МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2015 года по МПК A61K35/10 A61P39/00 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и фармации, в частности к мембранопротекторным средствам, и может быть использовано при патогенетическом лечении и профилактике различных заболеваний для защиты клеточных биомембран от повреждающих воздействий.

Известно использование препаратов, обладающих мембранопротекторными свойствами, при лечении различных заболеваний. Применяется антигипоксантный препарат таурин (Дибикор), который обладает мембранопротекторным свойствами, положительно влияет на фосфолипидный состав мембран клеток, улучшает метаболические процессы в сердце, печени и других органах и тканях (Справочник Видаль, http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/dibicor~27640.htm).

Известно использование рексода в качестве мембранопротекторного препарата при лечении гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области (RU 2006110681 A, МПК A61K 38/43, A61P 43/00, 2007). Препарат рексод представляет собой фермент супероксиддисмутаза, который является эндогенным акцептором свободных кислородных радикалов и предупреждает окислительную модификацию белков, а также связанное с активацией перекисного окисления липидов разрушение биомембран клеток (Справочник Видаль, http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/rexod.htm).

Известен препарат оксиметилэтилпиридина сукцинат (Мексидол), который является ингибитором свободнорадикальных процессов, мембранопротектором, стабилизирует мембранные структуры клеток крови (эритроцитов и тромбоцитов) при гемолизе (Справочник Видаль, http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/mexidol~29603.htm). Известно гепатопротекторное средство для профилактики и коррекции токсических поражений печени, согласно описанию в качестве гепатопротектора используют сукцинат 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина, известный как мексидол. Курсовое применение мексидола оказывает мембранопротекторное действие на клетки печени, токсически пораженной длительным применением туберкулостатиков (Пат. RU 2189817, МПК A61K 31/4412, A61P 43/00, 2002).

Известен препарат альфа-токоферола ацетат (Токоферол), проявляющий антиоксидантное действие, участвующий в пролиферации клеток, тканевом дыхании, других важнейших процессах тканевого метаболизма. Известно, что токоферол препятствует повышенной проницаемости и ломкости капилляров, предупреждает гемолиз эритроцитов (Справочник Видаль, http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/alfa-tocopherol-acetate_10321.htm). Известно использование α-токоферола в ветеринарии для повышения гемолитической устойчивости эритроцитов при термических травмах животных (Бекярова Г.И. и др. Защита α-токоферолом эритроцитов от гемолиза, индуцированного термической травмой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1989, т.107, №4, с.413-415).

Известно использование для повышения устойчивости к гемолизу эритроцитов природного антиоксиданта карнозина (β-аланил-L-гистидин) или его N-ацетильного производного в определенном диапазоне концентраций (патент RU 2162698, МПК A61K 35/18; A61K 38/06, 2001).

Известен препарат галавит (аминодигидрофталазиндион натрия), который является иммуномодулирующим препаратом с противовоспалительным действием, механизм его действия связан со способностью влиять на функционально-метаболическую активность макрофагов (Справочник Видаль, http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/galavit~22901.htm). Использован для повышения устойчивости эритроцитов к гемолизу, индуцированному этанолом, путем введения во взвесь эритроцитов в этаноле лекарственного препарата галавит, растворенного в физиологическом растворе (патент RU 2315605, МПК A61K 35/18, A61P 25/32, 2008).

Выявлена способность изоборнилфенолов защищать мембрану эритроцитов от окислительного стресса, определяемая по степени спонтанного и индуцированного пероксидом водорода гемолиза эритроцитов (Мембранопротекторные свойства изоборнилфенолов - нового класса антиоксидантов / Шевченко О.Г [и др.] // Биологические мембраны: журнал мембранной и клеточной биологии, 2013. - Т.30, №1. - С.40.)

В качестве средства, обладающего гематопротекторным действием использован аскорбат лития, обладающий гематопротекторной активностью в отношении гемолиза эритроцитов под действием алкоголя и отличающийся меньшей токсичностью по сравнению с другими препаратами лития (Пат. RU 2351326 C2, МПК A61K 31/375, A61P 43/00, A61P 39/00, 2009).

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала известных мембранопротекторных средств для защиты биологических мембран при различных повреждающих воздействиях.

Технический результат заключается в использовании препарата, содержащего соли гуминовых кислот, который получен из малотоксичного, дешевого, доступного природного сырья.

Технический результат достигается тем, что в качестве мембранопротекторного средства используют водный раствор натриевых и калиевых солей гуминовых кислот, получаемых из бурого угля леонардита в дозе 10,0 мг/кг.

Условное название предлагаемого мембранопротекторного средства - гумат леонардита. Субстанция-порошок выпускается ООО «Гумат», г. Иркутск, наименование и обозначение продукции: «Гумат» - удобрение на основе гуминовых кислот для агротехнического применения, ТУ 2189-004-41764643-98. Его мембранопротекторные свойства не известны.

Для производства предлагаемого мембранопротекторного средства - водного раствора натриевых и калиевых солей гуминовых кислот леонардита - используют относительно дешевую субстанцию, которую получают промышленным путем из доступного сырья в больших объемах экологически безопасным способом (Перминова И.В. Гуминовые вещества - вызов химикам XXI века / И.В. Перминова // Химия и жизнь, 2008. - №1. - С.50-55).

Предлагаемая субстанция гумат леонардита относится к классу природных соединений, называемых гуминовыми веществами. Гуминовые вещества и соли гуминовых кислот (гуматы) обладают разнонаправленной биологической активностью, в связи с чем в последние годы все шире рассматривается вопрос о возможности их применения в медицине и фармации (Сухих А.С. Перспективы применения гуминовых и гуминоподобных кислот в медицине и фармации / А.С. Сухих, П.В. Кузнецов // Медицина в Кузбассе. - 2009. - №1. - С.10-14.). Особенности химической структуры гуминовых веществ обуславливают их поверхностно-активные свойства (О механизме антидотного действия гуматов по отношению к нефтепродуктам / А.В. Дагуров [и др.] // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - №6 - С.143-146; Стом Д.И. Комбинированное действие нефтепродуктов и «Гумата» на дафний / Д.И. Стом, А.В. Дагуров // Сибирский экологический журнал. - 2004. - №1. - С.35-40), что приводит к способности солюбилизировать и диспергировать гидрофобные органические вещества, увеличивая их растворимость и повышая гидрофильность поверхностей клеток (Возможные механизмы биологического действия гуминовых веществ / Стом Д.И. [и др.] // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - №6. - С.76-79). Данная особенность гуминовых веществ позволяет предположить возможность их влияния на свойства липопротеидов и других компонентов биологических мембран.

Известно применение гуминовых веществ и содержащих их субстратов природных, в различных отраслях медицины. Например, известно использование оксидата торфа в качестве средства для лечения больных с хроническими дерматозами (Пат. RU 2187315 C2, МПК A61K 35/10, A61P 37/04, 2002); использование средства, содержащего гумат натрия из древесно-травяного торфа месторождения «Темное» Томской области в качестве средства, обладающего противомикробным и противогрибковым действием (Пат. RU 2340328 C1, МПК A61K 9/06; A61K 35/10; A61P 31/10, 2008); использование гуминовых кислот и гуматов в качестве биологически активной добавки в косметической промышленности, обладающей антиоксидантной активностью (Пат. RU 2094042 C1, МПК A61K 7/00, A61K 7/40, 1997); для ухода за волосами и кожей головы на основе гуминового концентрата, представляющего собой продукт обработки торфа раствором гидроокиси натрия или калия при активации кислородом воздуха в процессе барботирования и последующей нейтрализации раствором лимонной или уксусной кислоты, содержащего на абсолютно сухое вещество гуминовых кислот не менее 2,8 мас.% (Пат. RU 2394556 C1, МПК A61K 8/97, A61Q 5/12, 2010); способ лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки путем использования лекарственного средства, полученного путем обработки торфа (Пат. RU 2357741 C1, МПК A61K 35/10; A61P 1/04, 2009).

На фиг.1 представлена таблица результатов определения острой токсичности гумата леонардита при однократном пероральном введении; на фиг.2 представлены кривые гемолиза в контрольной пробе и под влиянием гумата леонардита.

Пример 1.

Изучение острой токсичности водного раствора натриевых и калиевых солей гуминовых кислот, получаемых из бурого угля (далее по тексту - гумат леонардита), при пероральном способе введения проведено на 30 белых аутбредных мышах-самцах с массой тела 22,0±5,3 г, разделенных на группы по 10 голов для 3-х исследуемых доз. Гумат леонардита вводили в виде 5,0% водного раствора однократно перорально при помощи металлического желудочного зонда. Использовали дозы, превышающие установленную максимальную терапевтическую (10 мг/кг) в 25 раз (доза 250,0 мг/кг, что соответствует объему 0,1 мл на 20 г массы тела мыши), в 50 раз (доза 500,0 мг/кг, объем 0,2 мл/20 г) и в 100 раз (доза 1000,0 мг/кг, объем 0,4 мл/20 г).

Выявлено, что ни для одной из изученных доз (250,0 мг/кг, 500,0 мг/кг, 1000,0 мг/кг) не было выявлено летальных исходов при наблюдении в течение первых суток и в течение последующих 14 дней. Отсутствовали изменения поведенческих реакций (не выявлено повышенной возбудимости, настороженности, агрессивности, пугливости), не выявлено изменений нервно-мышечной возбудимости (тремора, судорог, атаксии, изменения рефлексов положения, изменения реакций на прикосновение, изменений тонуса скелетных мышц). Не выявлено изменений со стороны вегетативной иннервации, т.к. отсутствовали изменения саливации, взъерошенность шерстных покровов; не выявлено изменения потребления корма и воды (от 1,4 до 3,2 мл на голову в сутки) у подопытных животных (Фиг.1). Ввести перорально дозу больше 1000 мг/кг не представляется технически возможным и нецелесообразно, т.к. изученная максимальная доза 1000 мг/кг позволяет отнести гумат леонардита к низкотоксичным соединениям (вещества умеренно опасные - средняя смертельная доза ЛД₅₀ при введении в желудок находится в интервале 151-5000 мг/кг - III класс опасности) и делает возможным его использование в качестве мембранопротекторного средства.

Таким образом, в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 гумат леонардита является низкотоксичным и может быть отнесен к III классу опасности (вещества умеренно опасные - ЛД₅₀ при введении в желудок 151-5000 мг/кг).

Пример 2.

В качестве мембранопротекторного средства из природного сырья, обеспечивающего защиту биологических мембран при повреждающих воздействиях, использовали водный раствор натриевых и калиевых солей гуминовых кислот, получаемых из бурого угля (гумат леонардита).

Для изучения мембранопротекторных свойств гумата леонардита использовали модифицированный метод регистрации химических (кислотных) эритрограмм по Терскову И.А., Гительзону И.И. (1957), позволяющий оценить структурно-функциональные свойства и проницаемость биологических мембран (Гительзон И.И. Эритрограммы как метод клинического исследования крови / И.И. Гительзон, И.А. Терсков. - Красноярск: Изд-во Сибирского отделения Академии наук СССР, 1959. - 247 с.; Терсков И.А. Метод химических (кислотных) эритрограмм // И.А. Терсков, И.И. Гительзон // Биофизика. - 1957. - Т.11, Вып.2. - С.259-266; Практикум по биофизике / В.Г. Артюхов [и др.] / Под ред. В.Г. Артюхова). - Воронеж: Изд-во ВГУ, 2001. - С.147-161). Накопленные к настоящему времени фактические данные позволяют утверждать, что эритроциты вовлекаются в патологический процесс не только при гематологических заболеваниях, но и претерпевают серьезные изменения структуры и функции при болезнях разного генеза. Выбор мембраны эритроцитов в качестве объекта исследования продиктован тем, что ей присущи общие принципы молекулярной организации плазматических мембран. Поэтому закономерности изменений структуры и функции мембраны эритроцитов с определенной долей коррекции могут быть экстраполированы на иные мембранные системы. Помимо этого простота организации эритроцита дает возможность изучать функциональные свойства плазматической мембраны без помех, накладываемых внутриклеточными мембранными образованиями и органеллами (Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы / Новицкий В.В. [и др.] // Бюллетень сибирской медицины, 2006. - №2. - С.62-69; Постнов Ю.В. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран / Ю.В. Постнов, С.Н. Орлов. - М.: Медицина, 1987. - 192 с.).

Для изучения мембранопротекторных свойств гумата леонардита использовали модель кислотного гемолиза эритроцитов, индуцированного соляной кислотой. Оценивали мембранопротекторные свойства водного раствора гумата леонардита в дозе 10,0 мг/кг при предварительной инкубации с суспензией эритроцитов при температуре 37°C в течение 40 мин. Температура инкубации 37°C выбрана как соответствующая температуре тела человека, длительность инкубации 40 мин выбрана как среднее время, необходимое для поступления введенного лекарственного вещества в плазму крови. Концентрация гумата леонардита, эквивалентная дозе 10,0 мг/кг, подобрана экспериментальным путем на основании результатов серии предварительно проведенных опытов с дозами 1,0, 5,0, 10,0 и 20,0 мг/кг инкубации. Анализ эритрограмм осуществляли графическим и математическим способом. Рассчитывали константу максимальной скорости гемолиза (K_max, отн. ед.) - параметр, характеризующий долю эритроцитов одновременно вступивших в стадию гемолиза; определяли относительное количество гемолизированных клеток (G, %) в различные моменты времени наблюдения, показатели структурного состояния мембран эритроцитов при гемолизе оценивали по расчетным параметрам в соответствии с методикой (Практикум по биофизике / В.Г. Артюхов [и др.] / [Под ред. В.Г. Артюхова]. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 2001. - С.147-161).

Раствор гумата леонардита в дозе 10,0 мг/кг добавляли непосредственно в рабочую суспензию эритроцитов, после чего смесь эритроцитов и гумата леонардита подвергали предварительной инкубации в термостате при температуре 37°C в течение 40 мин. Эксперименты проведены в 3-х сериях опытов, полученные результаты подвергали статистической обработке с вычислением средних значений. В каждой из серий опытов исследования проводили в параллельных пробах, одна из которых являлась контрольной (эритроциты и гемолитик), а вторая опытной (эритроциты, раствор гумата леонардита, гемолитик).

Установлено, что кинетическая кривая процесса гемолиза в контрольной пробе соответствует параметрам стандартной нормы и характеризуется S-образной формой. Смещение S-образной кривой в первые минуты ниже нулевой линии связано со сферуляцией эритроцитов. Затем процесс гемолиза медленно нарастает в своей начальной части и дальнейшая восходящая часть кинетической кривой гемолиза отражает разрушение наименее устойчивых эритроцитов. Затем кривая резко поднимается вверх в интервале от 2 до 5 минут, характеризуя вступление в процесс гемолиза основной массы эритроцитов - регистрируется фаза собственного гемолиза. Период выхода на плато отражает разрушение наиболее стойких эритроцитов. Процесс заканчивается в среднем на 7 минуте с общим процентом гемолизированных клеток (G, %) в среднем 84,99±4,810%. При этом расчетные значения константы максимальной скорости гемолиза (K_max) составили 7,115±0,830 отн. ед. (Фиг.2).

Гумат леонардита в дозе 10,0 мг/кг обеспечил значительное достоверное снижение показателя K_max на 63,4%, что свидетельствует о снижении скорости гемолиза и уменьшении интенсивности процесса разрушения клеток. Гумат леонардита значительно снижал процентное количество разрушившихся клеток в течение периода наблюдения (Фиг.2), так на 270 сек процесса выявлено снижение количества гемолизированных эритроцитов на 29,26%, на 375 сек - соответственно на 32,63% и к моменту окончания процесса гемолиза на 735 сек - снижение общего количества разрушенных клеток на 20,45%, что являлось достоверно меньшим по сравнению с контролем. Анализ формы кривой гемолиза (Фиг.2) наглядно свидетельствует, что на фоне присутствия в среде гумата леонардита динамика процесса кислотного гемолиза эритроцитов изменяется - кривая смещается вправо и становится более пологой, что следует трактовать как повышение времени и степени устойчивости эритроцитов среднестойкой и высокостойкой популяции к повреждающему действию кислотного гемолитика. Указанный эффект свидетельствует о повышении резистентности мембран клеток к действию повреждающего фактора и связан со способностью гумата леонардита вызывать конформационные структурно-функциональные изменения клеточных мембран, обусловленные взаимодействием с липопротеидными компонентами, что приводит к снижению проницаемости для ионов, обеспечивая повышение осмотической резистентности мембраны.

Таким образом, впервые выявлена способность раствора гумата леонардита в дозе 10,0 мг/кг (с инкубацией при температуре 37°C в течение 40 мин) нормализовать проницаемость клеточных мембран, что подтверждается снижением скорости деструкции клеток под действием кислотного гемолитика и уменьшением количества разрушившихся клеток и свидетельствует о наличии мембранопротекторной активности гумата леонардита.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к мембранопротекторному средству. Применение 5% водного раствора натриевых и калиевых солей гуминовых кислот, полученных из бурого угля леонардита, в дозе 10,0 мг/кг в качестве мембранопротекторного средства. Применение вышеописанного состава позволяет расширить арсенал мембранопротекторных средств из малотоксичного, дешевого, доступного природного сырья. 2 ил., 2 пр.

Применение 5% водного раствора натриевых и калиевых солей гуминовых кислот, полученных из бурого угля леонардита, в дозе 10,0 мг/кг в качестве мембранопротекторного средства.