ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/15 G01N27/26 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к способам количественного определения бензойной кислоты, используемой в качестве консерванта в лекарственных препаратах и продуктах питания. Способ может быть также использован для количественного определения бензойной кислоты в исследованиях судмедэкспертизы.

Бензойная кислота - бактериостатик, она блокирует ферменты, тем самым замедляя обмен веществ в одноклеточных организмах. Она подавляет рост плесени, дрожжей и некоторых бактерий, которые могут попасть в лекарственные препараты, в продукты питания. Бензойная кислота хорошо всасывается, через коэнзим А связывается с аминокислотой глицином, образуя пшпуровую кислоту и в таком виде выводится через почки. Для человека считается безопасным потребление бензойной кислоты в количестве 5 мг/кг массы тела в день (Бензойная кислота [Электронный ресурс] // National Chemistry: интернет-журнал. - 2013. - №1. - Режим доступа: http://nationalscience.ru/post/148/).

Количественное определение бензойной кислоты при оценке безопасности лекарственных препаратов является актуальным.

Известен способ определения бензойной кислоты путем обработки анализируемой пробы раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте в течение 30 минут, разбавления реакционной смеси водой, охлаждения, обработки раствором гидроксида натрия, проведения экстракции изоамиловым спиртом, отделения экстракта, промывания его водой, проведения экстракции раствором гидроксида натрия, подкисления водно-щелочного извлечения хлороводородной и винной кислотами, обработки раствором хлорида титана (III) при температуре около 100°C в течение 15 минут, охлаждения до 5°C с последующей обработкой нитритом натрия при 0°C в течение 30 минут, прибавления мочевины и раствора дигидрохлорида 2(1-нафтил)-этилендиамина в хлороводородной кислоте, выдерживания реакционной смеси в течение 30 минут, разбавления водой и раствором хлороводородной кислоты и измерения через 1 час оптической плотности образующегося окрашенного раствора (Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. - М.: Химия, 1975, с.281, с.41). Способ характеризуется длительностью выполнения (продолжительность одного определения составляет более 3 часов) и недостаточно высокой селективностью (подобным образом помимо бензойной и 2-оксибензойной кислот определяются бензол и многие его алкил-, галоген-, нитро- и оксипроизводные). Определению мешает присутствие окрашенных соединений неорганической природы.

Известен фотометрический способ определения бензойной и 2-оксибензойной кислот в пробе, содержащей одну из этих кислот. Способ заключается в том, что пробу обрабатывают 10%-ным раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, разбавляют смесь водой, вводят гидроксид натрия до pH 3 и обрабатывают полученную смесь цветореагентом. В качестве цветореагента используют гексаметил-пара-розанилин-хлорид. Окрашенный продукт экстрагируют толуолом и фотометрируют. Способ характеризуется высокой селективностью и экспрессностью (патент РФ 2084871). Недостатком метода является то, что воспроизводимость результатов спектрофотометрического определения может характеризоваться как «средняя». Этому способствует большое число случайных погрешностей, возникающих при приготовлении анализируемых растворов - неполнота перевода определяемого компонента в фотометрируемое соединение, влияние посторонних компонентов, погрешностей контрольного опыта, наличие «кюветной» погрешности, погрешности установления нужной длины волны. Поэтому относительная погрешность спектрофотометрических методик составляет в среднем около 20-25% (хотя приборная погрешность фотометра не превышает 1-2%) (Методы анализа: [Электронный ресурс] // Техоборудование. Лабораторное оборудование. Режим доступа: http://techob.ru/metod analize/).

Известен способ определения бензойной кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Способ обращенно-фазового варианта ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) заключается в экстракции бензойной кислоты из исследуемого образца органическим растворителем и ее последующей перегонке с водяным паром. Пробоподготовка занимает 15-30 минут. Непосредственно хроматографический анализ проводят в ВЭЖХ-анализаторе, где в качестве неподвижной фазы используются гидрофобные силикагели с привитыми группами C₈, С₁₈, а в качестве подвижной фазы - смесь воды и полярного растворителя - ацетонитрила. Время анализа составляет 15-25 мин. Детектирование осуществляют фотометрически или спектрофотометрически при длине волны 214 нм (Столяров Б.В., Савинов И.М., Витенберг А.Г. Практическая газовая и жидкостная хроматография. - С-П.: Издательство С-П университета, 2002. - 616 с.). Данный метод характеризуется высокой эффективностью разделения компонентов и селективностью. Недостатки метода: необходимость использования сложного и дорогостоящего оборудования; различие в характеристиках удерживания и селективности сорбентов в зависимости от производителя и партии; ацетонитрил, использующийся в качестве растворителя, обладает токсичностью, высокой стоимостью, трудно регенерируется, т.к. образует с водой азеотропную смесь (Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая ВЭЖХ. - М.: Высшая школа, 1986. - 284 с.).

Известен метод кулонометрического титрования бензойной кислоты. Метод основан на генерации титранта на генераторном электроде в среде органических растворителей (изопропанол и м-крезол). В результате протекает электрохимическая реакция, где титрант стехиометрически реагирует с определяемым веществом. Определение проводят при постоянной силе тока. В основу метода заложен закон Фарадея. Относительная погрешность измерения составляет 15% (Агасян П.К., Хамракулов Т.К. Кулонометрический метод анализа. - М.: Химия, 984. - 168 с.). При определении бензойной кислоты в лекарственном препарате данным методом необходимо устранить возможность протекания конкурирующих реакций. Для осуществления способа необходима дорогостоящая и сложная аппаратура (Золотов Ю.А. Основы аналитической химии, Т2. - М.: Высшая школа, 2002. - 494 с.).

Сведения по количественному определению микроколичеств бензойной кислоты вольтамперометрическим методом отсутствуют.

Раскрытие изобретения

Целью изобретения является разработка способа количественного определения бензойной кислоты методом вольтамперометрии в лекарственных препаратах.

Предлагаемый вольтамперометрический способ количественного определения бензойной кислоты в лекарственных препаратах характеризуется тем, что в течение 90 с электрохимически концентрируют бензойную кислоту на поверхности графитового электрода при потенциале электролиза (-0,500) В на фоне 0,1 моль/л натрия гидрофосфата, затем регистрируют поляризационные кривые при линейной скорости развертки потенциала 25 мВ/с и по высоте пика в диапазоне потенциалов 0,5-1,6 В относительно хлорсеребряного электрода определяют концентрацию бензойной кислоты.

Определение бензойной кислоты проводят на вольтамперометрическом анализаторе ТА-4.

Способ вольтамперометрии характеризуется высокой чувствительностью (10^-6-10^-4 мг/л), селективностью, низкой стоимостью пробоподготовки и анализа (используется менее дорогой прибор в сравнении с хроматографом), экспрессностыо. Так одновременный анализ трех подготовленных проб занимает 5-30 мин.

Для электрохимического концентрирования бензойной кислоты на поверхности графитового электрода через раствор при перемешивании пропускают газообразный азот с содержанием кислорода менее 0,001% для удаления кислорода из электрохимической ячейки и, не прекращая подачи азота и перемешивания раствора, проводят электролиз раствора при потенциале (-0,500) В в течение 90 с. Азот подается на протяжении всего времени проведения анализа.

Все условия определения бензойной кислоты были подобраны экспериментально. Приготовление фоновых и стандартных растворов органического вещества в воде является общепринятым.

В процессе поиска оптимальных условий вольтамперометрического определения бензойной кислоты было изучено влияние ряда факторов (индикаторный электрод, фоновый электролит, его концентрация и pH, время и потенциал электролиза, скорость развертки потенциала) на высоту аналитического сигнала (табл.1-3).

В экспериментах были опробованы ртутно-пленочный и стекло-углеродный электроды, но бензойная кислота не адсорбировалась на их поверхности, что не позволяло получать аналитический сигнал. В качестве индикаторного электрода использовали графитовый из-за хорошей воспроизводимости сигнала и низкого остаточного тока. Бензойная кислота легко адсорбируется на рабочей поверхности электрода, что позволяет концентрировать ее на электроактивном электроде.

В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы хлорида калия, нитрата аммония, натрия и калия гидрофосфата. Исходя из полученных результатов, в качестве фонового электролита был выбран раствор натрия гидрофосфата, так как только он обеспечивал широкую рабочую область, хорошую электропроводность и необходимую площадь поляризационной кривой для обработки сигнала, был прост в приготовлении и имел продолжительный срок годности.

Оптимальная концентрация раствора натрия гидрофосфата составила 0,1 моль/л. В более концентрированных растворах не наблюдался прирост величины аналитического сигнала от добавки стандартного раствора бензойной кислоты при наличии большого остаточного тока, тогда как более разбавленный раствор был неустойчив во времени (не удавалось получать воспроизводимые результаты).

Значение pH фонового электролита составило 7,5-8,0. В сильнощелочной среде при подобранных условиях сигнал бензойной кислоты был выражен слабо, а в кислой - резко сужалась рабочая область и возрастала величина остаточного тока, при этом невозможно было зафиксировать пик бензойной кислоты. Результаты эксперимента показали, что оптимальным решением является электролиз без добавления дополнительных буферных растворов, что соответствует необходимым границам pH 7,5-8,0.

Оптимальное время накопления составило 90 с, при этом достигается максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности графитового электрода и хорошая воспроизводимость результатов количественного определения исследуемого вещества. При увеличении времени накопления более 90 с происходит насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал бензойной кислоты искажается и затрудняется обработка вольтамперограмм. При времени накопления менее 90 с величина тока растворения не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения исследуемого вещества (табл.1).

Оптимальный потенциал электролиза составил (-0,500) В. Смещение потенциала накопления в более положительную или в более отрицательную область приводило к уменьшению величины регистрируемого тока (табл.2).

Важным для определения бензойной кислоты методом вольтамперометрии является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной экспериментально установленной является скорость 25 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону увеличения или уменьшения заметно снижало высоту аналитического сигнала, что затрудняло обработку вольтамперных кривых (табл.3).

Пример 1. Определение бензойной кислоты методом вольтамперометрии в модельном растворе.

В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидрофосфата. При потенциале (-0,500) В раствор предварительно перемешивают газообразным азотом с содержанием кислорода не более 0,001% и, не прекращая перемешивания и пропускания азота через раствор, проводят электролиз при потенциале (-0,500) В в течение 90 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при линейной скорости развертки потенциала 25 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют 0,02 мл стандартного раствора бензойной кислоты в концентрации 100 мг/л, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование вещества при потенциале (-0,500) В в течение 90 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при линейной скорости развертки потенциала 25 мВ/с. Аналитический сигнал регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,5 В до 1,6 В.

Результаты количественного определения бензойной кислоты при различных ее концентрациях представлены в таблице 4.

Время единичного анализа не превышает 10 мин.

С целью проверки воспроизводимости результатов определения бензойной кислоты по разработанной методике поставили тест «введено - найдено» (табл.4) для пятидесяти проб с концентрацией бензойной кислоты около 1000; 128; 20; 1 и 0,1 мг/л, по десять проб для каждой концентрации.

Полученные результаты подвергли статистической обработке (табл.5).

Относительная ошибка разработанной методики не превысила 6,62%.

Пример 2. Определение бензойной кислоты методом вольтамперометрии в жидкой лекарственной форме (капли «Цетиризин»).

Эксперимент проводили по следующей схеме. В стеклянный стаканчик емкостью 20 мл помещали 10 мл фонового электролита (0,1М раствора натрия гидрофосфата), который помещали в анализатор ТА-4. В качестве рабочего электрода использовали графитовый, электродом сравнения служил хлорсеребряный. Затем в программе VALabTx из окна графического интерфейса открывали команду главного меню «Методика», где устанавливали параметры разработанной методики, важнейшие из которых потенциал (-0,500 В) и время накопления (90 сек). Для исключения влияния кислорода раствор деаэрировали азотом на протяжении всего процесса электролиза. Вольтамперограмму фиксировали при постоянно-токовой скорости развертки потенциала 25 мВ/с. Отсутствие пиков на вольтамперной кривой свидетельствовало о чистоте фона.

Затем в этот же стаканчик помещали 0,02 мл лекарственной формы, содержащей консервант бензойную кислоту в оптимальной концентрации для работы на приборе, которую получали методом последовательных разведений, и проводили электролиз в тех же условиях. Аналитический сигнал бензойной кислоты регистрировали как пробу в диапазоне потенциалов от 1,0 до 1,2 В.

В качестве внутреннего стандарта использовали такое же количество стандартного раствора бензойной кислоты соответствующей концентрации. Высоту суммарного сигнала фиксировали как пробу с добавкой.

Вышеописанным образом провели десять последовательных измерений и определили среднее значение концентрации бензойной кислоты в лекарственном препарате цетиризин, которое составило 2,104 мг/мл. Содержание бензойной кислоты, указанное в аннотации к данному препарату - 2 мг/мл. Ошибка измерения составила 5,2%.

Пример 3. Количественное определение бензойной кислоты в мягких лекарственных формах

Пробоподготовка

Гель «Виферон»: в стаканчик помещали 2,5 г геля, добавляли небольшое количество дистиллированной воды, затем переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили объем до метки этиловым спиртом. Так получали раствор с концентрацией бензойной кислоты 128 мг/л.

Гель «Азелик»: в стаканчик помещали 0,25 г геля, добавляли небольшое количество дистиллированной воды, затем переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили объем до метки этиловым спиртом. Так получали раствор с концентрацией бензойной кислоты 10 мг/л. Затем дозатором отбирали 1 мл полученного раствора и прибавляли 9 мл этилового спирта, получали раствор с концентрацией 1 мг/л.

Количественное определение проводили по следующей схеме: в стеклянный стаканчик емкостью 20 мл помещали 10 мл фонового электролита (0,1 М раствора натрия гидрофосфата), который помещали в анализатор ТА-4. В качестве рабочего электрода использовали графитовый, электродом сравнения служил хлорсеребряный. Затем в программе VALabTx устанавливали параметры разработанной методики, важнейшие из которых потенциал (-0,500 В) и время накопления (90 сек). Раствор деаэрировали азотом на протяжении всего процесса электролиза. Вольтамперограмму фиксировали при постоянно-токовой скорости развертки потенциала 25 мВ/с. Отсутствие пиков на вольтамперной кривой свидетельствовало о чистоте фона.

Затем в этот же стаканчик помещали 0,02 мл лекарственной формы, содержащей консервант бензойную кислоту в определенной концентрации, и проводили электролиз в тех же условиях. Аналитический сигнал бензойной кислоты регистрировали как пробу в диапазоне потенциалов от 1,0 до 1,2 В.

В качестве внутреннего стандарта использовали такое же количество стандартного раствора бензойной кислоты соответствующей концентрации. Высоту суммарного сигнала фиксировали как пробу с добавкой.

Таким путем провели десять последовательных измерений содержания бензойной кислоты для каждого лекарственного препарата и нашли его среднее значение. Результаты измерений представлены в таблице 6.

Установленные условия впервые позволили количественно определить бензойную кислоту путем регистрации вольтамперных кривых при потенциале (-0,500) В на фоне 0,1 моль/л натрия гидрофосфата.

Установленные экспериментальные условия определения бензойной кислоты методом вольтамперометрии позволяют с высокой чувствительностью (нижняя граница определяемых концентраций 10^-6 г/мл) и экспрессностью определить указанный консервант в лекарственных препаратах.

Таблица 1 Влияние времени электролиза на высоту аналитического сигнала № п/п Концентрация стандартного образца бензойной кислоты в электролитической ячейке, мг/л Время накопления, сек. Высота аналитического сигнала, нА 1   10 2,5±0,9 2   20 9,3±0,6 3   30 14,7±0,8 4   40 17,9±0,5 5   50 27,5±0,7 6   60 32,4±0,3 7   70 41,5±0,2 8 100 80 52,4±0,4 9   90 69,7±0,3 10   100 65,4±0,6 11   110 59,6±0,8 12   120 52,7±0,2 13   130 40,1±0,3 14   140 25,5±0,8 15   150 14,2±0,7 16   160 7,8±0,5 Примечание: потенциал электролиза - (-0,500) В; границы развертки потенциала от 0,5 до 1,6 В; скорость развертки потенциала - 25 мВ/с;

Таблица 2 Влияние потенциала электролиза на высоту аналитического сигнала № п/п Концентрация стандартного образца бензойной кислоты в электролитической ячейке, мг/л Потенциал накопления, В Высота аналитического сигнала, нА 1   -0,570 14,8±0,4 2   -0,560 23,4±0,6 3   -0,550 36,2±0,5 4   -0,540 43±0,6 5   -0,530 61,4±0,3 6   -0,520 68,2±0,1 7   -0,510 74,4±0,2 8 100 -0,500 77,7±0,5 9   -0,490 63,5±0,3 10   -0,480 55,2±0,6 11   -0,470 42,0±0,4 12   -0,460 28,8±0,3 13   -0,450 21,5±0,6 14   -0,440 19,8±0,4 15   -0,430 13,0±0,2 Примечание: время электролиза - 90 с; границы развертки потенциала от 0,5 до 1,6 В; скорость развертки потенциала - 25 мВ/с;

Таблица 3 Влияние скорости развертки потенциала на высоту аналитического сигнала № п/п Концентрация стандартного образца бензойной кислоты в электролитической ячейке, мг/л Скорость развертки, мВ/с Высота аналитического сигнала, нА 1   05 9,7±0,2 2   10 12,5±0,4 3   15 27,6±0,7 4   20 39,8±0,3 5   25 58,1±0,4 6   30 54,2±0,3 7 100 35 50,8±0,7 8   40 48,9±0,2 9   45 44,7±0,9 10   50 35,4±0,4 11   55 29,8±0,3 12   60 23,1±0,8 13   65 17,4±0,5 14   70 10,5±0,3 Примечание: время электролиза - 90 с; потенциал электролиза - (-0,500) В; границы развертки потенциала от 0,5 до 1,6 В;

Таблица 4 Результаты метода «введено-найдено» Введено, С мг/л Найдено, С мг/л 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1000 1030 1041 980 1039 971 1004 1000 979 1023 987 128 134 128 131 123 130 134 136 129 123 132 20 23,5 22,4 18,9 19,6 21 20 22,3 22 23 21,3 1 1,12 1,05 1,0 0,98 0,99 1,14 0,94 1,11 1,16 1,12 0,1 0,108 0,112 0,107 0,092 0,1 0,108 0,105 0,091 0,113 0,086

Таблица 6 Результаты количественного определения бензойной кислоты Лекарственный препарат Содержание консерванта (бензойная кислота), мг/мл (г) Отклонение, % по прописи фактическое Амброгексал 1 1,0054 0,54 Виферон 1,28 1,3 1,56 Цетиризин 2 2,104 5,2 Азелик 1 1,061 6,1 Кларотадин 1 1,022 2,2

Изобретение относится к области аналитической химии. Способ характеризуется тем, что электрохимически концентрируют бензойную кислоту на поверхности графитового электрода в течение 90 с при потенциале электролиза (-0,500) В на фоне 0,1 моль/л натрия гидрофосфата, затем регистрируют поляризационные кривые при линейной скорости развертки потенциала 25 мВ/с и по высоте пика в диапазоне потенциалов 0,5-1,6 В относительно хлорсеребряного электрода определяют концентрацию бензойной кислоты. Способ позволяет с высокой чувствительностью и экспрессностью определить бензойную кислоту в лекарственных препаратах. 3 пр., 6 табл.

Вольтамперометрический способ количественного определения бензойной кислоты в лекарственных препаратах, характеризующийся тем, что в течение 90 с электрохимически концентрируют бензойную кислоту на поверхности графитового электрода при потенциале электролиза (-0,500) B на фоне 0,1 моль/л натрия гидрофосфата, затем регистрируют поляризационные кривые при линейной скорости развертки потенциала 25 мВ/с и по высоте пика в диапазоне потенциалов 0,5-1,6 B относительно хлорсеребряного электрода определяют концентрацию бензойной кислоты.