Способ определения содержания бактерий в анализируемой среде с использованием наночастиц магнетита Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/06 C12N1/02 B82Y5/00 

Изобретение относится к бесферментному электрохимическому иммуноанализу, а именно, к определению содержания бактерий в пробах различного состава. Изобретение может быть использовано в медицине, фармакологии, экологии, пищевой промышленности, биотехнологии.

Изобретение создано для устранения недостатков широко применяемых в настоящее время лабораторных методов и сенсорных устройств для определения инфекционных агентов: длительность, многостадийность, трудоемкость процедур, дороговизна и низкая стабильность применяемых реагентов, высокие требования к квалификации персонала.

Предложен электрохимический способ определения бактерий Brettanomyces bruxellensis в образцах вина с использованием Fe₃O₄@SiO₂, функционализированных специфичными антителами [Disposable electrochemical biosensors for Brettanomyces bruxellensis and total yeast content in wine based on core-shell magnetic nanoparticles// Sensors and Actuators B: Chemical V. 279, 2019, P. 15-21]. В качестве аналитического сигнала использовали амперометрический отклик ферментативного восстановления перекиси водорода, регистрируемый на поверхности печатного углеродсодержащего электрода, а магнитные частицы применялись для разделения/концентрирования компонентов анализируемой пробы. К недостаткам способа относится нестабильность конъюгатов «антитело-фермент» и высокая стоимость ферементативных препаратов.

Описан бесферментный метод электрохимического иммуноанализа, в качестве метки в котором служили наночастицы Fe₃O₄ [Brainina, K.Z., Kozitsina, A.N., Glazyrina, Y.A. / Hybrid electrochemical/magnetic assay for Salmonella typhimurium detection // IEEE Sensors Journal Volume 10, Issue 11, 2010, №5483125, pp. 1699-1704]. В качестве аналитического сигнала авторы использовали максимальный ток электрохимического восстановления ионов Fe³⁺, полученных после растворения меченного наночастицами иммунокомплекса в смеси минеральных кислот. Длительность и многостадийность процедуры пробоподготовки ограничивает практическое применение разработки.

Предложен способ определения бактерий с использованием в качестве метки наночастиц магнетита, модифицированных электрохимически активными органическими соединениями: полипирролом, хинолинмодифицированным поливинилбензилхлоридом, ферроценмодифицированным оксидом кремния. По величине максимального тока окисления/восстановления органического покрытия производили количественное определение бактерий Е. coli [Патент РФ №2542487. Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матери А.И. «Способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий в анализируемой среде». Дата приоритета 15.07.2013]. Существенным недостатком предложенного метода является сложность и многостадийность протокола получения модифицированных наночастиц и низкая стабильность при длительном хранении.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ электрохимического иммуноанализа, включающий инкубацию бактерий с модифицированными магнитными наночастицами, магнитную сепарацию свободных наночастиц, образование иммунокомплекса на поверхности электрода и детектирование прямого электрохимического отклика от магнитной нанометки в органическом растворителе, интенсивность которого пропорциональна содержанию бактерий в исследуемой пробе [Патент РФ №2612143. Козицина А.Н., Свалова Т.С., Глазырина Ю.А., Матерн А.И. «Способ определения содержания бактерий с использованием в качестве метки модифицированных магнитных наночастиц». Дата приоритета 27.07.2015]. Недостатками метода являются необходимость переноса рабочего электрода из анализируемой среды в электрохимическую ячейку, смены растворителя на апротонный на стадии детектирования аналитического сигнала, а также длительность процедуры формирования иммунокомплекса в гетерогенных условиях и токсичность применяемых органических растворителей.

Предлагаемое техническое решение направлено на упрощение процедуры электрохимического иммуноанализа, сокращение временных затрат, отказ от использования дорогостоящих и высокотоксичных реагентов.

Предлагаемый способ определения содержания бактерий в анализируемой среде с использованием наночастиц магнетита включает конъюгирование бактерий с электрохимической меткой, в качестве которой используют магнитные наночастицы, образование иммунокомплекса в водной среде при температуре 37°С между определяемыми бактериями и известным количеством добавленных иммуноконъюгатов «антитело-наночастицы Fe₃O₄» и детектирование аналитического сигнала от наночастиц – тока электрохимического восстановления Fe₃O₄, величина которого обратно пропорциональна содержанию аналита в исследуемой пробе. Общая схема процедуры иммуноанализа приведена в приложении 1.

Прямой формат иммуноанализа, формирование иммунокомплекса в объеме анализируемой среды позволяет минимизировать число и продолжительность биохимических стадий, а детектирование прямого аналитического сигнала от наночастиц Fe₃O₄ в водной среде не требует применения высокотоксичных органических растворителей и пространственного разделения иммунологической и электрохимической реакций.

Способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Вытяжку из анализируемой пробы (проба молока) инкубируют с известным количеством иммуноконъюгатов «Fe₃O₄-антитела против Salmonella thyphimurium» в течение 5 минут при температуре 37°С. После инкубации в анализируемую среду помещают планарную трехэлектродную систему с рабочим платиновым электродом, к торцевой части которого прикреплен постоянный магнит (площадью 1 см² и напряженностью магнитного поля 31.83⋅10³ А/м) и выдерживают в течение 1 минуты. Далее в анализируемый раствор добавляют избыток минеральной кислоты для достижения рН≤2 (определяют с помощью индикаторной бумаги) и измеряют величину тока электрохимического восстановления наночастиц Fe₃O₄ в диапазоне потенциалов от +0,5 В до -0,1 В. Для проведения контрольного (холостого) эксперимента используют раствор, не содержащий компонентов бактериальной природы (физиологический раствор). В анализируемой пробе обнаружено 15 КОЕ/мл бактерий.

Пример 2

Вытяжку из анализируемой пробы (капустный рассол) инкубируют с известным количеством иммуноконъюгатов «Fe₃O₄-антитела против Escherichia coli» в течение 5 минут при температуре 37°С. После инкубации в анализируемую среду помещают планарную трехэлектродную систему с рабочим углеродсодержащим электродом, к торцевой части которого прикреплен постоянный магнит (площадью 1 см² и напряженностью магнитного поля 31.83⋅10³ А/м) и выдерживают в течение 1 минуты. Далее в анализируемый раствор добавляют избыток минеральной кислоты для достижения рН≤2 (определяют с помощью индикаторной бумаги) и измеряют величину тока электрохимического восстановления наночастиц Fe₃O₄ в диапазоне потенциалов от +0,5 В до -0,1 В. Для проведения контрольного (холостого) эксперимента используют раствор, не содержащий компонентов бактериальной природы (физиологический раствор). В анализируемой пробе обнаружено 2×10³ КОЕ/мл бактерий.

Пример 3

Вытяжку из анализируемой пробы (фекалии инфицированных животных) инкубируют с известным количеством иммуноконъюгатов «Fe₃O₄-Staphylococcus aureus» в течение 5 минут при температуре 37°С. После инкубации в анализируемую среду помещают планарную трехэлектродную систему с рабочим углеродсодержащим электродом, к торцевой части которого прикреплен постоянный магнит (площадью 1 см² и напряженностью магнитного поля 31.83⋅10³ А/м) и выдерживают в течение 1 минуты. Далее в анализируемый раствор добавляют избыток минеральной кислоты для достижения рН≤2 (определяют с помощью индикаторной бумаги) и измеряют величину тока электрохимического восстановления наночастиц Fe₃O₄ в диапазоне потенциалов от +0,5 В до -0,1 В. Для проведения контрольного (холостого) эксперимента используют раствор, не содержащий компонентов инфекционной природы (физиологический раствор). В анализируемой пробе обнаружено 5×10² КОЕ/мл.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения содержания бактерий в анализируемой среде с использованием наночастиц магнетита, включающий смешивание пробы анализируемой среды с предварительно синтезированным иммуноконъюгатом «Fe₃O₄-антитело», формирование иммунокомплекса в водной среде при 37°С, инкубирование в течение 5 мин с последующим воздействием постоянного магнита площадью 1 см² с напряженностью магнитного поля 31.83⋅10³ А/м в течение 1 минуты и добавлением избытка минеральной кислоты для достижения рН≤2. Содержание бактерий определяют по величине аналитического сигнала, в качестве которого используют электрохимический отклик восстановления наночастиц Fe₃O₄ в диапазоне потенциалов от +0,5 В до -0,1 В. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов определения содержания бактерий в пробах различного состава. 1 ил., 3 пр.

Способ определения содержания бактерий в анализируемой среде с использованием наночастиц магнетита, включающий конъюгирование бактерий с электрохимической меткой, в качестве которой используют магнитные наночастицы, образование иммунокомплекса в водной среде при температуре 37°С и определение содержания бактерий по величине аналитического сигнала, в качестве которого используют электрохимический отклик восстановления наночастиц, отличающийся тем, что формирование иммунокомплекса и измерение величины аналитического сигнала осуществляют в объеме анализируемой среды посредством смешивания пробы анализируемой среды с предварительно синтезированным иммуноконъюгатом «Fe₃O₄-антитело», инкубируют в течение 5 мин с последующим воздействием постоянного магнита площадью 1 см² с напряженностью магнитного поля 31.83⋅10³ А/м в течение 1 минуты и добавлением избытка минеральной кислоты кислоты для достижения рН≤2, затем измеряют величину тока электрохимического восстановления наночастиц Fe₃O₄ в диапазоне потенциалов от +0,5 В до -0,1 В.