АНАЛИТИЧЕСКОЕ УСТРОЙСТВО КАПИЛЛЯРНОГО ДЕЙСТВИЯ И ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 A61B5/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу гидрофилизации поверхности и иммобилизации антител на поверхности сополимера циклоолефина, в частности в аналитическом устройстве с капиллярным действием.

Уровень техники

Проведение биохимических реакций, включающих твердую фазу, зависит от химических и физических свойств поверхности твердой фазы. Для иммунологических анализов, проводимых в жидкостных форматах, поверхность должна поддерживать жидкостный поток и обеспечивать химическое воздействие для иммобилизации захваченного антитела. Более того, для получения хорошего анализа требуется высокая связующая способность анализируемого вещества.

Микрожидкостные устройства капиллярного действия описаны, например, в патентах США 2005/042766, 2006/0285996, 2007/0266777, 2008/0176272, 2009/0208920, 2009/0311805, 2010/0009465 и 2010/0041154, все выданные Amic AB. В микрожидкостных устройствах с капиллярным действием часто желательно изменять свойства поверхностей, которые предназначены для контактирования с жидкостью. Во многих случаях желательно изменять гидрофильность поверхности так, чтобы водный раствор мог более легко протекать через систему капилляров. В частности, важно иметь возможность управлять силами, действующими между поверхностью микрожидкостного устройства и жидкостью, когда поток создается капиллярным действием.

Поверхность микрожидкостного устройства может быть модифицирована несколькими способами. Один способ модификации в известном уровне данной области техники состоит в создании плотного монослоя из малой органической молекулы. Этот слой обеспечивает нужные физические свойства для струйной техники и действует как ручка для последующего присоединения более крупных образований, таких как матричные компоненты и биомолекулы. Подготовка таких поверхностей может проводиться или в газовой фазе, или в жидкой фазе. Получение матриц, расширяющих поверхность, в известном уровне техники включает применение молекул с высокой молекулярной массой, таких как декстран или другие полимерные материалы. Поэтому такие материалы часто прикрепляются к поверхностям посредством жидкофазной химии, например нанесением покрытия окунанием. Связующие с химическим сродством (аффинные), такие как антитела или нуклеиновые кислоты, затем в некоторых случаях осаждаются на поверхность, покрытую матрицей.

В WO 90/01167 описывается пористая несущая система для иммобилизации компонентов иммунологического анализа.

В RU 2102134 описывается иммунносорбент в носителе, которым может быть аэросил, который может быть модифицирован раствором декстрана и который затем оксидируется. Иммунносорбент имеет повышенную удельную емкость.

В статье Jonsson et al. in European Cells and Materials, Vol.14, suppl.3, 2007 (page 64) описывается силанированная пластиковая поверхность, функционирующая совместно с оксидированной декстрановой матрицей. Иммобилизованные антитела расположены в виде пятен на функционирующей поверхности. Описано, что обеспечивается высокоемкостная матрица для иммобилизации антител. Иммобилизированное антитело и матрица (декстран) не связываются между собой до того, как они будут размещены в виде пятен на поверхности.

В статье Jonsson et al. in Lab on a Chip, Vol.8, 2008, pages 1191-1197 описывается способ обработки поверхности тестовых чипов. Поверхность силанизируется погружением в раствор APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан). Оксидированный декстран затем связывается с аминогруппами поверхности. Затем поверхность с оксидированным декстраном, связанным с ней, подвергается этапу оксидирования для получения реактивных альдегидов для проведения реакции с аминами в иммобилизованных антителах. Антитела связываются с оксидированным декстраном после их иммобилизации с поверхностью.

В WO 03/020978 описывается способ изготовления биочипа из гидрогеля, в котором матрица в виде звезды из производного полиэтиленгликоля, имеющего эпоксидную группу на своем конце и гидрофильный полимерный сшивающий агент, вступает в реакцию с пробой или иммобилизованной молекулой с образованием конъюгаты. Конъюгата затем осаждается на биочип.

В документе США 2006/141484 раскрываются подложки, включающие в себя поверхности, подвергнутые реактивному ионному травлению, и специальные связующие агенты, иммобилизованные на ней. Также раскрыты способы получения реактивных ионнотравленных поверхностей.

В статье Jonsson C. et al. in European Cells and Materials vol.14 2007. suppl.3, page 64, раскрываются чипы, которые покрыты APTES, покрыты декстраном, оксидированы, и где антитела располагаются в виде пятен на поверхности.

В WO 2005/054860 раскрыт способ обнаружения биологического маркера в пробе.

При рассмотрении анализов с капиллярным действием в известном уровне техники, где была необходима модификация поверхностей, также было желательно прикреплять иммобилизованные молекулы при диагностическом анализе. Когда иммобилизованная молекула должна прикрепляться к поверхности жидкостного устройства с капиллярным действием, могут быть наложены ограничения по отношению к модификации свойств поверхности, включая гидрофильность. В некоторых случаях модификации свойств поверхности в жидкостном устройстве с капиллярным действием являются необходимыми, чтобы капиллярные силы были достаточными. В известном уровне данной области техники имеется место для усовершенствования жидкостных устройств с капиллярным действием, где как прикрепление иммобилизованных молекул, так и модификация гидрофильности поверхности являются желательными.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является устранение по меньшей мере некоторых недостатков в известном уровне техники и обеспечение усовершенствованного способа и усовершенствованного аналитического устройства с капиллярным действием. В частности, одной задачей изобретения является обеспечение возможности прикрепления иммобилизованных молекул к аналитическому устройству с капиллярным действием, при котором улучшается возможность модифицирования поверхности.

В первом аспекте изобретения обеспечивается способ изготовления аналитического устройства капиллярного действия, включающий в себя этапы:

а) обеспечения подложки, при этом указанная подложка включает в себя по меньшей мере одну зону для добавления пробы, по меньшей мере одну зону для сохранения, по меньшей мере один сток и по меньшей мере дорожку для протекания потока, соединяющую эту по меньшей мере одну зону для добавления пробы, эту по меньшей мере одну зону для сохранения и этот по меньшей мере один сток, причем эта по меньшей мере одна дорожка для протекания потока является открытой и включает в себя выступы, по существу вертикальные по отношению к поверхности указанной подложки и имеющие высоту (H), диаметр (D) и взаимный промежуток (f1, f2), так чтобы достигался латеральный капиллярный поток жидкой пробы;

b) модификации гидрофильности поверхности подложки;

с) смешивания матрицы и иммобилизованной молекулы в растворе для получения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и

d) осаждения раствора на четкую область в указанной по меньшей мере одной зоне для сохранения.

Во втором аспекте обеспечивается аналитическое устройство капиллярного действия, включающее в себя подложку, обеспеченные на указанной подложке по меньшей мере одна зона для добавления пробы, по меньшей мере одна зона для сохранения, по меньшей мере один сток и по меньшей мере одна дорожка для протекания потока, соединяющая эту по меньшей мере одну зону для добавления пробы, эту по меньшей мере одну зону для сохранения и этот по меньшей мере один сток, причем эта по меньшей мере одна дорожка для протекания потока является открытой и включает с себя выступы, по существу вертикальные по отношению к поверхности указанной подложки и имеющие высоту (Н), диаметр (D) и взаимные промежутки (f1, f2), так чтобы достигался латеральный капиллярный поток указанной пробы, при этом аналитическое устройство капиллярного действия изготавливается способом, включающим в себя этапы:

а) модификации гидрофильности поверхности подложки.

b) смешивания матрицы и иммобилизованной молекулы в раствор для обеспечения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и

с) осаждения раствора в четкую область в указанной по меньшей мере одной зоне для сохранения.

Другие аспекты и воплощения изобретения определены в пунктах приведенной формулы изобретения, которая специально включена здесь для ссылки.

Преимущества заключаются в том, что имеется возможность обеспечить модификацию поверхности в аналитическом устройстве капиллярного действия и в то же самое время иммобилизовать захваченную молекулу в четких и хорошо определенных областях на подложке. Обеспечивается большая свобода выбора подходящей поверхностной обработки, чтобы модифицировать гидрофильность поверхности в аналитическом устройстве капиллярного действия. Имеется возможность модифицировать подложку посредством использования химии поверхности и все же осаждать иммобилизованные молекулы в оптимальной матрице на заданных областях.

Преимущества также включают в себя то, что не требуется проведения каких-либо этапов для нанесения покрытий посредством окунания в жидкую фазу, чтобы прикрепить иммобилизованную молекулу, что улучшает воспроизводимость.

Далее матрица наносилась только там, где осаждалась иммобилизованная молекула. Поэтому расходовалось меньше матричного материала, чем если бы покрытие наносилось на всю подложку. Так как матричный материал осаждается только локально, то могут использоваться различные составы матриц для связующих с различным химическим сродством. При разнообразных анализах этот подход дает возможность оптимизировать состав матрицы и условия проведения реакции для различных иммобилизованных молекул путем подгонки, например, связующей способности, плотности или толщины матрицы. Более того, требуются очень малые объемы матричного материала, а это значит, что потенциально могут использоваться сравнительно дорогие матрицы, например, многофункциональные дендронные/дендримерные или сворачивающиеся в круг продукты.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед тем как изобретение будет подробно раскрыто и описано, следует учитывать, что это изобретение не ограничивается конкретными соединениями, конфигурациями, этапами способа, подложками и материалами, раскрытыми здесь, так как такие соединения, конфигурации, этапы способа, подложки и материалы могут несколько изменяться. Также следует учитывать, что применяемая здесь терминология используется для целей описания только конкретных воплощений и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения может быть ограничен только пунктами приложенной формулы изобретения и их эквивалентами.

Следует отметить, что используемая здесь в этом описании и в приведенной формуле изобретения форма единственного числа включает в себя и множественную форму, если в контексте определенно не указывается иначе.

Если ничего другого не определено, то любые термины и научная терминология, используемые здесь, должны иметь значения, которые одинаково понимаются специалистами в этой области, для которых предназначено это изобретение.

Термин «около», используемый здесь в связи с численной величиной во всем описании и в формуле изобретения, означает интервал точности, знакомый и допускаемый специалистами в этой области. Указанным интервалом является ±10%.

Термин «аналит», используемый здесь во всем описании и в формуле изобретения, означает вещество или химический или биологический компонент, одно или больше свойств которого определяются аналитической процедурой. Аналит или сам компонент часто не может быть измерен, но можно измерить измеряемое свойство аналита. Например, можно измерить концентрацию аналита.

Термин «аналитическое устройство» используется во всем описании и в формуле изобретения для обозначения устройства, которое применяется для анализа пробы. Диагностическое устройство является одним примером аналитического устройства.

Термин «капиллярный поток», используемый в формуле изобретения и в описании, обозначает поток, индуцируемый преимущественно капиллярной силой.

Термин «иммобилизованная молекула», используемый во всем описании и в формуле изобретения, обозначает молекулу со способностью связываться с другой химической или биологической сущностью, представляющей интерес. Термин «иммобилизованная молекула» включает в себя молекулы со способностью особого связывания с особыми молекулами.

Термин «оболочка», используемый в формуле изобретения и в описании, обозначает элемент, окружающий часть устройства или все устройство.

Термин «циклоолефиновый полимер» используется в описании и в формуле изобретения для обозначения сополимеров циклического олефина, основанных на различных типах мономеров циклического олефина. Сополимеры, основанные на мономерах циклического олефина и этана, подпадают под этот термин.

Термин «дендример» используется здесь для обозначения неоднократно разветвленных молекул и разветвленных молекул. Дендримеры являются монодисперсными.

Термин «дендритная структура» используется здесь для обозначения разветвленной структуры. Примеры дендритных структур включают, но не только, дендроны, дендримеры, гиперразветвленные и дендронированные полимеры.

Термин «обнаруживаемая группа», используемый в формуле изобретения и в описании, обозначает любое расположение молекул или атомов, которое может быть обнаружено, когда оно присутствует на подложке.

Термин «дорожка для протекания потока», используемый в формуле изобретения и в описании, обозначает область на устройстве, где может происходить протекание жидкости между различными зонами.

Термин «по текучей среде», используемый в формуле изобретения и в описании, обозначает соединение, по которому может транспортироваться текучая среда.

Термин «гидрофильность», используемый в формуле изобретения и в описании в связи с поверхностью, имеет отношение к склонности водного раствора смачивать поверхность. Смачивание является способностью жидкости сохранять контакт с твердой поверхностью, возникающий от межмолекулярного взаимодействия, когда две молекулы сводятся вместе. Степень смачивания определяется балансом сил между адгезионными и когезионными силами. Смачивание и поверхностные силы, управляющие смачиванием, также ответственны за другие связанные эффекты, включая капиллярные эффекты.

Термин «гиперразветвленные», используемый в формуле изобретения и в описании в отношении молекул полимеров, обозначает чрезвычайно разветвленную структуру.

Термин «крышка», используемый в формуле изобретения и в описании, обозначает элемент, покрывающий часть устройства или все устройство.

Термин «матрица» используется в описании и в формуле изобретения для обозначения материала, с которым связываются иммобилизованные молекулы.

Термин «открытый», используемый в формуле изобретения и в описании и применяемый в отношении капиллярного потока, означает, что система открыта, т.е. система не закрыта. Примеры открытой системы включают систему без крышки и в капиллярном контакте с жидкостью пробы. В открытой системе крышка не будет находиться в капиллярном контакте с жидкостью пробы, т.е. крышка не будет участвовать в создании капиллярной силы.

Термин «взаимный промежуток», используемый в формуле изобретения и в описании, означает расстояние между соседними выступами.

Термин «зона для сохранения» используется в описании и в формуле изобретения для обозначения области на аналитическом устройстве капиллярного действия, где молекулы в пробе могут быть связаны с иммобилизованными молекулами.

Термин «проба», используемый в формуле изобретения и в описании, означает смесь или раствор, представленный для анализа.

Термин «зона для добавления пробы», используемый в формуле изобретения и в описании, означает зону, куда добавляется проба.

Термин «силанизировать» используется в описании и в формуле изобретения для обозначения присоединения молекул силана к поверхности.

Термин «сток», используемый в формуле изобретения и в описании, означает область с емкостью для приема жидкой пробы.

Термин «вещество», используемый в формуле изобретения и в описании, означает любой чистый химический или биологический объект или любую смесь или раствор, включающий в себя по меньшей мере один химический или биологический объект.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Изобретение описывается с большой подробностью со ссылкой на чертежи, в которых:

фиг.1 показывает схематическое изображение аналитического устройства. А является зоной для добавления пробы, В является зоной для сохранения и С является стоком со способностью приема жидкой пробы.

Фиг.2 схематично показывает газофазное осаждение с последующим точечным размещением антитела, ковалентно связанного с декстрановой матрицей. В верхней панели показано изменение гидрофильности поверхности подложки. В середине показано осаждение комплекса декстран-антитело. На нижней панели показан осажденный комплекс, включающий в себя декстран, связанный с антителами. Матрица присутствует только там, где осаждено антитело.

Фиг.3 показывает сравнительные зависимости CRP анализов соответственно от концентрации декстрана, нанесенного окунанием, и от концентрации точечно нанесенного декстрана.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Предлагается способ изготовления аналитического устройства капиллярного действия, включающий в себя этапы:

а) обеспечения подложки, при этом указанная подложка включает в себя по меньшей мере одну зону для добавления пробы, по меньшей мере одну зону для сохранения, по меньшей мере один сток и по меньшей мере одну дорожку для протекания потока, соединяющую эту по меньшей мере одну зону для добавления пробы, эту по меньшей мере одну зону для сохранения и этот по меньшей мере один сток, причем эта по меньшей мере одна дорожка для протекания потока является открытой и включает в себя выступы, по существу вертикальные по отношению к поверхности указанной подложки и имеющие высоту (Н), диаметр (D) и взаимный промежуток (f1, f2), так чтобы достигался латеральный капиллярный поток жидкой пробы,

b) изменения гидрофильности поверхности подложки,

с) смешивания матрицы и иммобилизованной молекулы в виде раствора для получения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и

d) осаждения раствора в четко очерченную область в этой по меньшей мере одной зоне для сохранения.

В одном воплощении поверхность аналитического устройства капиллярного действия оксидируется перед проведением указанного осаждения. В одном воплощении этап оксидирования включает в себя плазменную обработку. В одном воплощении поверхность подложки сначала активируется проведением газофазной плазменной реакции и затем к поверхности присоединяется небольшая органическая связующая молекула посредством газофазного осаждения. Газофазное осаждение является предпочтительным, так как оно делает производство менее сложным и повышает воспроизводимость и однородность покрытия. Свободный конец связующей молекулы представляет собой группу (например, аминную), реактивную по отношению к матрице или имеющую химическое сродство с матрицей. Комплекс связующее-матрица таким образом может быть точечно нанесен непосредственно на активированную поверхность.

В одном воплощении по меньшей мере часть поверхности аналитического устройства капиллярного действия силанизируется. В одном воплощении этап силанизирования включает в себя силанизирование в газовой фазе.

В этапе b) гидрофильность поверхности подложки изменяется, что происходит с повышением или с понижением гидрофильности. В одном воплощении гидрофильность повышают, добавляя полярные группы на поверхность. В одном воплощении гидрофильность повышают, добавляя заряженные группы на поверхность.

В одном воплощении всю поверхность подложки изменяют в отношении гидрофильности ее поверхности. В альтернативном воплощении одну сторону подложки изменяют в отношении гидрофильности этой поверхности.

В одном воплощении аналитическое устройство капиллярного действия включает в себя по меньшей мере одну поверхность из циклоолефинового полимера.

В одном воплощении матрица включает в себя полисахарид. В одном воплощении матрица включает в себя агарозу. В одном воплощении матрица включает в себя декстран. В одном воплощении матрица включает в себя оксидированный декстран. В одном воплощении матрица включает в себя полиакриламидный гель. В одном воплощении матрица включает в себя гиперразветвленный полимер. В одном воплощении матрица включает в себя дендрон. В одном воплощении матрица включает в себя дендример. В одном воплощении матрица включает их комбинацию.

В одном воплощении иммобилизованная молекула включает в себя по меньшей мере одну сущность, выбранную из группы, состоящей из антитела, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда, ПНК-зонда, фрагмента антитела, Fab-фрагмента и scFv-фрагмента. В одном воплощении иммобилизованная молекула является антителом. В одном воплощении иммобилизованная молекула включает в себя их комбинацию.

Также предлагается аналитическое устройство капиллярного действия, включающее в себя подложку, при этом на указанной подложке обеспечиваются по меньшей мере одна зона для добавления пробы, по меньшей мере одна зона для сохранения, по меньшей мере один сток и по меньшей мере дорожка для протекания потока, соединяющая эту по меньшей мере одну зону для добавления пробы, эту по меньшей мере одну зону для сохранения и этот по меньшей мере один сток, причем эта по меньшей мере одна дорожка для протекания потока является открытой и включает в себя выступы, по существу вертикальные по отношению к поверхности указанной подложки и имеющие высоту (Н), диаметр (D) и взаимный промежуток (f1, f2), чтобы достигался латеральный капиллярный поток указанной пробы, при этом аналитическое устройство капиллярного действия изготавливается способом, включающим в себя этапы:

а) изменения гидрофильности поверхности подложки,

b) смешивания матрицы и иммобилизованной молекулы в виде раствора для получения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и

с) осаждения раствора в четко очерченную область в указанной по меньшей мере одной зоне для сохранения.

В одном воплощении аналитическое устройство капиллярного действия включает в себя по меньшей мере две различные матрицы и по меньшей мере две различные иммобилизованные молекулы, при этом каждая матрица ковалентно связана с иммобилизованной молекулой специального типа.

Раскрывается, каким образом получают локальную трехмерную матрицу высокой емкости только там, где осаждаются иммобилизованные молекулы. Это достигается конъюгированием связующего с матрицей, увеличивающей поверхность, в гомогенной фазе перед осаждением. Гидрофильность подложки изменяют, и примеры изменений поверхности включают, но не только, адсорбцию органических молекул и реакцию химических групп на поверхности подложки. На фиг.2 верхняя панель показывает одно воплощение, где гидрофильность подложки изменена. На средней панели фиг.2 показано, как иммобилизованные молекулы связываются с матрицей перед осаждением на поверхность. На нижней панели фиг.2 показано, как комплекс, включающий в себя матрицу, связанную с иммобилизованными молекулами, был осажден на поверхность.

Полимерный материал, который является аморфным и проявляет такие свойства как высокая температура стеклования, Tg, оптическая прозрачность, слабая усадка, низкая абсорбция влаги и малое двойное лучепреломление, является пригодным для использования в качестве подложки. Циклоолефиновые полимеры имеют объемные циклические олефиновые звенья, произвольно или альтернативно прикрепленные к полимерной главной цепи, и полимер, таким образом, становится аморфным и проявляет нужные свойства. В одном воплощении аналитическое устройство капиллярного действия включает в себя по меньшей мере одну поверхность циклоолефинового полимера. В одном воплощении аналитическое устройство капиллярного действия делается из циклоолефинового полимера. В одном воплощении аналитическое устройство капиллярного действия формируется инжекционным литьем в циклоолефиновом полимере. В одном воплощении циклоолефиновый полимер изготавливается обменной полимеризацией с размыканием кольца различных циклических мономеров с последующей гидрогенизацией.

В одном воплощении аналитическое устройство включает в себя по меньшей мере две различные матрицы и по меньшей мере две различные иммобилизованные молекулы, при этом каждая матрица ковалентно связана с иммобилизованной молекулой специального типа. Таким образом, возможно провести многоаспектный анализ с различными иммобилизованными молекулами, где каждый тип иммобилизованных молекул имеет свою собственную отдельно подобранную матрицу. Каждая пара из иммобилизованной молекулы и матрицы смешивается и затем локально точечно наносится на четко очерченную область на аналитическом устройстве.

Другие отличительные особенности изобретения и их соответствующие преимущества будут очевидны для специалиста в данной области техники после прочтения описания и примеров.

Следует понимать, что это изобретение не ограничивается показанными здесь определенными воплощениями. Следующие примеры предлагаются для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема изобретения, так как объем настоящего изобретения ограничивается только пунктами приложенной формулы изобретения и их эквивалентами.

ПРИМЕРЫ

Чипы на пластиковой подложке, изготовленной из Zeonor^® (фирма Zeon Corporation, Япония), оксидировались в кислородной плазме. Оксидирование происходило в течение 6 мин в плазменной камере (400 Plasma System) при рабочем давлении 0,26 мбар, мощности 1000 Вт и расходе кислорода 100 мл/мин.

Использовались два различных подхода для силанизирования. Газофазное силанизирование проводилось в камере Solitec BPM-2000 c размером партии три чипа. При каждом осаждении 250 мл APTES (Fluka) наносилось на часовое стекло, помещенное на горячую пластину (80°С) в камере. Осаждение проводилось в течение 15 минут при рабочем давлении 25 мм рт.ст. В результате ограниченного объема производства камер для газофазного осаждения использовался также способ жидкофазного осаждения. В этом протоколе чипы погружались в раствор 3% объемных APTES в 95% этанола (Kemetyl, Швеция) на два часа. Чипы интенсивно промывались в этаноле и в MilliQ-H₂O. В обоих подходах слой силана отверждался в течение ночи при комнатной температуре на воздухе для обеспечения сшивания силана с получением стабильной поверхности, функциональной по отношению к аминам.

Оксидированный декстран (Декстран Т40 (40 kDa), Pharmacosmos, Дания) получали оксидированием в 30 mMa NaIO₄ (Sigma Aldrich) и разбавляли до 2%. Иммобилизованное антитело (αCRP, клон № М701289, Fitzgerald, MA) связывалось с оксидированным декстраном в водном растворе. Раствор содержал 500 мг/мл антитела, 2% оксидированного декстрана, 1% трегалозы (Sigma Aldrich) и 50 mM NaPO₄ (рН 7,5, Sigma Aldrich), буфера. Раствор инкубировался в течение одного часа перед осаждением по меньшей мере на одну зону для сохранения на поверхности чипа. Раствор точечно наносился в линию поперек жидкостного канала чипа. Смесь точечно наносилась при влажных условиях (относительная влажность 75%) посредством наноплоттера № 2,1 (Ge-Sim, Германия) поперек жидкостного канала с получением полосы в α ~0,5×2 мм. Всего осажденный объем составил 16 нл. В контрольных экспериментах весь чип сначала погружался в 2% раствор оксидированного декстрана на 2 часа и тщательно промывался в MilliQ-H₂O. Иммобилизованное антитело осаждалось с использованием того же самого протокола замены декстрана на MilliQ-H₂O.

Конкурентный CRP анализ проводился для определения особенностей работы способа. Пробы для CRP анализа приготавливались разбавлением CRP в пять этапов (250, 50, 10, 2, 0,4 и 0 мг/л) в CRP обедненной сыворотке (Scipack, Великобритания). CRP закупалась у фирмы Scipack. CRP флуоресцентно маркировалась в соответствии с инструкциями поставщика с использованием комплекта для маркирования протеина Alexa Fluor^® 647 Protein Labeling Kit (Invitrogen). Маркированный CRP добавлялся к пробе, в результате чего получали конечную концентрацию 1 мг/л. 37 мкл пробы добавлялись в зону проб чипа, и аналитическое устройство капиллярного действия распределяло пробу поперек по меньшей мере одной зоны для сохранения в зоне капиллярного затекания. Добавленный объем немного больше всего объема, допустимого в чипе. Никакие другие добавления жидкости не требуются перед считыванием сигнала. Типичное время анализа было около 10 минут. Силы сигналов записывались в опытном образце флуоресцентного сканирующего устройства с освещением строк. Для каждого анализа использовался новый чип и все анализы проводились три раза, если не указывалось иначе. Результаты аналитического эксперимента по сравнению локально точечного декстрана и декстрана, нанесенного окунанием, показаны на фиг.3.

Группа изобретений относится к гидрофилизации поверхности и иммобилизации антител на поверхности сополимера циклоолефина. Представлен способ изготовления аналитического устройства капиллярного действия, включающий в себя этапы: а) обеспечения капиллярной подложки, b) изменения гидрофильности поверхности подложки, с) смешивания матрицы и иммобилизованной молекулы в виде раствора для получения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и d) осаждения раствора на четко очерченную область в этой по меньшей мере одной зоне для сохранения. Также описано аналитическое устройство капиллярного действия, изготавливаемое этим способом. Достигается возможность изменения подложки посредством химической обработки поверхности и возможности осаждения иммобилизованных молекул в оптимальной матрице на заданных областях. При этом расходуется меньше матричного материала, и тем самым на одном чипе может быть использовано несколько различных матричных материалов. 2 н. и 31 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ изготовления аналитического устройства капиллярного действия, включающий в себя этапы:
а) обеспечения подложкой, при этом указанная подложка включает в себя по меньшей мере одну зону для добавления пробы, по меньшей мере одну зону для сохранения, по меньшей мере один сток и по меньшей мере одну дорожку для протекания потока, соединяющую указанную по меньшей мере одну зону для добавления пробы, указанную по меньшей мере одну зону для сохранения и указанный по меньшей мере один сток, причем указанная по меньшей мере одна дорожка для протекания потока является открытой и включает в себя выступы, по существу вертикальные по отношению к поверхности указанной подложки и имеющие высоту (Н), диаметр (D) и промежуток между ними (f1, f2) такой, чтобы достигался латеральный капиллярный поток жидкой пробы,
b) изменения гидрофильности поверхности подложки,
с) смешивания матрицы и иммобилизованной молекулы в растворе для получения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и
d) осаждения раствора на четкую область в указанной по меньшей мере одной зоне для сохранения.

2. Способ по п.1, в котором поверхность аналитического устройства капиллярного действия оксидируют перед указанным осаждением.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором этап оксидирования включает в себя обработку плазмой.

4. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором по меньшей мере часть поверхности аналитического устройства капиллярного действия силанизируют.

5. Способ по п.4, в котором этап силанизирования включает в себя силанизирование в газовой фазе.

6. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором аналитическое устройство капиллярного действия включает в себя по меньшей мере одну поверхность циклоолефинового полимера.

7. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя полисахарид.

8. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя агарозу.

9. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя декстран.

10. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя оксидированный декстран.

11. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя полиакриламидовый гель.

12. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя гиперразветвленный полимер.

13. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя дендрон.

14. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором матрица включает в себя дендример.

15. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором иммобилизованная молекула включает в себя по меньшей мере один объект, выбранный из группы, состоящей из антитела, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда, ПНК-зонда, фрагмента антитела, фрагмента Fab и фрагмента scFv.

16. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором иммобилизованной молекулой является антитело.

17. Аналитическое устройство капиллярного действия, включающее в себя подложку, обеспеченные на указанной подложке по меньшей мере одна зона для добавления пробы, по меньшей мере одна зона для сохранения, по меньшей мере один сток и по меньшей мере одна дорожка для протекания потока, соединяющая указанную по меньшей мере одну зону для добавления пробы, указанную по меньшей мере одну зону для сохранения и указанный по меньшей мере один сток, причем указанная по меньшей мере одна дорожка для протекания потока является открытой и включает в себя выступы, по существу вертикальные по отношению к поверхности указанной подложки и имеющие такую высоту (Н), диаметр (D) и взаимные промежутки (f1, f2), чтобы достигался латеральный капилярный поток указанной пробы, отличающееся тем, что оно изготовлено способом, включающим в себя этапы:
а) изменения гидрофильности поверхности подложки,
b) смешивания по меньшей мере одной матрицы и по меньшей мере одной иммобилизованной молекулы в растворе для получения раствора, включающего в себя иммобилизованные молекулы, ковалентно связанные с матрицей, и
с) осаждения раствора на четкую область в указанной по меньшей мере одной зоне для сохранения.

18. Аналитическое устройство капиллярного действия по п.17, в котором поверхность указанного устройства оксидируется перед проведением этапа с).

19. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором этап оксидирования включает в себя обработку в плазме.

20. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором по меньшей мере часть его поверхности силанизируется.

21. Аналитическое устройство капиллярного действия по п.20, в котором этап силанизирования включает в себя силанизирование в газовой фазе.

22. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, при этом оно включает в себя по меньшей мере одну поверхность циклоолефинового полимера.

23. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя полисахарид.

24. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя агарозу.

25. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя декстран.

26. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя оксидированный декстран.

27. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя полиакриламидный гель.

28. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя гиперразветвленный полимер.

29. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя дендрон.

30. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором матрица включает в себя дендример.

31. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором иммобилизованная молекула включает в себя по меньшей мере один объект, выбранный их группы, состоящей из антитела, аптамера, зонда из нуклеиновой кислоты, ДНК-зонда, РНК-зонда, ПНК-зонда, фрагмента антитела, фрагмента Fab и фрагмента scFv.

32. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, в котором иммобилизованная молекула является антителом.

33. Аналитическое устройство капиллярного действия по любому из пп.17 и 18, включающее в себя по меньшей мере две различные матрицы и по меньшей мере две различные иммобилизованные молекулы, причем каждая матрица ковалентно связана с иммобилизованной молекулой соответствующего типа.