошинский И.В.; Зорин С.Н. - №97122294/13; заявл. 30.12.1997; опубл. 27.03.2000).

Однако указанные продукты имеют ряд недостатков. Неорганические соединения селена, например селенит натрия, обладают высокой токсичностью и связанным с этим риском токсических передозировок, а недостатком селенсодержащих водорослей и дрожжей является широкая вариабельность количества поглощенного селена. Отсюда возникают трудности с точным дозированием препарата и мониторингом эффективности профилактики и лечения.

В патенте RU №2281007 (патент №2281007 RU, МПК A23L 1/30, A23L 1/305, A61K 31/095, A23L 1/29, A23K 1/16, A61K 33/04. Способ получения биологически активного вещества - селенопирана, селенопиран и продукты, его содержащие / Боряев Г.И., Блинохватов А.А., Вихрева В.А. - №2004135395/13; заявл. 06.12.2004, опубл. 10.08.2006 би. №22) описан способ синтеза 9-фенил-симметричного октагидроксантена.

Способ предусматривает приготовление суспензии 9-фенил-симметричного октагидроксантена в ледяной уксусной кислоте, которая затем в инертной атмосфере насыщается в течение 15 минут сначала хлористым водородом, а затем в течение 15 минут смесью газов селеноводорода и хлористого водорода, после этого пропускается в течение 2 часов селеноводород, оптимальная температура реакционной смеси составляет 20-50°C, а общий расход селеноводорода составляет 2,3-2,6 л, после растворения 9-фенил-симметричного октагидроксантена в реакционную смесь вносят уксусный ангидрид и в течение 30 минут насыщают селеноводородом, выпавший кристаллический осадок отфильтровывается и перекристаллизовывается из ацетона с фильтрацией горячего раствора через фильтр и получением селенопирана с выходом до 92-96%, чистотой не менее 99,2% и содержанием селена в целевом продукте 23,2-24,0%.

Полученный таким образом целевой продукт может применяться в качестве биологически активного соединения. Недостатками этого способа являются сложности получения газообразного селеноводорода и большой расход дорого уксусного ангидрида.

Известен способ получения селеноцистина, описанный в статье Chocat Р, Esaki N, Tanaka H, Soda K. Synthesis of 1-selenodjenkolate and its degradation with methionine γ-lyas. / Analytical Biochemistry 148, 485-489 (1985).

Сущность данного способа заключается в том, что приготавливается 1 молярный раствор диселенида натрия путем добавления 4,5 г элементарного селена к 25 мл дистиллированной воды в трехгорлой колбе, отдельно приготовляется раствор боргидгида натрия путем его растворения в 25 мл дистиллированной воды, и по каплям добавляется в техгорлую колбу с супензией элементарного селена до полного обесцвечивания раствора и дополнительно добавляется еще 4,5 г элементарного селена, β-хлор-l-аланин (26 ммоль), растворяется в 50 мл H₂O (pH 9,0) и добавляется по каплям в течение 2 ч к 60 мл 1М раствора диселенида натрия. Синтез проводится в струе газообразного азота N₂, при встряхивании. После 16 часов инкубации рН раствора снижается до 2 добавлением 6 н. HCl и еще добавляется 4 ммоль гидроксиламина (NH₂OH) для восстановления загрязняющего элементарного селена до H₂Se. Затем через раствор продувается газообразный N₂, a выходящие газы пропускаются через два последовательно соединенных насыщенных раствора ацетата свинца для улавливания H₂Se. Затем pH раствора доводится до 6,0-6,5 с помощью NaOH. После стояния раствора в течение 12 часов при 4°C, желтые кристаллы селеноцистина собираются (отфильтровываются). Селеноцистина образуется 2,71 г (8,1 ммоль), выход 62%, температура плавления 184-185°C (разложение).

Наиболее близкими к предлагаемому способу является способ получения селеноцистина из 1М раствора диселенида натрия и β-хлор-l-аланина, описанный в Selenocysteine in Native Chemical Ligation and Expressed Protein Ligation. Robert J. Hondal, Bradley L. Nilsson, and Ronald T. Raines. / J Am Chem Soc. 2001 May 30; 123(21): 5140-1.

Сущность данного способа заключается в том, что приготавливается 1М раствор диселенида натрия (Na₂Se₂) добавлением элементарного селена (4,5 г, 56 ммоль) в воду (25 мл) в закрытой трехгорлой колбе с магнитной мешалкой. 4,5 г (119 ммоль) боргидрида натрия растворяется в воде (25 мл), и раствор добавляется по каплям к суспензии элементарного селена до момента, когда раствор становится бесцветным, дополнительное количество элементарного селена (4,5 г, 56 ммоль) добавляется к раствору (раствор становится красновато-коричневым цветом, характерным для диселенида натрия) и продувается газ аргон (Ar), 5 г (31 ммоль) β-хлор-l-аланина растворяется в воде (40 мл) и pH полученного раствора доводят до 9,0 раствором NaOH, затем раствор добавляется по каплям в течение 30-60 мин к раствору Na₂Se₂ в трехгорлую колбу, перемешивается в атмосфере Ar (г) при 37°C в течение 12-16 часов, раствор подкисляется концентрированной соляной кислотой для быстрой остановки реакции, гидроксиламин (0,33 г, 9,7 ммоль) добавляется для восстановления остатков элементарного селена, соляная кислота добавляется до тех пор, пока не заканчивается бурная реакция с раствором, через полученный раствор продувается в течение 1 ч с Ar (газ), выходящий селенововодород улавливается насыщенным водным раствором ацетата свинца, раствор фильтруется, а pH доводят до 6-6,5 раствором гидроксида натрия. Осадок селеноцистина растворяется в небольшом объеме 2 н. HCl, темно-желтый раствор, фильтруется и pH раствора доводится до 6-6,5 путем добавления 10 молярного NaOH. Селеноцистин выделяется в виде ярко-желтого кристаллического твердого вещества с выходом 60% (4,1 г от исходных 5,0 г β-хлор-l-аланин).

Недостатком этого способа является большой расход высокоочищенных газов - азота или аргона. Кроме того, на этапе синтеза раствора диселенида натрия происходит выделение большого количества селеноводорода и, как следствие, повышенный расход дорогостоящего боргидрида натрия. Селеноводород, образующийся при добавлении соляной кислоты, улавливается раствором ацетата свинца, т.е. теряется.

Задачей предлагаемого изобретения является получение биологически активного вещества (БАВ) - селеноцистина, в результате более усовершенствоваго и эффективного способа его промышленного получения.

Учитывая недостатки способов получения соединений селена из предшествующего уровня техники, был разработан новый недорогой и эффективный способ синтеза селеноцистина.

Биологически активное вещество включает низкомолекулярное органическое селенсодержащее соединение - селеноаминокислоту, полученную путем химического синтеза. Полное название 3,3-диселено-бис-2-аминопропионовая кислота или селеноцистин с формулой.

Сущность способа получения биологически активного вещества - селеноцистина - состоит в том, что приготавливают 1 молярный раствор диселенида натрия (Na₂Se₂) путем добавления 4,5 г элементарного селена к 10 мл 1 молярного раствора гидроксида натрия (NaOH) в трехгорлой колбе. Добавляют 15 мл дистиллированной воды и размешивают с помощью магнитной мешалки. Отдельно приготовляют раствор боргидгида натрия (NaBH₄) путем его растворения в 25 мл дистиллированной воды, и по каплям добавлют в техгорлую колбу с суспензией элементарного селена до полного обесцвечивания раствора, и дополнительно добавляют еще 4,5 г элементарного селена. 5 г β-хлор-l-аланина растворяют в дистиллированной воде, и раствор доводят до pH 9 добавлением 1М раствора гидроксида натрия. В течение 30 минут полученный раствор β-хлор-l-аланина добавляют в раствор диселенида натрия, находящийся в трехгорлой колбе, и перемешивают в течение 12-16 часов при температуре +37°С, добавляют в полученный раствор по каплям хлорововдородную кислоту и доводят до рН 2. Осуществляют продувку воздухом в течение 2-3 часов. Раствор фильтруют и доводят 10 М раствором гидроксида натрия до pH 6-6,5. Раствор охлаждают до +5°C, с выходом кристаллов селеноцистина не менее 60%, чистотой не менее 97% и содержанием селена в целевом продукте не менее 47,2%.

Пример 1. Способ получения селеноцистина

Для приготовления 1 М раствора диселенида натрия (Na₂Se₂) к 4,5 г (56 ммоль) элементарного селена добавляют 10 мл 1 М раствора гидроксида натрия (NaOH), добавляют 15 мл дистиллированной воды и размешивают в трехгорлой колбе с помощью магнитной мешалки. Колба оборудована термометром, капельной воронкой объемом 50 мл и гидрозатвором. 4,5 г (119 ммоль) боргидгида натрия (NaBH₄) растворяют в 25 мл дистиллированной воды и по каплям добавляют в суспензию элементарного селена, до полного растворения селена и обесцвечивания раствора. После добавляют еще 4,5 г (56 ммоль) элементарного селена.

Отдельно растворяют в дистиллированной воде 5 г β-хлор-l-аланина и доводят pH9,0 раствором 1М NaOH. Затем в течение 30-60 минут раствор β-хлор-l-аланина добавляют в раствор диселенида натрия. Раствор перемешивается в течение 12-16 часов при температуре +37°C. Затем в раствор добавляют по каплям хлороводородную кислоту до рН 2 и продувают воздух в течение 2-3 часов для удаления остаточных количеств селеноводорода. Раствор фильтруют и доводят pH до 6-6,5 10 М раствором NaOH. Селеноцистин выпадает в виде желтых кристаллов после охлаждения раствора до +5-10°C с выходом 60% (4,1 г), чистотой не менее 97% и содержанием селена в целевом продукте 47,2%.

Создание щелочной среды позволяет связывать выделяющийся газообразный селеноводород, также при этом образуется необходимый для последующей реакции диселенид натрия. Кроме того, в ближайшем аналоге для создания инертной атмосферы, препятствующей окислению диселенида натрия, предлагается продувать через раствор газообразный азот или аргон. При этом требуются большой расход газов высокой чистоты. По сравнению с ближайшим аналогом усовершенствование способа состоит в том, что для создания инертной атмосферы используется только выделяющийся в небольшом избытке селеноводород, связывающий кислород в реакторе, и гидрозатвор, препятствующий попаданию атмосферного воздуха и окислению диселенида натрия. Элементарный селен, остающийся после проведения реакции, не восстанавливается гидроксиламином (NH₂OH) до летучего сленоводорода, а отфильтровывается и может использоваться повторно.

Новизна, промышленная применимость, неочевидность.

Таким образом, вышеизложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании в заявляемом изобретении следующей совокупности условий:

- новизна способа заключается в создании щелочной среды на этапе синтеза диселенида натрия, что позволяет оптимизировать условия прохождения реакции. Замена дорогостоящих высокоочищенных газов для создания инертной атмосферы - азота или аргона на гидрозатвор, который препятствует попаданию атмосферного воздуха в реакционный сосуд. Элементарный селен, остающийся после проведения реакции, отфильтровывается и может использоваться повторно;

- способ, выполняющий заявленное изобретение при его осуществлении, предназначен для производства биологически активных добавок к пище (БАД к пище), функциональных продуктов питания, кормовых добавок с целью профилактики селеновой недостаточности у человека и животных;

- для заявленного изобретения в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы, подтверждена возможность его осуществления с помощью вышеописанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов.

- совокупность таких признаков, как доступность, стабильность и широкий ассортимент исходных соединений, доступность и низкая стоимость реагентов; простота выделения (фильтрация), высокие выходы, стабильность и низкая токсичность целевых продуктов (селеноцистин), несложное аппаратное оформление процесса позволяет оценить разработанный метод как отвечающий требованиям промышленного производства.

Изобретение относится к способу получения биологически активного вещества - селеноцистина, используемого при производстве биологически активных добавок к пище, функциональных продуктов питания, кормовых добавок с целью профилактики селеновой недостаточности. Способ получения селеноцистина заключается в том, что готовят 1 молярный раствор диселенида натрия путем добавления 4,5 г элементарного селена к 10 мл 1 молярного раствора гидроксида натрия (NaOH) в трехгорлой колбе. Затем добавляют 15 мл дистиллированной воды и раствор размешивают с помощью магнитной мешалки. Отдельно приготовленный раствор боргидгида натрия (NaBH₄) путем его растворения в 25 мл дистиллированной воды по каплям добавляют в трехгорлую колбу с суспензией элементарного селена до полного обесцвечивания раствора и дополнительно добавляют еще 4,5 г элементарного селена. 5 г β-хлор-l-аланина растворяют в дистиллированной воде, и раствор доводят до рН 9 добавлением 1М раствора гидроксида натрия. В течение 30 мин раствор β-хлор-l-аланина добавляют в раствор диселенида натрия, находящийся в трехгорлой колбе, и перемешивают в течение 12-16 часов при температуре +37°C. Затем в полученный раствор добавляют по каплям хлорововдородную кислоту до pH 2 и осуществляют продувку воздухом в течение 2-3 часов. Раствор фильтруют и доводят 10 М раствором гидроксида натрия до pH 6-6,5. Раствор охлаждают до +5°C. Изобретение обеспечивает получение кристаллов селеноцистина с выходом не менее 60% чистотой не менее 97% и содержанием селена в целевом продукте не менее 47,2%. 1 пр.

Способ получения биологически активного вещества - селеноцистина, заключающийся в том, что приготавливают 1 молярный раствор диселенида натрия путем добавления 4,5 г элементарного селена к 10 мл 1 молярного раствора гидроксида натрия (NaOH) в трехгорлой колбе, затем добавляют 15 мл дистиллированной воды и размешивают с помощью магнитной мешалки, отдельно приготавливают раствор боргидгида натрия путем его растворения в 25 мл дистиллированной воды, и по каплям добавляют в трехгорлую колбу с суспензией элементарного селена до полного обесцвечивания раствора, и дополнительно добавляют еще 4,5 г элементарного селена, отдельно растворяют в дистиллированной воде 5 г β-хлор-l-аланина и раствор доводят до рН 9 добавлением 1М раствора гидроксида натрия, в течение 30 минут полученный раствор β-хлор-l-аланина добавляют в раствор диселенида натрия, находящийся в трехгорлой колбе, и перемешивают в течение 12-16 часов при температуре +37°С, добавляют в полученный раствор по каплям хлороводородную кислоту и доводят до рН 2 и осуществляют продувку воздухом в течение 2-3 часов, раствор фильтруют и доводят 10 М раствором гидроксида натрия до рН 6-6,5, затем раствор охлаждают до +5°С, с выходом кристаллов селеноцистина не менее 60% чистотой не менее 97% и содержанием селена в целевом продукте не менее 47,2%.