СПОСОБ АНАЛИЗА И АНАЛИТИЧЕСКОЕ УСТРОЙСТВО Российский патент 2015 года по МПК G01N33/543 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу и аналитическому устройству для анализа жидких образцов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во многих анализах требуется одновременно измерять концентрацию двух или более аналитов в одном образце. Также это касается анализов на основе аффинности, таких как иммунологические анализы. Часто аналиты присутствуют в сильно различающихся концентрациях. Для анализов на основе аффинности проблема может заключаться в одновременном измерении концентраций различных аналитов, поскольку существует риск того, что сигнал, получаемый в результате измерения одного аналита, может насыщать или изменять сигнал, получаемый от другого аналита.

Насыщение может происходить в анализе на основе аффинности, который содержит средство связывания, например, когда все сайты связывания заняты. Насыщение также может происходить, когда насыщается измерительный преобразователь, такой как датчик, измеряющий флуоресценцию меченых молекул.

В известном уровне техники предпринимались попытки решить проблему измерения двух или более аналитов с сильно различающимися концентрациями в анализах на основе аффинности. Один подход заключается в разделении образца на несколько аликвот, которые разводят в различных концентрациях. Другой подход состоит в том, чтобы регулировать коэффициент усиления измерительного преобразователя, детектора или датчика в соответствии с различными концентрациями.

В US 7271009 раскрыты иммунологические анализы для нескольких биологических маркеров в образце, которые включают использование частиц. Каждая частица покрыта молекулами одного типа, участвующими в анализе на основе аффинности. Существует несколько типов частиц, покрытых молекулами одного типа. Чтобы разрешить ситуации, в которых концентрации различных аналитов различаются значительно, сигнал некоторых аналитов ослабляют с помощью разбавителя. В описании говорится, что разбавитель не участвует в специфическом связывании ни с одним аналитом. Разбавитель конкурирует за сайты, доступные на частице и уменьшает плотность покрытия аналитом. Таким образом, с помощью разбавителя уменьшается число связанных молекул аналита. Также описан вариант осуществления, в котором некоторые частицы покрыты средством, которое увеличивает чувствительность к конкретному аналиту.

В некоторых аналитических устройствах, отвечающих известному уровню техники, связывающее антитело или связывающая молекула связывает один или несколько аналитов. Связывание аналитов с сайтами связывания прерывается перед установлением равновесия, прежде чем все сайты связывания станут насыщенными, для того, чтобы сигнал не стал слишком сильным.

В некоторых случаях по меньшей мере на одном аналите, подлежащем определению, доступен только один связываемый эпитоп.

Несмотря на то, что используются способы, отвечающие известному уровню техники, существует возможность улучшений, касающихся того, что может потребоваться поэтапно разбавлять образец на несколько аликвот и/или что коэффициент усиления измерительного преобразователя, детектора и/или датчика должен быть отрегулирован в соответствии с различными уровнями концентрации. Также желательно иметь быстрый анализ с как можно меньшим количеством стадий, в котором, например, не нужно работать с частицами. Также желательно иметь анализ, при котором не нужно добавлять разбавитель. Также желательно иметь анализ, в котором можно измерять по меньшей мере один аналит только с одним эпитопом. Также желательно иметь анализ, который позволяет измерять концентрацию аналита только с одним эпитопом в смеси жидких образцов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить улучшенный способ и устройство для осуществления способа, который лишен по меньшей мере некоторых недостатков известного уровня техники.

Преимущества настоящего способа и устройства включают то, что не нужно делить образец на несколько разбавляемых по отдельности аликвот.

Другое преимущество состоит в том, что не нужно регулировать коэффициент усиления измерительного преобразователя, детектора и/или датчика для того, чтобы учитывать сильно различающиеся уровни концентраций.

Дополнительное преимущество состоит в том, что при анализе на основе аффинности не нужно добавлять разбавитель в связывающие молекулы. Также не нужно добавлять добавку, усиливающую аффинность.

Преимущества также включают то, что не нужно работать с частицами, что способ прост и легко осуществим, поскольку чтобы осуществить этот способ, нужно осуществить небольшое число стадий.

Другое преимущество состоит в том, что связывание молекул аналита со связывающими молекулами можно осуществлять до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Таким образом, не нужно останавливать связывание прежде чем будет достигнуто равновесие для того, чтобы не произошло насыщение всех связывающих сайтов. С этим связано преимущество, которое состоит в том, что нет необходимости останавливать связывание в точно определенное время. Таким образом, одно преимущество состоит в том, что, достигнув равновесия, можно добиться высокой точности. В способе, отвечающем известному уровню техники, сложно останавливать связывание каждый раз точно на той же стадии, поскольку сложно контролировать все параметры, влияющие на скорость связывания.

Дополнительное преимущество состоит в том, что можно измерять несколько аналитов, где по меньшей мере один аналит имеет только один эпитоп, с которым может связываться антитело.

Изготовление настоящего устройства является простым и экономичным. Простота также делает настоящий способ очень экономичным.

В первом аспекте предоставлен способ анализа по меньшей мере двух аналитов в жидком образце, указанный способ содержит стадии:

a) предоставление подложки, где по меньшей мере два различных типа связывающих молекул иммобилизовано на подложке и где каждый тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью к аналиту,

b) приведение образца в контакт с указанными связывающими молекулами,

c) по меньшей мере для одного аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченой обнаруживаемой молекулой со специфической аффинностью к аналиту, и по меньшей мере для одного другого аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченым вариантом аналита, и

d) измерение обнаруживаемого сигнала от меченой обнаруживаемой молекулы и меченого аналита на подложке, где концентрация меченого аналита подобрана в соответствии с концентрацией аналита в образце.

Во втором аспекте предоставлено устройство, приспособленное для осуществления настоящего способа.

Дополнительные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения определены в прилагающейся формуле изобретения, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Более подробно настоящее изобретение будет описано в последующем описании, примерах и прилагающихся рисунках, на которых

на фиг. 1 показана относительная интенсивность флуоресценции (ОИФ) в качестве функции положения в микроструйном канале,

на фиг. 2a и b показаны результаты анализа для NTproBNP и CRP соответственно,

на фиг. 3 показана относительная интенсивность флуоресценции (ОИФ) в качестве функции положения в другом микроструйном канале,

на фиг. 4 показаны результаты анализа для cTnI и CRP.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Прежде чем описывать настоящий способ и устройство, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными конфигурациями, стадиями способа и устройствами, описываемыми в настоящем документе, поскольку такие конфигурации, стадии и устройства могут в некоторой степени меняться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем документе терминология используется только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагающейся формулой изобретения и ее эквивалентами.

Таким образом, например, упоминание о реакционной смеси, содержащей «антитело» включает смесь из двух или более антител.

В описании и пунктах формулы настоящего изобретения будет использована следующая терминология, соответствующая определениям, приведенным в настоящем документе.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «приблизительно», когда он используется в отношении числовых значений, обозначает интервал точности, который хорошо известен и приемлем для профессионалов в данной области. Указанный интервал составляет ±10%.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «аналит» обозначает вещество, или химический, или биологический компонент, одно или несколько свойств которого определяются в ходе аналитической процедуры. Зачастую измерен может быть не сам аналит или компонент, а поддающееся измерению свойство аналита. Например, можно измерять концентрацию глюкозы.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «связывающая молекула» обозначает молекулу, способную связываться с молекулой аналита и захватывать ее.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «обнаружимая группа» обозначает любую компоновку из молекул или атомов, которую можно обнаружить, если она присутствует на подложке.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «обнаружимый сигнал» обозначает любой сигнал, который можно обнаружить, включая в качестве неограничивающих примеров электромагнитные волны, электрические сигналы, электрохимические сигналы, магнитные поля, радиационные сигналы и массовые метки.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «обнаруживаемая молекула» обозначает молекулу, способную к связыванию с аналитом и содержащую обнаружимую группу.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «меченый аналит» обозначает аналит, содержащий обнаружимую группу.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «меченая обнаруживаемая молекула» обозначает обнаруживаемую молекулу, содержащую обнаружимую группу.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «образец» обозначает смесь или раствор, который подлежит анализу.

Примеры образцов включают в качестве неограничивающих примеров кровь, плазму, сыворотку, пот, слюну, мочу, слезную жидкость, образцы воды и суспензии или растворы образцов крови.

При использовании на всем протяжении формулы изобретения и описания, термин «подложка» обозначает основу, к которой прикреплены молекулы, принимающие участие в анализе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В первом аспекте предоставлен способ анализа по меньшей мере двух аналитов в жидком образце, указанный способ содержит стадии:

a) предоставление подложки, где по меньшей мере два различных типа связывающих молекул иммобилизованы на подложке и где каждый тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью к аналиту,

b) приведение образца в контакт с указанными связывающими молекулами,

c) по меньшей мере для одного аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченой обнаруживаемой молекулой со специфической аффинностью к аналиту, и по меньшей мере для одного другого аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченым вариантом аналита, и

d) измерение обнаруживаемого сигнала от меченой обнаруживаемой молекулы и меченого аналита на подложке, где концентрация меченого аналита подобрана в соответствии с концентрацией аналита в образце.

Предоставлена подложка, на которой иммобилизованы связывающие молекулы. В одном из вариантов осуществления связывающие молекулы иммобилизованы в определенных участках. В одном из вариантов осуществления различные участки содержат иммобилизованные связывающие молекулы различных типов. Связывающие молекулы обладают аффинностью к аналиту, подлежащему анализу. В одном из вариантов осуществления каждый тип связывающих молекул обладает аффинностью по меньшей мере к одному аналиту, подлежащему анализу. В одном из вариантов осуществления для каждого аналита, подлежащего анализу, существует один тип связывающих молекул. В одном из вариантов осуществления один тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью к одному аналиту. В одном из вариантов осуществления существует два различных типа связывающих молекул. В одном из вариантов осуществления существует два различных типа связывающих молекул, иммобилизованных на двух определенных и раздельных участках на подложке. В альтернативном варианте осуществления различные типы связывающих молекул иммобилизованы на одном определенном участке. В одном из вариантов осуществления связывающие молекулы, иммобилизованные на одном участке, можно различить по типу обнаружимой группы, используемой в анализе. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере два различных типа связывающих молекул иммобилизованы по меньшей мере на двух различных участках на подложке.

В одном из вариантов осуществления предоставлена подложка, на которой иммобилизованы несколько типов связывающих молекул. В одном из вариантов осуществления каждый тип связывающих молекул иммобилизован по меньшей мере на одном определенном участке.

В одном из вариантов осуществления существуют участки, к которым прикреплены смеси более чем из одного типа различных связывающих молекул.

Примеры связывающих молекул включают в качестве неограничивающих примеров антитела, аптамеры, зонды из нуклеиновых кислот и фрагменты антител. Примеры зондов из нуклеиновых кислот включают в качестве неограничивающих примеров ДНК, РНК и ПНК. Примеры фрагментов антител включают в качестве неограничивающих примеров Fab и scFv. В одном из вариантов осуществления связывающими молекулами являются антитела. В другом варианте осуществления связывающая молекула представляет собой по меньшей мере одну молекулу, выбранную из антитела, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда, ПНК-зонда, фрагмента антитела, фрагмента Fab и фрагмента scFv. В дополнительном варианте осуществления каждая из указанных связывающих молекул независимо выбрана из группы, состоящей из антитела, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда, ПНК-зонда, фрагмента антитела, фрагмента Fab и фрагмента scFv.

Образец приводят в контакт со связывающими молекулами для того, чтобы аналиты в образце могли связываться со связывающими молекулами, к которым они обладают специфической аффинностью. В одном из вариантов осуществления образец приводят в контакт со связывающими молекулами путем добавления образца на подложку устройства. В одном из вариантов осуществления образец приводят в контакт с устройством. В одном из вариантов осуществления образец приводят в контакт со связывающими молекулами в течение периода времени, достаточно длительного для того, чтобы достичь равновесия в связывании молекул аналита со связывающими молекулами. Преимуществом является то, что реакция может протекать до состояния равновесия.

Когда образец приведен в контакт со связывающими молекулами, по меньшей мере два различных типа молекул контактируют со связывающими молекулами. Типы молекул, которые контактируют со связывающими молекулами, подобраны в соответствии с используемым аналитом и анализом. Добавлен по меньшей мере один тип меченых обнаруживаемых молекул. Обнаруживаемая молекула обладает специфической аффинностью к аналиту и содержит группу, которая позволяет ее обнаруживать любым способом. Кроме того, добавлен по меньшей мере один меченый аналит. Как альтернатива, или в дополнение к меченому аналиту, может быть добавлен меченый фрагмент аналита, который содержит эпитоп, способный связываться со связывающей молекулой. Меченый аналит представляет собой аналит, который содержит обнаружимую группу.

Примеры обнаружимых групп включают в качестве неограничивающих примеров флуорофоры, радиоизотопные метки, массовые метки, биолюминесцентные группы, хемолюминесцентные группы и электрохимические метки.

Для аналита, предположительно присутствующего в образце в низкой концентрации, добавлена меченая обнаруживаемая молекула.

Меченая обнаруживаемая молекула связывается с молекулами аналита, которые связаны со связывающей молекулой. Метки делают возможным обнаружение обнаруживаемых молекул. Обнаруженный сигнал является функцией концентрации аналита. Обнаруженный сигнал увеличивается с увеличением концентрации аналита. Это является сэндвич-анализом.

Для аналита, предположительно присутствующего в образце в высокой концентрации, в образец добавляют меченый аналит. Меченый аналит представляет собой аналит, который содержит обнаружимую группу. Альтернативно, или кроме того, можно добавлять аналог аналита. Меченый аналит конкурирует с аналитом за сайты связывания на связывающих молекулах. Количество меченого аналита подобрано в соответствии с концентрацией молекул аналита в образце. В свете данного описания профессионал в данной области может провести рутинные эксперименты с различными концентрациями меченого аналита при заданной концентрации молекул аналита в образце и, таким образом, определить подходящее количество меченого аналита. После добавления, количество связанного аналита (меченого и немеченого) приближается к равновесному значению. Соотношение связанного меченого аналита и немеченого аналита будет отражать соотношение этих частиц в образце. Обнаруженный сигнал является функцией концентрации аналита. Обнаруженный сигнал снижается с увеличением концентрации аналита. Это является конкурентным анализом.

Меченая обнаруживаемая молекула и меченый аналит в одном из вариантов осуществления добавляются на подложку одновременно. В альтернативном варианте осуществления они добавляются последовательно. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один меченый аналит добавлен сначала, а затем добавлена по меньшей мере одна меченая обнаруживаемая молекула. В альтернативном варианте осуществления по меньшей мере одна меченая обнаруживаемая молекула добавлена сначала, а затем добавлен по меньшей мере один меченый аналит.

В одном из вариантов осуществления меченая обнаруживаемая молекула и меченый аналит добавлены на подложку. В одном из вариантов осуществления меченая обнаруживаемая молекула предварительно распределена по подложке. В одном из вариантов осуществления меченый аналит предварительно распределен по подложке. В одном из вариантов осуществления меченая обнаруживаемая молекула и меченый аналит предварительно распределены по подложке. В одном из вариантов осуществления меченая обнаруживаемая молекула и/или меченый аналит предварительно распределены и меченая обнаруживаемая молекула и/или меченый аналит добавлены на подложку.

В одном из вариантов осуществления контакт между связывающими молекулами и меченым аналитом осуществлен сначала путем добавления меченого аналита к образцу, а затем путем приведения образца в контакт со связывающими молекулами. Таким образом, существует возможность смешивать образец по меньшей мере с одним аналитом, подлежащим анализу, и затем добавлять образец в устройство для того, чтобы привести образец, содержащий аналит, в контакт со связывающими молекулами.

В одном из вариантов осуществления стадии b) и c) осуществляются в рамках одной стадии.

В одном из вариантов осуществления предварительное распределение меченой обнаруживаемой молекулы или предварительное распределение меченого аналита выполнено путем нанесения вещества на подложку и сушки вещества для того, чтобы испарился растворитель. В одном из вариантов осуществления растворителем является вода. Таким образом, предварительно распределенное высохшее вещество оказывается на подложке. В одном из вариантов осуществления в растворитель добавляют по меньшей мере одно средство. Примеры таких добавок включают в качестве неограничивающих примеров БСА (бычий сывороточный альбумин) и трегалозу.

После добавления жидкого образца начинается растворение предварительно распределенного вещества/веществ. В одном из вариантов осуществления предварительно распределенное вещество/вещества в устройстве находятся выше по потоку по сравнению с иммобилизованными связывающими молекулами, и растворенное предварительно распределенное вещество/вещества может двигаться вниз по потоку и взаимодействовать в участках связывающих молекул.

В одном из вариантов осуществления устройство имеет временной интервал, который позволяет жидкому образцу вступить в контакт со связывающими молекулами и после некоторого периода времени предварительно распределенное вещество/вещества растворяется и может реагировать с аналитами и связывающими молекулами. Микроструйный переключать для остановки жидкости в течение некоторого интервала времени известен, например, из US 2004/0206408, который в прямой форме полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки.

В одном из вариантов осуществления устройство предназначено для использования для анализа концентрации первого и второго аналита в жидком образце. Первый аналит присутствует в низкой концентрации, а второй аналит присутствует в высокой концентрации. Ожидается, что первый аналит присутствует в низкой концентрации и его анализируют с использованием сэндвич-анализа. Ожидается, что второй аналит присутствует в высокой концентрации и его анализируют с использованием конкурентного анализа. На первом участке на подложке иммобилизованы связывающие молекулы со способностью специфически связываться с первым аналитом, а на втором участке на подложке иммобилизованы связывающие молекулы со способностью специфически связываться со вторым аналитом. Когда образец приведен в контакт со связывающими молекулами, добавляют меченую обнаруживаемую молекулу со способностью специфически связываться с первым аналитом. Также добавляют меченый вариант второго аналита. Меченые обнаруживаемые молекулы и меченый вариант аналита обнаруживают после некоторого периода времени.

Примеры обнаруживаемых молекул включают в качестве неограничивающих примеров антитела, фрагменты антител, Fab, scFv, аптамеры, зонды из нуклеиновых кислот, ДНК, РНК и ПНК. В одном из вариантов осуществления обнаруживаемые молекулы представляют собой антитела. В одном из вариантов осуществления обнаруживаемая молекула представляет собой по меньшей мере одну молекулу, выбранную из антитела, фрагмента антитела, фрагмента Fab, фрагмента scFv, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда и ПНК-зонда.

В одном из вариантов осуществления образец приводят в контакт со связывающими молекулами в течение периода времени, достаточно длительного для того, чтобы достичь равновесия в связывании молекул аналита со связывающими молекулами.

В одном из вариантов осуществления для выполнения анализа используется микроструйное устройство.

В одном из вариантов осуществления используется устройство, которое содержит по меньшей мере один канал. В одном из вариантов осуществления используется устройство, которое содержит по меньшей мере один канал с участками с иммобилизованными связывающими молекулами. В одном из вариантов осуществления такой канал дополнительно содержит предварительно распределенные меченые молекулы аналита и/или предварительно распределенные меченые обнаруживаемые молекулы. Образец добавляют в устройство и образец протекает по меньшей мере по одному каналу к связывающим молекулам и предварительно распределенным веществам.

В одном из вариантов осуществления подложка по меньшей мере частично покрыта выступами, которые расположены по существу вертикально относительно указанной поверхности и имеют такую высоту (H1), диаметр (D1) и взаимное расстояние (x1, y1), что достигается латеральное капиллярное течение указанного жидкого образца.

В одном из вариантов осуществления подложка содержит по меньшей мере одну зону добавления образца, по меньшей мере одну принимающую зону, способную вместить по меньшей мере часть образца, и по меньшей мере одну соединяющую зону, которая образует жидкостное соединение между зоной(ами) добавления образца и принимающей зоной(ами).

В одном из вариантов осуществления зона добавления образца, принимающая зона и зона, соединяющая зону добавления образца и принимающую зону, содержат выступы, которые расположены, по существу, вертикально относительно указанной поверхности и имеют такую высоту (H1), диаметр (D1) и взаимное расстояние (x1, y1), что достигается латеральное капиллярное течение указанного жидкого образца.

Во втором аспекте предоставлено аналитическое устройство, содержащее подложку, указанная подложка содержит по меньшей мере одну зону добавления образца, по меньшей мере одну принимающую зону, способную принять по меньшей мере часть образца, и по меньшей мере одну соединяющую зону, которая образует жидкостное соединение между зоной(ами) добавления образца и принимающей зоной(ами), указанные зоны по меньшей мере частично покрыты выступами, которые расположены, по существу, вертикально относительно указанной поверхности и имеют такую высоту (H1), диаметр (D1) и взаимное расстояние (x1, y1), что достигается латеральное капиллярное течение указанного жидкого образца, где указанная подложка содержит по меньшей мере два различных типа связывающих молекул, иммобилизованных на подложке, и где каждый тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью к аналиту.

В одном из вариантов осуществления подложка дополнительно содержит по меньшей мере одно предварительно распределенное вещество.

В одном из вариантов осуществления подложка содержит по меньшей мере одну предварительно распределенную меченую обнаруживаемую молекулу.

В одном из вариантов осуществления подложка содержит по меньшей мере один предварительно распределенный меченый аналит.

В одном из вариантов осуществления указанная подложка содержит предварительно распределенную меченую обнаруживаемую молекулу и предварительно распределенный меченый аналит.

В одном из вариантов осуществления указанная подложка содержит по меньшей мере одну предварительно распределенную меченую обнаруживаемую молекулу и по меньшей мере один предварительно распределенный меченый аналит.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Микроструйные чипы использовали в качестве подложек, которые были получены литьем термопласта под давлением (Zeonor 1060R, Zeon, Japan) и окислены в кислородной плазме. Окисление происходило в течение 6 мин в камере для плазменного травления (400 Plasma System) при рабочем давлении 0,26 мбар, 1000 Вт и при потоке кислорода 100 мл/мин. Чипы погружали в раствор 3% об. APTES (Fluka) в 95% этаноле (Kemetyl, Sweden) на 2 часа. Отвердевание проходило в течение ночи при комнатной температуре на воздухе, что сделало возможным образование поперечных связей из силана и дало стабильную функционализированную аминами поверхность. Затем поверхности с покрытием из APTES погружали в окисленный 2% раствор декстрана (Dextran T40 (40 kDa), Pharmacosmos, Denmark) на 2 часа, промывали в MilliQ-H₂O и дополнительно окисляли в 30 мМ NaIO₄ (Sigma Aldrich) в течение 2 часов.

Отлитые чипы имели одну зону добавления образца, в которую можно добавлять образец, одну принимающую зону, способную вместить по меньшей мере часть образца, и одну соединяющую зону, которая образует жидкостное соединение между принимающей зоной и зоной добавления образца. Соединяющая зона имела участки со связывающими антителами, сосредоточенные в средней части устройства. Зона добавления образца, принимающая зона и соединяющая зона имели выступы, которые были расположены вертикально относительно поверхности подложки и имели высоту 70 мкм, диаметр 90 мкм и расстояние 50 мкм с тем, чтобы при добавлении образца возникало латеральное капиллярное течение.

Устройство использовали для совместного двойного измерения c-реактивного белка (CRP) и NTproBNP. Клинически значимый диапазон концентраций для CRP в сыворотке составляет приблизительно 0,5-500 мкг/мл, тогда как для NTproBNP он составляет 10-10000 пг/мл, т.е. разница в концентрациях составляет более четырех порядков величины. Чтобы сделать возможным измерение аналитов при такой огромной разнице концентраций, CRP измеряли конкурентным способом, а NTproBNP сэндвич-способом.

Концентрации обоих аналитов определяли одновременно в одном жидком образце, для чего сначала иммобилизовали связывающие антитела для двух аналитов в соединяющей зоне в различных положениях. Связывающие антитела (моноклональные αCRP и αNTproBNP) наносили в виде пятен в два ряда вдоль жидкостного канала. Нанесенный раствор содержал 1% об. трегалозы (Sigma Aldrich), 50 мМ NaPO₄ (pH 7,5, Sigma Aldrich) буфер и 0,5 мг/мл связывающего антитела. Смесь наносили в виде пятен во влажной среде (относительная влажность 75%) с помощью Nano-plotter NP 2,1 (Ge-Sim, Germany) вдоль жидкостного канала, в результате чего получили полосу ~0,5×2 мм. Общий нанесенный объем для каждой полосы составил 5,25 нл.

Анализы осуществляли путем добавления 15 мкл раствора образца сыворотки, смешанного с Alexa 647 меченым CRP (250 нг/мл), на чип в зону для образца. Образец протекал через соединительный канал, таким образом, образуя контакт со связывающими антителами. Когда вся капелька образца перемещалась в массив выступов, в зону для образца добавляли 5 мкл меченого обнаруживаемого антитела Alexa 647 (20 мкг/мл в сыворотке, моноклональное αNTproBNP, направленное против другого эпитопа, нежели связывающее антитело). В конце, в качестве стадии отмывки, в зону для образца добавляли 15 мкл сыворотки. Интенсивность сигнала флуоресценции вдоль микроструйного соединительного канала регистрировали с использованием линейного флуоресцентного сканера с подсветкой, и были обнаружены отдельные пики в местах нанесения связывающих антител. На фиг. 1 показана относительная интенсивность флуоресценции (ОИФ) в качестве функции положения в микроструйном канале. Каждая линия обозначает сигнал флуоресценции, зарегистрированный на одном чипе. Вертикальные линии обозначают границы интегрирования. Для каждого анализа использовали новый чип.

Процедуру повторяли с образцами сыворотки от пяти пациентов с известными концентрациями NTproBNP и CRP, которые были установлены в центральной лаборатории в Uppsala University Hospital, Sweden. Пики в полученных профилях интенсивности интегрировали и наносили на график в виде функции от концентрации, измеренной в центральной лаборатории, см. фиг. 2a и 2b. Анализ NTproBNP показал прямую линейную зависимость сигнала от концентрации аналита (фиг. 2a), тогда как сигнал для CRP имеет обратную линейную зависимость от концентрации аналита (фиг. 2b). Самая высокая концентрация CRP (21 мкг/мл) более чем в 380000 раз превышает самую низкую концентрацию NTproBNP (55 пг/мл).

ПРИМЕР 2

Повторяли эксперимент из примера 1, но в этот раз анализировали сочетание кардиотропина I (cTnI) и CRP. Чипы и анализы подготавливали и осуществляли тем же способом, который описан в примере 1, с тем изменением, что использовали моноклональные αcTnI для связывания и обнаружения cTnI. CRP измеряли конкурентным способом, а cTnI измеряли сэндвич-способом. Образцы сыворотки получали путем spiking CRP-обедненной сыворотки с известными концентрациями CRP и cTnI. Подготавливали и анализировали пять образцов с постоянной концентрацией CRP (5 мкг/мл) и увеличивающейся концентрацией cTnI (0, 2, 10, 50, 250 нг/мл).

На фиг. 3 показана относительная интенсивность флуоресценции (ОИФ) в качестве функции положения в микроструйном канале. Интегрированные пики наносили на график в виде функции от концентрации, как описано в примере 1. Анализ cTnI показал прямую линейную зависимость от концентрации аналита (фиг. 4), тогда как сигнал CRP оставался постоянным. Сигнал CRP не изменялся под действием изменений в сигнале cTnI.

Несмотря на то, что изобретение было описано в отношении предпочтительных вариантов осуществления, которые составляют лучший вариант осуществления, известный изобретателям на данный момент, следует понимать, что различные изменения и модификации, очевидные для среднего специалиста в данной области, могут быть выполнены без отклонения от объема изобретения, который изложен в прилагающейся к этому документу формуле изобретения.

Группа изобретений относится к анализу жидких образцов. Представлен способ анализа по меньшей мере двух аналитов в жидком образце, указанный способ содержит стадии: a) предоставление подложки, где по меньшей мере два различных типа связывающих молекул иммобилизованы на подложке и где каждый тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью к аналиту, b) приведение образца в контакт с указанными связывающими молекулами, c) по меньшей мере для одного аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченой обнаруживаемой молекулой со специфической аффинностью к аналиту, и по меньшей мере для одного другого аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченым вариантом аналита, и d) измерение обнаружимого сигнала от меченой обнаруживаемой молекулы и меченого аналита на подложке, где концентрация меченого аналита подобрана в соответствии с концентрацией аналита в образце. Также представлено аналитическое устройство. Достигается упрощение и повышение надежности анализа. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ анализа, по меньшей мере, двух аналитов в жидком образце, где указанный способ включает в себя стадии:
a) предоставление аналитического устройства, которое содержит подложку, где, по меньшей мере, два различных типа связывающих молекул иммобилизованы на подложке и где каждый тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью связывания в отношении аналита,
b) осуществление контакта жидкого образца с указанными связывающими молекулами, где образец приводят в контакт со связывающими молекулами в течение периода времени, достаточно длительного для того, чтобы достичь равновесия в связывании молекул аналита со связывающими молекулами,
c) по меньшей мере, для одного аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между молекулами аналита, которые связаны или будут связаны со связывающими молекулами, и меченой обнаруживаемой молекулой со специфической аффинностью связывания в отношении аналита, и, по меньшей мере, для одного другого аналита, подлежащего анализу: осуществление контакта между связывающими молекулами и меченым вариантом аналита, и
d) измерение обнаруживаемого сигнала i) от меченых обнаруживаемых молекул, которые связаны с молекулами аналита, связаными со связывающими молекулами, которые связаны с подложкой, и ii) от меченого аналита на подложке, где концентрация меченого аналита подобрана в соответствии с концентрацией немеченого аналита в образце.

2. Способ по п.1, где каждая из указанных связывающих молекул независимо выбрана из группы, состоящей из антитела, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда, ПНК-зонда, фрагмента антитела, фрагмента Fab и фрагмента scFv.

3. Способ по п.1, где указанные связывающие молекулы являются антителами.

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанная обнаруживаемая молекула представляет собой, по меньшей мере, одну молекулу, выбранную из антитела, фрагмента антитела, фрагмента Fab, фрагмента scFv, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда и ПНК-зонда.

5. Способ по любому из пп.1-3, где указанные обнаруживаемые молекулы являются антителами.

6. Способ по любому из пп.1-3, где указанный контакт между связывающими молекулами и меченой обнаруживаемой молекулой осуществляется путем добавления меченой обнаруживаемой молекулы в устройство.

7. Способ по любому из пп.1-3, где указанный контакт между связывающими молекулами и меченой обнаруживаемой молекулой осуществляется путем растворения вещества, предварительно распределенного на устройстве.

8. Способ по любому из пп.1-3, где указанный контакт между связывающими молекулами и меченым аналитом осуществляется путем добавления меченого аналита на устройство.

9. Способ по любому из пп.1-3, где указанный контакт между связывающими молекулами и меченым аналитом осуществляется путем сначала добавления меченого аналита к образцу и затем - приведения образца в контакт со связывающими молекулами.

10. Способ по любому из пп.1-3, где указанный контакт между связывающими молекулами и меченым аналитом осуществляется путем растворения вещества, предварительно распределенного на устройстве.

11. Способ по любому из пп.1-3, где указанная подложка, по меньшей мере, частично имеет выступы, расположенные, по существу, вертикально относительно указанной поверхности, причем указанные выступы имеют такую высоту (H1), диаметр (D1) и взаимное расстояние (x1, y1), так что достигается латеральное капиллярное течение указанного жидкого образца.

12. Способ по любому из пп.1-3, где указанная подложка содержит, по меньшей мере, одну зону добавления образца, по меньшей мере, одну принимающую зону, способную вместить, по меньшей мере, часть образца, и, по меньшей мере, одну соединяющую зону, образующую жидкостное соединение между зоной(ами) добавления образца и принимающей зоной(ами).

13. Способ по любому из пп.1-3, где указанные, по меньшей мере, два различных типа связывающих молекул иммобилизованы, по меньшей мере, на двух различных участках на подложке.

14. Аналитическое устройство, которое содержит подложку, где указанная подложка содержит, по меньшей мере, одну зону добавления образца, по меньшей мере, одну принимающую зону, способную вместить, по меньшей мере, часть образца, и, по меньшей мере, одну соединяющую зону, которая образует жидкостное соединение между зоной(ами) добавления образца и принимающей зоной(ами), причем указанные зоны, по меньшей мере, частично покрыты выступами, которые расположены, по существу, вертикально относительно указанной поверхности, причем указанные выступы имеют такие высоту (H1), диаметр (D1) и взаимное расстояние (x1, y1), что достигается латеральное капиллярное течение указанного жидкого образца, где указанная подложка содержит, по меньшей мере, два различных типа связывающих молекул, иммобилизованных на подложке, и где каждый тип связывающих молекул обладает специфической аффинностью связывания в отношении аналита, и где указанная подложка дополнительно содержит предварительно распределенную меченую обнаруживаемую молекулу и предварительно распределенный меченый аналит, концентрация которого подобрана в соответствии с концентрацией аналита в образце.